一種黃酒用雙功能酶交聯酶聚集體的制備與應用的制作方法
【專利摘要】一種黃酒用雙功能酶交聯酶聚集體的制備與應用，屬于酶制劑、釀酒添加劑【技術領域】。本發明從普羅威登斯菌（Providencia?sp.）JNB815中提取具有降解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)活性的游離脲酶粗酶液,證明該游離脲酶為具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶活性的雙功能酶。這種雙功能酶利用無載體固定化技術制成交聯酶聚集體，該交聯酶聚集體應用于黃酒中，可同時去除其中的尿素和氨基甲酸乙酯。該交聯酶聚集體對尿素的去除率初次使用可達85.35%，使用6次后尿素去除率仍能達69.30%。對EC的去除率最高可達46.27%，經交聯酶聚集體處理后的黃酒，其揮發性風味物質無明顯變化。
【專利說明】一種黃酒用雙功能酶交聯酶聚集體的制備與應用
【技術領域】
[0001]一種黃酒用雙功能酶的純化及交聯酶聚集體的制備與應用，屬于酶制劑、釀酒添加劑【技術領域】。
【背景技術】
[0002]隨著我國人民生活水平的提高，酒類飲料等發酵食品的消費量日趨上升。在發酵生產酒精飲料的過程中，有許多不需要的副產品，尿素就是其中之一，尿素在酸性條件下、高溫滅菌、蒸餾過程或長時間儲存過程中，容易和乙醇形成氨基甲酸乙酯。
[0003]氨基甲酸乙酯(EC)，是2A類致癌性的物質，微量存在于大部分發酵食品和酒精飲料中。國外許多國家(加拿大、美國、日本、歐盟等)和組織已經對發酵食品和酒精飲料中氨基甲酸乙酯作了限量要求，因此我國對各種不同產品中氨基甲酸乙酯的含量進行檢測勢在必行。
[0004]我國黃酒中90%以上的氨基甲酸乙酯是來源于酒中所含尿素與乙醇的反應:。因此利用脲酶將飲料酒中的尿素及時除去，對于控制酒中氨基甲酸乙酯的生成具有重要意義。采用酒用酸性脲 酶處理煎酒前的黃酒，可除去黃酒中大部分尿素，減少生成EC的可能性，而EC降解酶則能直接有效的分解成品黃酒中已經產生的EC。已有研究報道腸桿菌Enterobacter sp.R-SYB082能產生一種酸性脲酶同功酶,可實現同時去除黃酒中底物尿素及產物EC。
[0005]交聯酶聚集體由荷蘭Delft大學Sheldon小組提出。采用物理方法沉淀酶蛋白，得到酶聚集體，再用交聯劑交聯，制備交聯酶聚集體。其活性和穩定性可與交聯酶晶體技術相媲美，制備過程不需要復雜耗時的結晶、純化步驟，是一種低成本、易操作、高活性和穩定性的新型酶固定化方法。具有對酶純度要求低、無需載體、單位體積活性高、空間效率高等優點。本發明采用(Providencia sp.) JNB815中提取的游離酶制成交聯酶聚集體,能夠同時降解黃酒中的尿素和氨基甲酸乙酯，對黃酒中EC的控制具有雙重效果。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種黃酒用雙功能酶的純化工藝及交聯酶聚集體的制備與應用方法。
[0007]本發明的技術方案，一種天然材料復合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法，將從(Providencia sp.) JNB815菌體細胞破碎液中提取的游離酶，經乙醇分級沉淀、DEAE-FF離子交換層析、Superdex 200凝膠層析進行純化和SDS-PAGE凝膠電泳驗證,初步證明為同一種具有兩種酶活性的雙功能酶。游離酶經乙醇沉淀和京尼平交聯，制成交聯酶聚集體。
[0008]1.其工藝為:
(I)游離脲酶提取:
菌種普羅威登斯菌(Providencia sp.) JNB815 ;該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.8326。[0009]種子培養:種子培養基組成以g/L計:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2P04 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH調pH 7.0，用純水配制；接種量3%，37°C搖床培養 8-12 h，轉速 150 rpm ；
發酵培養:發酵培養基組成以g/L計:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2P042，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0.05，六水硫酸鎳0.05，HCl調ρΗ5.5，用純水配制；接種量5%，37°C搖床培養20-24 h，轉速150 rpm ；
以上菌種經種子培養、發酵培養后，所得發酵液在4°C、8000rpm離心5 min后，棄去上清液，所得菌體用去離子水洗滌兩次，再用pH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，8000r/min離心5min后獲得全細胞；將獲得的全細胞用檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進行超聲波破碎；超聲波破碎條件為300W、15min,破碎時間3s、間隔時間3s,處理量35mL ;破碎液在4°C、1000Orpm離心20min,收集上清液，即得到游離脲酶粗酶液；
