多形漢遜酵母重組菌株及其在龍膽苦苷生物合成中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在龍膽苦苷生物合成中的應用，主要是運用低能離子注入介導秦艽基因組總DNA轉化酵母菌的方法獲得一株產龍膽苦苷的重組酵母菌，其為多形漢遜酵母(Hansenula?polymorpha)CGMCC.No.8998，本發明實現了利用重組酵母菌進行生物發酵生產龍膽苦苷的技術突破，為解決龍膽苦苷來源短缺、保護我國龍膽科植物資源及其可持續發展提供新途徑。
【專利說明】多形漢遜酵母重組菌株及其在龍膽苦苷生物合成中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于通過遺傳轉化獲得產龍膽苦苷的轉基因酵母重組菌領域，具體涉及利用離子注入介導秦艽總DNA在酵母菌中遺傳轉化獲得的多形漢遜酵母重組菌株及其在龍膽苦苷生物合成中的應用。
【背景技術】
[0002]龍膽苦苷(Gentiopicroside)，別名龍膽苦甙，分子式為C16H2tlO9,分子量為356.11,為裂環環烯職苷類化合物，屬于倍半職類物質，是藥用植物秦究(Gentianamacrophylla)的主要藥用成分。近年來的研究表明，龍膽苦苷具有鎮痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽、健胃抗潰瘍等作用，如作為國家一類新藥注射用秦龍苦素，為秦艽提取物龍膽苦苷的凍干粉針，用于黃疸型病毒性肝炎治療。
[0003]龍膽苦苷多來源于龍膽科多年生草本植物秦艽。秦艽為龍膽科、龍膽屬多年生草本植物，是我國重要的中藥材之一。秦艽生長在高海拔地區，生長周期長，易受季節變化影響。近年來因秦艽具有很高的藥用價值，過渡采挖使野生秦艽資源出現嚴重匱乏，加上秦艽人工栽培存活率低的問題，導致龍膽苦苷的供應量難以滿足臨床需求。因此，迫切需要尋求及擴大龍膽苦苷新藥源途 經以滿足臨床上對其日益增長的需求。
[0004]目前，Tiwari等運用發根農桿菌誘導出秦艽毛狀根，但其不能生產龍膽苦苷。此外，齊香君等運用藥源植物秦艽細胞生產龍膽苦苷，其龍膽苦苷產量僅為0.242mg/g，而且其發酵周期長。上述研究目前都未能獲得理想的結果。在秦艽資源開發研究方面，國外尚未報道。因此，亟需尋求新的研究思路解決龍膽苦苷來源短缺問題。
[0005]近年來，分離天然產物生物合成基因，并借助酵母細胞工廠大量而經濟地生物合成植物天然產物成為有效途徑之一。然而，植物萜類化合物，如單萜、倍半萜以及雙萜等高級萜類不僅擁有特異的合成途徑，且具有獨特的酶促反應機制。同時，許多已知代謝途徑不能作為參考，植物次生代謝網絡多且復雜，加上部分關鍵代謝酶基因處于低表達水平，很難從蛋白分子水平獲得表達。
[0006]近年來，在植物天然產物生物合成基因信息及生物合成途徑尚未闡明前，LU等通過Ar+和N+注入介導麻黃基因組DNA轉化酵母，獲得遺傳穩定酵母工程菌，麻黃堿和偽麻黃堿產量分別為18.85mg/L和4.llmg/L。Jin等利用低能離子注入介導甘草基因組DNA轉化酵母，獲得了遺傳穩定的酵母工程菌，其五環三萜苷類物質甘草酸的最高產量達114.49mg/Lo同時，由于酵母自身存在甲輕戍酸(MevalonateJflMVA)途徑,可自我合成職類物質前體異戊二烯焦磷酸，這為利用微生物合成萜類化合物龍膽苦苷提供了一個很好的基礎平臺。目前，國外尚未見利用低能離子注入介導藥用植物基因組DNA轉化酵母技術構建產藥用有效成分的重組菌的研究報道。具體在遺傳改造酵母生物合成龍膽苦苷的方面，國內外尚未見報道。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在龍膽苦苷生物合成中的應用。
[0008]為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案。
[0009]一種多形漢遜酵母重組菌株，該重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)，所述重組菌株保藏于CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.8998。
[0010]所述重組菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0011]I)運用低能離子注入介導秦艽基因組DNA轉化多形漢遜酵母出發菌株；
