多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應用，運用低能離子注入介導紅豆杉基因組總DNA轉化酵母獲得一株產紫杉醇的多形漢遜酵母(Hansenula?polymorpha)重組菌株CGMCC?No.8999，本發明實現了利用重組酵母菌進行生物發酵生產紫杉醇的技術突破，為解決紫杉醇來源短缺、保護我國紅豆杉植物資源及其可持續發展提供新途徑。
【專利說明】多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于通過遺傳轉化獲得產紫杉醇的轉基因酵母重組菌領域，具體涉及利用低能離子注入介導紅豆杉基因組總DNA在酵母菌中遺傳轉化獲得的多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應用。
【背景技術】
[0002]紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是當今世界公認的廣譜、療效確切的天然抗癌藥物，其分子結構是由漿果赤霉素III (baccatinIII)以及連接在13位碳上的苯丙氨酸衍生物構成的三環二 萜類生物堿。紫杉醇是目前人們所了解的唯一一種可以促進微管聚合和穩定已聚合微管的藥物，細胞接觸紫杉醇后在細胞內積累大量的微管，而這些微管的積累干擾了細胞的各種功能，特別是使細胞分裂停止于有絲分裂期，從而阻斷了細胞的正常分裂。1992年，美國食品藥品管理局(FDA)正式批準紫杉醇上市，用于治療卵巢癌和乳腺癌。此后，臨床上相繼發現紫杉醇對結腸癌、直腸癌、膀胱癌、轉移性乳腺癌，以及對肺癌、惡性黑色素癌和肉瘤等均表現出一定療效，紫杉醇已成為國際抗腫瘤的主流藥物之一。
[0003]目前，紫杉醇主要是通過從紅豆杉原料中提取紫杉醇或其中間體的方法獲得。值得注意的是，紅豆杉成樹一般需要100-250年，加之紫杉醇在樹皮中的含量較低(平均含量約0.015% )，生產Ikg紫杉醇大概需要7000kg，相當于2000-2500棵成年紅豆杉。由于臨床上對紫杉醇的需求量日益增加，導致對紅豆杉過度開發，致使天然紅豆杉面臨匱乏與枯竭，加之引種馴化困難、人工栽培周期長、活性組分產量低，使得傳統的從紅豆杉植株中直接提取紫杉醇的方式受到極大的限制和挑戰。
[0004]因此，紅豆杉屬植物的資源問題已經引起各國環保專家和政府的高度重視，我國已將紅豆杉列為一級珍稀瀕危，相當于“植物中的大熊貓”，嚴禁砍伐。另外，紫杉醇的分子結構十分復雜，分子中有眾多的功能基團和立體化學特征。盡管早在1994年紫杉醇的全化學合成就獲得了成功，但是由于其反應步驟多，需大量使用手性試劑，反應條件極難控制，制備成本十分昂貴，難以適合大規模工業生產。
[0005]現代微生物發酵技術因其在尋求紫杉醇新型藥源方面具有獨特優勢，逐漸成為當今國際生藥學界的研究熱點之一。然而，目前紫杉醇生物合成途徑及其相關基因尚未闡明清楚。
[0006]近年來，在植物天然產物生物合成基因信息及生物合成途徑尚未闡明前，Lu等通過Ar+和N+注入介導麻黃基因組DNA轉化酵母，獲得遺傳穩定酵母工程菌，麻黃堿和偽麻黃堿產量分別為18.85mg/L和4.llmg/L。Jin等利用低能離子注入介導甘草基因組DNA轉化酵母，獲得了遺傳穩定的酵母工程菌，其五環三萜苷類物質甘草酸的最高產量達114.49mg/L0
[0007]目前，國外尚未見利用低能離子注入介導藥用植物基因組DNA轉化酵母技術構建產藥用有效成分的重組菌的研究報道，在遺傳改造酵母生物合成紫杉醇方面國內外都尚未見報道。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應用。
[0009]為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案。
[0010]一種多形漢遜酵母重組菌株，該重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)，所述重組菌株保藏于CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.8999。
[0011]所述重組菌株的篩選方法包括以下步驟:
[0012]I)運用低能離子注入介導紅豆杉基因組DNA轉化多形漢遜酵母出發菌株；
[0013]2)重組菌株初篩:將經過步驟I)處理后的出發菌株涂布于YPD固體培養基進行培養，挑取新鮮菌落進行液體培養發酵后，采用香草醛反應和FeCl3試驗對重組菌株的發酵液進行分析，鑒定發酵液中是否存在紫杉醇；
[0014]3)將經過定性方法初篩得到的重組菌株進一步發酵培養，利用薄層層析和高效液相色譜對其發酵液進行分析，進一步篩選鑒定重組菌株。
[0015]所述出發菌株為多形漢遜酵母H.polymorpha DL-1 (來源為ATCCN0.26012)。 [0016]所述低能離子注入采用低能N+作為注入離子，最佳注入劑量為1.5X IO16~2.5X 1016ions/cm2，最佳注入能量為15~25KeV，脈沖時間為5~IOs,間隔時間為5~IOs,真空度為1.5~2.0XlO-3Pa0
[0017]所述重組菌株的發酵方法包括以下步驟:于37°C、轉速為200r/min下培養72~120h。