(2)游離脲酶的純化:
a、乙醇分級沉淀:將步驟(1)中由{Providenciasp.) JNB815所提取的游離脲酶粗酶液，依次采用質量濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分級沉淀，10000r/min離心20min,所得沉淀復溶于pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液中，測定上清液的酶活并繪制醇沉曲線；
b、DEAE-FF離子交換層析=DEAE-FF層析柱預先以pH6.8、25mmol.L—1磷酸鈉緩沖液平衡完全，將5mL醇沉得到的酶液上樣，用所述磷酸鈉緩沖液配制的O~1.0 mo 1-L-1的NaCl溶液進行梯度洗脫，流速1.0 mL .min-1,收集蛋白峰，測定各峰脲酶和EC降解酶酶活，合并有酶活部分，4°C保存備用；
c、Superdex200凝膠過濾層析:以pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液平衡Superdex200層析柱2~3個柱體積，完全平衡后，將ImL步驟b收集的酶液加到層析柱上，以磷酸鈉緩沖液進行洗脫，收集、合并有酶活部分，超濾濃縮得到純化后的游離脲酶，4°C保存備用；
(3)交聯酶聚體的制備:步驟(2)c所得游離脲酶用質量濃度為10%的乙醇去除雜質后，采用終濃度為60%的乙醇進行沉淀，所得沉淀復溶于5ml含60%乙醇的pH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，加入反應體系總體積的0.3% (m/v)的京尼平(Genipin，分子式C11H14O5),室溫下進行交聯2.5h，混合溶液放置到4°C冰箱中生成交聯酶聚集體CLEAs ；在10000 r.min-1離心20min后棄上清，沉淀用超純水洗滌兩次，離心獲得交聯酶聚集體CLEAs，于4 °C冰箱中貯存。
[0010]2.純化酶的性質:采用10%的乙醇去雜后，收集乙醇終濃度在10%_60%之間的沉淀具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶的活性。DEAE-FF離子交換層析時，在0.35 mol.L'
0.55 mo 1.L-1時各出現一個洗脫峰，洗脫濃度0.35 mo 1.L-1時出現的洗脫峰具有脲酶和EC酶酶活。Superdex 200凝膠層析時，在洗脫體積為7.2 mL左右出現一個大峰，具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶這兩種活性。該洗脫體積對應Superdex 200凝膠柱的外水體積。以上三步純化的過程中，兩種酶的活性峰重疊，分子量一致。由SDS-PAGE電泳可以看出，經過乙醇分級沉淀，分離效果較為明顯，去除了部分雜質；DEAE-FF分離后，去除了兩三種雜蛋白，各條帶分界清晰，能看到若干主要條帶；經由Superdex 200分離最終得到的活性峰純化倍數較高，目的條帶數為2條，推測可能為同一種酶的兩種不同大小的亞基。[0011]游離酶酶活測定方法:采用靛酹藍反應(Berthelot reaction)比色法。
[0012]酶活力定義:在常壓，37°C，pH4.5條件下，每分鐘分解底物尿素或氨基甲酸乙酯產生IMfflol氨為一個酶活力單位。其中，尿素降解酶和EC降解酶活力的測定分別采用尿素和EC為底物。
[0013]交聯酶聚集體酶活測定方法:取0.1 g交聯酶聚集體分別浸入一定體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制的PH4.5的3%的尿素或EC溶液中，在37°C恒溫水浴箱中保溫20min后，10000 r.min—1離心取其上清，余下的測定步驟與游離酶活力測定步驟相同。酶活力定義同游離酶。
[0014]蛋白質含量的測定:采用考馬斯亮藍染色法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白質。
[0015]尿素含量的測定方法:二乙酰一肟法。
[0016]EC含量的測定方法:采用氣相色譜質譜聯用法。
[0017]黃酒中風味物質的測定:采用頂空-固相微萃取-氣質聯用技術。
[0018]3、制備得到的黃酒用雙功能酶交聯酶聚集體的應用:取市售黃酒溶液,裝于反應容器中，加入25 mg.L4交聯酶聚集體,每反應6 h為一批次，以10000 r.mirT1離心20min回收CLEAs，并加入同種新批次黃酒進行處理，重復多次,測定每次所回收的CLEAs質量和黃酒的尿素去除率，反應6批次后CLEAs濕重僅減少0.18 g，沒有明顯變化；說明交聯酶聚集體的穩定性較好，在使用過程中沒有發生酶的泄漏或溶解現象。