[0012]2)重組菌株初篩:挑取在YPD固體培養基中培養的經過步驟I)處理后的出發菌株的菌落進行YPD液體發酵，離心取發酵液，采用Molish反應和Fehling試驗對重組菌株的發酵液進行分析，初步定性分析發酵液中是否存在龍膽苦苷；
[0013]3)將經過定性方法初篩得到的重組菌株進一步進行YPD液體發酵培養，利用薄層層析和高效液相色譜分析發酵所得發酵液，從而對重組菌株進一步篩選鑒定。
[0014]所述出發菌株為多形漢遜酵母H.polymorpha DL-1 (來源為ATCCN0.26012)。
[0015]所述低能離子注入的條件為:注入離子為N+，注入劑量為1.5 X IO16~ 2.5X1016ions/cm2，注入能量為15~25KeV，脈沖時間為5~IOs,間隔時間為5~10s，真空度為 1.5 ~2.0XlO-3Pa0
[0016]所述重組菌株的發酵方法包括以下步驟:于37°C、轉速為300r/min條件下培養60 ~96h0
[0017]所述發酵采用的培養基為YPD液體培養基，發酵過程中流加0.5%的葡萄糖水溶液，流速為12.5mL/h。
[0018]上述多形漢遜酵母重組菌株(CGMCC N0.8998)在龍膽苦苷生物合成中的應用。
[0019]本發明的有益效果體現在:
[0020]本發明通過低能離子注入技術介導秦艽基因組DNA在酵母出發菌株中隨機轉化，獲得一株多形漢遜酵母重組菌株，該重組菌株能夠有效地生物合成龍膽苦苷，具有易于高度密度發酵、產物易于分離提取的優點，為龍膽苦苷的工業化生產提供新途徑，為解決龍膽苦苷藥源短缺問題提供新思路、新方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為發酵產物TLC分析圖譜，其中，1:龍膽苦苷標準品，2:重組菌株發酵液樣品，3:陰性對照酵母菌株(低能離子注入后用不含秦艽基因組DNA的TE緩沖液溫育、洗脫)發酵液樣品。
[0022]圖2為發酵產物HPLC圖譜，其中，A:龍膽苦苷標準品，B:重組菌株發酵液樣品，C:陰性對照酵母菌株發酵液樣品。
[0023]圖3為重組菌株的發酵圖譜。
[0024]圖4為重組菌株的遺傳穩定性圖譜。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖和實施例對本發明作詳細說明。
[0026]本發明以H.polymorpha DL-1為出發菌株(來源為ATCC N0.26012)，利用低能離子輻照注入介導秦艽基因組DNA隨機轉化酵母，通過定性、定量篩選獲得產龍膽苦苷的重組酵母菌株，并對其進行遺傳穩定性和相應的發酵試驗。
[0027](一 )培養基
[0028]YPD液體培養基的組成為:葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L, pH為 6.5 ;
[0029]Yro固體培養基的組成為:葡萄糖20.(^/1，蛋白胨20.(^/1，酵母膏10.(^/1，瓊脂20g/L，pHS6.5。
[0030](二)篩選所依據的方法
[0031](I)環烯醚萜苷類物質檢測
[0032]Molish反應:取800mL發酵液，100°C下濃縮發酵液至5mL(即得濃縮發酵液)后，加入IOmL甲醇萃取,過濾萃取液。取濾液3mL,加入兩滴Molish試劑(10% α-萘酹乙醇溶液)，小心加入約ImL濃硫酸(18.4mol/L)，切勿搖勻，觀察兩層液面交界處的顏色變化，出現紫環為陽性。
[0033]Fehling試驗:取上述濃縮發酵液3mL加入到3mL Fehling試劑(由甲和乙等體積組成，甲是0.lg/mL的氫氧化鈉水溶液，乙是0.05g/mL的硫酸銅水溶液)中。搖勻后,置沸水浴中煮沸5min，取出冷卻，觀察沉淀和顏色變化，出現磚紅色沉淀的為陽性。
[0034](2)薄層層析(TLC)定性檢測:分別將5 μ L上述濃縮發酵液和龍膽苦苷標準品在GF254硅膠薄層板上點樣，在展開劑氯仿-甲醇(V/V，20:80)中展開，結束后在紫外燈下觀察，記錄斑點，并計算其Rf值。
[0035](3)HPLC定量檢測:取800mL發酵液，在100°C下濃縮至5mL(即得濃縮發酵液)后，加入IOmL甲醇萃取，過濾萃取液，濾液以0.45 μ m微孔濾膜過濾后用于HPLC法測定龍膽苦苷的含量；HPLC色譜條件為:色譜柱:化學鍵合型十八烷基柱(SciC18色譜柱)；Pump:K-1001 ；Detecter:K_1501 ;流動相:甲醇-水(V/V,30:70);柱溫:25°C。