[0019]所述交聯酶聚集體對尿素的去除率初次使用可達85.35%,使用6次后尿素去除率仍能達69.30% ;對EC的去除率最高達46.27%，重復使用性較好；經交聯酶聚集體處理后的黃酒，其揮發性風味物質無明顯變化。
[0020]本發明的有益效果:該雙功能酶制成交聯酶聚集體后，能在酒中穩定發揮作用。在黃酒中加入交聯酶聚集體后對尿素的去除率初次使用可達85.35%，使用6次后尿素去除率仍能達69.30%ο對EC的去除率最高可達46.27%，且交聯酶聚集體便于回收，可重復利用多次。本發明可以不改變原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風味，在勾兌，澄清酒的過程中，添加交聯酶聚集體，就可以降低尿素和EC含量。且相對于其他的固定化方法來說，成本較低，是一種較為理想的同時去除酒中尿素和EC的方法。
[0021]生物材料樣品保藏:一株產酸性脲酶和EC降解酶的菌株，分類命名為普羅威登斯菌(Providencia sp.)JNB815,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，其保藏編號為=CGMCC N0.8326，保藏日期為2013年10月12日。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1醇沉曲線。
[0023]圖2脲酶的DEAE-FF離子交換層析圖譜。
[0024]圖3脲酶的Superdex 200凝膠層析圖譜。
[0025]圖4 SDS-PAGE 電泳圖。UMarker ;2、粗酶；3、醇沉；4, DEAE ；5, Superdex 200。
[0026]圖5 CLEAs應用于膜反應器中的工藝流程圖。
[0027]圖6黃酒的揮發性風味物質圖譜。(a圖表示原黃酒，b圖表示交聯酶聚集體處理后的黃酒)。【具體實施方式】
[0028]實施例1
游離酶提取:保藏編號為=CGMCC N0.8326的普羅威登斯菌sp.)JNB815菌種經過種子培養和發酵培養獲得一定量菌體，將發酵液4°C、8000rpm離心5 min后，棄上清，所得菌體用去離子水洗滌兩次，PH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，離心獲得全細胞；將獲得的全細胞用pH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進行超聲波破碎，超聲波破碎條件為300 W、15min，破碎時間3 S、間隔時間3 s,處理量35 mL ;破碎液在4°C、10000 rpm離心20 min,收集上清液，即為游離脲酶粗酶液；
'miPl'ovichnciei sp.) JNB815所提取的游離脲酶，經乙醇分級沉淀、DEAE-FF離子交換層析、Superdex 200凝膠過濾層析。尿酶和氨基甲酸乙酯降解酶的醇沉分級范圍相同，活性峰重疊。初步證明具有這兩種活性的酶為同一種雙功能酶。具體步驟為:
乙醇分級沉淀:將由{Providencia sp.) JNB815所提取的游離脲酶，依次采用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分級沉淀，離心，所得沉淀復溶于pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液中,測定上清液的酶活并繪制醇沉曲線，曲線如圖1所示。
[0029]DEAE-FF離子交換層析:DEAE_FF層析柱預先以25 mmol.L—1、pH6.8磷酸鈉緩沖液平衡完全，將5 mL醇沉得到的酶液上樣，用O~1.0 mol.L-1的NaCl (磷酸鈉平衡緩沖液配制)溶液進行梯度洗脫，流速1.0 mL 收集蛋白峰，測定各峰酶活，合并有酶活部分，4°C保存備用，脲酶的DEAE-FF離子交換層析圖譜如圖2所示。
[0030]Superdex 200凝膠過濾層析:以25 mmol.L-1磷酸鈉緩沖液(ρΗ6.8)平衡Superdex 200層析柱2~3個柱體積，完全平衡后，將I mL DEAE-FF離子交換層析步驟收集的酶液加到層析柱上，以磷酸鈉平衡緩沖液進行洗脫，收集、合并有酶活部分，超濾濃縮后4°C保存備用。脲酶的Superdex 200凝膠層析圖譜如圖3所示。{Providencia sp.)JNB815產酶的純化結果如表1所示。
[0031]表1 Providencia sp.JNB815 產酶的純化結果
【權利要求】