[0036](三)重組以及篩選流程
[0037]I)提取秦艽基因組DNA:取適量陜西道地產秦艽新鮮葉片5g，用液氮迅速研磨至粉末后，將其裝入50mL的離心管中；接著迅速將3mL預熱的CTAB提取液(2% CTAB, 1.4MNaCl,0.02M EDTA，0.1M Tris-HCl,0.2%巰基乙醇，pH = 8.0)加入至所述離心管中；之后放入65°C水浴鍋中，保溫60min后(期間輕搖5次)，加入4mL氯仿-異戊醇(24:1)，輕搖混勻至乳白色后，置于4°C、I 1000rpm離心15min ;取上清液并加入0.6倍體積的異丙醇,搖勻；后置于4°C、I 1000rpm離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇漂洗2次，放置于超凈工作臺中吹干得秦艽基因組DNA。用ImL Tris-EDTA (pH8.0)緩沖液溶解秦艽基因組DNA，并用紫外分光光度計測其濃度，最后放入4°C冰箱保存。
[0038]2)低能N+離子注入菌膜:將本實驗室保藏的出發菌株(H.polymorpha DL-1)于370C、YPD固體培養基上劃線活化24h后，挑取新鮮菌落接種到YPD液體培養基中，于37°C、110r/min轉速條件下培養16h得菌液A，取適量菌液A用無菌水稀釋至濃度為1.0XlO7CFU/mL得菌體稀釋液，取0.1mL菌體稀釋液均勻涂布于直徑90mm的無菌平皿中央,無菌風吹干制成菌膜，然后置于離子束注入機的真空靶室中進行低能N+注入，注入能量為20Kev，注入劑量為2.0X 1016ions/cm2，脈沖時間為5s，間隔時間為10s，真空度為1.5X 10_3Pa。
[0039]3)固體培養:經過步驟2)后，用2mL含有秦艽基因組DNA的Tris-EDTA緩沖液(pH8.0)浸泡經低能N+離子注入后的菌膜，于37°C溫育2h后，用移液器進行洗脫，將菌全部洗脫下來得菌液B，分別取0.1mL菌液B均勻涂布于YPD固體培養基后于37°C培養72h。
[0040]4)重組菌株初篩:經過步驟3)后，將YPD固體培養基上生長的菌落轉接到試管中進行液體培養(37°C、110rpm/min培養96h),于10000r/min離心10min收集發酵液進行濃縮，然后再進行檢測分析。
[0041]龍膽苦苷屬于環烯醚職苷類,該類物質的檢測主要采用Molish反應和Fehling試驗。首先利用Molish反應對重組菌株發酵液進行分析，觀察樣品液的反應中是否出現紫色環(陽性結果為出現紫色環)。然后，再利用Fehling試驗對上述出現紫色環的重組菌的發酵液進一步分析，觀察樣品液中是否有磚紅色沉淀生成(陽性結果為出現磚紅色沉淀)。上述兩種陽性反應結果表明重組菌株的發酵液中存在糖苷類化合物，可作為后續分析的初篩重組菌株。
[0042]5)定性、定量檢測:將初篩重組菌株接種于含IOmL YTO液體培養基的試管中，并于37°C、110r/min下培養12h得種子培養液，以體積為5%的接種量將種子培養液接種于含IOOmL YPD液體培養基的250mL三角瓶中，然后于110r/min、37°C下培養90h，然后于10000r/min離心10min,離心得到 的菌體用無菌蒸懼水沖洗兩次后于85°C烘干至恒重進行稱重分析，離心得到的上清液用于產物定性、定量檢測，主要采用薄層層析(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。
[0043]TLC定性鑒定:分別用毛細管將5 μ L的初篩重組菌株濃縮發酵液、陰性對照酵母菌株的濃縮發酵液及龍膽苦苷標準品點于薄層板上，然后將薄層板置于展開劑氯仿-甲醇(V/V, 20:80)中進行展開。結果如圖1所示，初篩重組菌株濃縮發酵液在與龍膽苦苷標準品相對應的位置上出現同樣斑點，其Rf值為0.3，與龍膽苦苷標準品Rf值(0.29)非常接近，而陰性對照酵母菌株的濃縮發酵液在該處未出現斑點，表明初篩重組菌株發酵過程有新物質合成。
[0044]HPLC法定量鑒定:分別將初篩重組菌株濃縮發酵液、陰性對照酵母菌株的濃縮發酵液及龍膽苦苷標準品進行HPLC分析，結果如圖2所示，保留時間為12.377min處初篩重組菌株濃縮發酵液中出峰(圖2B)，與龍膽苦苷標準品出峰(圖2A)的保留時間12.370基本一致，而陰性對照酵母菌株的濃縮發酵液在該處未出峰，表明初篩重組菌株具有生物合成龍膽苦苷的能力。通過上述步驟，最終本發明篩選得到了一株重組菌株DL-49，本發明篩選獲得的重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha),該重組菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏日期為2014年4月3日；保藏編號為CGMCC N0.8998。
[0045](四)重組菌株的發酵及龍膽苦苷分離提取
[0046]重組菌株(CGMCC N0.8998)的發酵工藝:采用15L全自動發酵罐對篩選出來的重組菌株(CGMCC N0.8998)進行高密度發酵生產龍膽苦苷，將重組菌株經種子培養后(參照上文種子培養液的獲得)以5% (體積比)的接種量接種于YPD液體培養基中，于37V、轉速為300r/min下進行連續發酵96h，pH為6.5，發酵中同時流加0.5% (w/v，每IOOmL水中含0.5g葡萄糖)的葡萄糖水溶液，流速為12.5mL/h，發酵48h后，每隔12h取發酵液500mL，測定酵母細胞生物量和龍膽苦苷。結果如圖3所示。可知，菌體濃度隨著培養時間的增加不斷升高，培養72h后細胞生物量增加到42.35g/L ;龍膽苦苷從60h開始大量出現，并隨著時間延長，產量稍有增長，72h時產量達到最高，達7.53mg/L。
[0047]龍膽苦苷分離純化:依據上述發酵工藝，將重組菌株(CGMCC N0.8998)進行高密度發酵96h，于48h、60h、72h、84h和96h分別取500mL發酵液進行分離純化檢測分析。具體為將發酵液500mL經過12000r/min離心10min后，將上清液于80°C濃縮至10mL，采用D301型大孔樹脂對龍膽苦苷進行靜態吸附富集8h，后用20mL體積分數8 %的乙醇水溶液對龍膽苦苷進行洗脫，收集洗脫液于60°C濃縮至ImL后進行HPLC檢測分析，可得到純度為84.35%的產物，龍膽苦苷的回收率為73.15%。
[0048](五)重組菌株的遺傳穩定性
[0049]將重組菌株(CGMCC N0.8998)活化后接種于含200mL YPD液體培養基的三角瓶中進行培養(37°C、110r/min)，傳代培養8代測定重組菌株的遺傳穩定性。結果如圖4所示，表明傳代培養過程中重組菌株發酵液中龍膽苦苷含量基本不變，傳代培養8代后龍膽苦苷含量為2.106mg/L,相比于第一代重組菌株的龍膽苦苷含量(2.235mg/L)降低了 6.1%,說明該重組菌株遺傳穩定。
[0050]總之，本發明利用低能離子注入技術轉化酵母構建產龍膽苦苷重組菌株，并篩選獲得了一株可用于發酵生產龍膽苦苷的重組菌株(CGMCC N0.8998)。此外，與植物提取法相t匕，微生物發酵生物合成龍 膽苦苷具有生產成本低、生產周期短、不受自然氣候影響、節約土地、胞外產物分離提取簡單等優點，這為解決龍膽苦苷來源短缺問題、保護龍膽科植物資源并實現其可持續發展提供了新途徑。本發明首次采用低能離子注入技術介導秦艽總DNA在酵母菌中隨機轉化以篩選產龍膽苦苷重組菌株，為利用微生物生產龍膽苦苷提供實踐依據。
【權利要求】
1.一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:該重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha),所述重組菌株保藏于CGMCC,保藏編號為CGMCC N0.8998。
2.根據權利要求1所述一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:所述重組菌株的發酵方法包括以下步驟:于37°C、轉速為300r/min條件下培養60~96h。
3.根據權利要求2所述一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:所述發酵采用的培養基為YPD液體培養基，發酵過程中流加0.5%的葡萄糖水溶液，流速為12.5mL/h。
4.一種如權利要求1所述多形漢遜酵母重組菌株在龍膽苦苷生物合成中的應用。
【文檔編號】C12P19/60GK103966112SQ201410174666
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】錢衛東, 付云芳, 蔡長龍, 毛培宏, 王婷, 趙德志, 施春陽 申請人:陜西科技大學