1.一種黃酒用雙功能酶交聯酶聚集體的制備方法，其特征在于步驟為: (1)游離脲酶提取: 菌種普羅威登斯菌(jDroriofeflcia sp.) JNB815 ;該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.8326 ； 種子培養:種子培養基組成以g/L計:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2P042，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH調pH 7.0，用純水配制；接種量3%，37°C搖床培養8_12h,轉速 150 rpm ； 發酵培養:發酵培養基組成以g/L計:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO42，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0.05，六水硫酸鎳0.05，HCl調ρΗ5.5，用純水配制；接種量5%，37°C搖床培養20-24 h，轉速150 rpm ； 以上菌種經種子培養、發酵培養后，所得發酵液在4°C、8000rpm離心5 min后，棄去上清液，所得菌體用去離子水洗滌兩次，再用PH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，8000r/min離心5min后獲得全細胞；將獲得的全細胞用檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進行超聲波破碎；超聲波破碎條件為300W、15min,破碎時間3s、間隔時間3s,處理量35mL ;破碎液在4°C、1000Orpm離心20min,收集上清液，即得到游離脲酶粗酶液； (2)游離脲酶的純化: a、乙醇分級沉淀:將步驟(1)中由{Providenciasp.) JNB815所提取的游離脲酶粗酶液，依次采用質量濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分級沉淀，10000r/min離心20min,所得沉淀復溶于pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液中，測定上清液的酶活并繪制醇沉曲線； b、DEAE-FF離子交換層析=DEAE-FF層析柱預先以pH6.8、25mmol.L—1磷酸鈉緩沖液平衡完全，將5mL醇沉得到的酶液上樣，用所述磷酸鈉緩沖液配制的O~1.0 mo 1-L-1的NaCl溶液進行梯度洗脫，流速1.0 mL IirT1,收集蛋白峰，測定各峰脲酶和EC降解酶酶活，合并有酶活部分，4°C保存備用； c、Superdex200凝膠過濾層析:以pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液平衡Superdex200層析柱2~3個柱體積，完全平衡后，將ImL步驟b收集的酶液加到層析柱上，以磷酸鈉緩沖液進行洗脫，收集、合并有酶活部分，超濾濃縮得到純化后的游離脲酶，4°C保存備用； (3)交聯酶聚集體的制備:步驟(2)c所得游離脲酶用質量濃度為10%的乙醇去除雜質后，采用終濃度為60%的乙醇進行沉淀，所得沉淀復溶于5mL含60%乙醇的pH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，加入反應體系總體積的0.3%，m/v,的京尼平，室溫下進行交聯2.5h，混合溶液放置到4°C冰箱中生成交聯酶聚集體CLEAs ;在10000 r ^mirT1離心20min后棄上清，沉淀用超純水洗滌兩次，離心獲得交聯酶聚集體CLEAs，于4°C冰箱中貯存。
2.根據權利要求1所述黃酒用雙功能酶交聯酶聚集體的制備方法，其特征在于游離脲酶的純化: a、乙醇分級沉淀:乙醇終濃度在10%-60%之間時，收集的沉淀具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶的活性； b、DEAE-FF離子交換層析時，在0.35 mo I.L-1\θ.55 mo I.L-1時各出現一個洗脫峰，洗脫濃度0.35 mo I.L-1時出現的洗脫峰具有脲酶和EC酶酶活；C>Superdex 200凝膠層析時,在洗脫體積為7.2 mL時出現一個大峰,具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶這兩種活性。
3.用權利要求1所述方法制備得到的黃酒用雙功能酶交聯酶聚集體的應用，其特征在于:取市售黃酒溶液，裝于反應容器中，加入25 mg 交聯酶聚集體，每反應6 h為一批次，以10000 r *min_1離心20 min回收CLEAs，并加入同種新批次黃酒進行處理,重復多次，測定每次所回收的CLEAs質量和黃酒的尿素去除率，反應6批次后CLEAs濕重僅減少0.18g，沒有明顯變化；說明交聯酶聚集體的穩定性較好，在使用過程中沒有發生酶的泄漏或溶解現象。
4.根據權利要求3所述黃酒用雙功能酶交聯酶聚集體的應用，其特征在于:所述交聯酶聚集體對尿素的去除率初次使用可達85.35%，使用6次后尿素去除率仍能達69.30% ;對EC的去除率最高達46.27%，重復使用性較好；經交聯酶聚集體處理后的黃酒，其揮發性風味物質無明 顯變化。
【文檔編號】C12H1/15GK103923900SQ201410146269
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】田亞平, 查小紅, 楊廣明 申請人:江南大學