[0018]所述發酵采用的培養基為液體無機培養基，發酵中同時流加0.5%的甘油水溶液，流速為12.5mL/h。
[0019]上述多形漢遜酵母重組菌株(CGMCC N0.8999)在紫杉醇生物合成中的應用。
[0020]本發明的有益效果體現在:
[0021]本發明通過低能離子注入技術介導紅豆杉基因組DNA在出發菌株中隨機轉化，獲得一株多形漢遜酵母重組菌株，該重組菌株能夠有效地生物合成紫杉醇，具有易于高密度發酵、產物易于分離提取的優點，為紫杉醇的工業化生產提供了新途徑，為解決紫杉醇藥源短缺問題提供了新思路、新方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為發酵產物TLC分析圖譜，其中，1:陰性對照酵母菌株(低能離子注入后用不含紅豆杉基因組DNA的TE緩沖液溫育、洗脫)發酵液樣品，2:重組菌株發酵液樣品，3:紫杉醇標準品。
[0023]圖2為發酵產物HPLC圖譜，其中，A:紫杉醇標準品，B:陰性對照酵母菌株發酵液樣品，C:重組菌株發酵液樣品。
[0024]圖3為重組菌株的發酵圖譜。
[0025]圖4為重組菌株的遺傳穩定性圖譜。
【具體實施方式】[0026]下面結合附圖和實施例對本發明作詳細說明。
[0027]本發明以H.polymorpha DL-1為出發菌株(來源為ATCC N0.26012)，利用低能離子輻照注入介導紅豆杉基因組DNA對出發菌株進行轉化，通過篩選獲得產紫杉醇重組菌株，并進行遺傳穩定性和相應的發酵試驗。
[0028](一 )培養基
[0029]液體無機培養基的組成:丙三醇19g，(NH4) 2S046g, K2HPO40.24g，MgSO4.7H201.4g，CaCl20.38g，NaCl0.6g，NaNO30.58g，鐵鹽溶液0.2mL，硫胺素鹽酸鹽溶液lmL，PTM微量元素溶液lmL，用水定容至1L，pH為6.5 ;
[0030]其中各溶液配料如下:
[0031]鐵鹽溶液=FeCl3.6H2030g，用水溶解并定容至IL ；
[0032]硫胺素鹽酸鹽溶液:硫胺素鹽酸鹽4g，用水溶解并定容至IL ；
[0033]PTM 微量元素溶液:ΚΙ0.lg，Na2MoO4.2Η200.2g，MnSO4.H2O0.303g，CuSO4.5Η200.04g, ZnSO4.7Η200.4g，用水溶解并定容至 IL0
[0034]Yro有機固體培養基的組成為:葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L,瓊脂 20g/L, pH 為 6.5。
[0035]( 二)篩選方法
[0036]I)萜類物質檢測
[0037]香草醛反應:取SOOmL發酵液，100°C下濃縮發酵液至5mL(即得濃縮發酵液)后，加入甲醇IOmL萃取，過濾萃取液。取濾液lmL，加入5% (質量分數)香草醛濃硫酸溶液
0.5mL，加熱2min，觀察溶液顏色變化，呈現淡紫色的為陽性。
[0038]FeCl3試驗:用進樣針吸取樣品在濾紙上點多個樣點，噴以3% (質量分數)FeCl3水溶液，觀察樣點顏色變化，出現紅色斑點的為陽性。
[0039]2)薄層層析(TLC)定性檢測:分別將5μ L濃縮發酵液和紫杉醇標準品在GF254硅膠薄層板上點樣，在展開劑氯仿-甲醇(V/V，90:10)中展開，結束后在紫外燈下觀察，記錄斑點，并計算其Rf值。
[0040]3) HPLC定量檢測:取發酵液800mL，100°C下濃縮發酵液至5mL (即得濃縮發酵液)后，加甲醇IOmL萃取，過濾萃取液，濾液以0.45 μ m微孔濾膜過濾后用于HPLC法測定紫杉醇的含量；HPLC色譜條件為:色譜柱為化學鍵合型十八烷基柱(SciC18色譜柱)；Pump:K-1001 ；Detecter:K_1501 ;流動相:甲醇-水(V/V,68:32);柱溫:25°C。
[0041](三)重組以及篩選流程
[0042]I)提取紅豆杉基因組DNA:取陜西當地產紅豆杉新鮮葉片50g，用液氮迅速研磨至粉末后，將其裝入50mL的離心管中；接著迅速將3mL預熱的CTAB提取液(2%CTAB，
1.4MNaCl，0.02MEDTA，0.lMTris-HCl，0.2%巰基乙醇，pH8.0)加入到裝有粉末的 50mL 離心管中；之后放入65°C水浴鍋中，保溫30~60min (期間輕搖5次)后,加入3~4mL氯仿-異戊醇(24:1)，輕搖混勻至乳白色后，置于4°C、I 1000rpm離心15min ;取上清液并加入0.6倍體積的異丙醇，搖勻后，置于4°C、IlOOOrpm離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇漂洗2次，放置于超凈工作臺中吹干得紅 豆杉基因組DNA。最后加入ImLTris-EDTA(pH8.0)緩沖液溶解基因組DNA，并用紫外分光光度計測其濃度，放入4°C冰箱保存。
[0043]2)低能離子注入菌膜:將本實驗室保藏的出發菌株(H.polymorpha DL-1)于37°C、在YPD有機固體培養基上活化12h后，挑取菌落接種到液體無機培養基中，并于37°C、110r/min轉速條件下培養16h得菌液A，取適量菌液A稀釋至濃度為1.0 X 107CFU/mL得菌體稀釋液，取0.1mL菌體稀釋液均勻涂布于直徑90mm的無菌平皿中央，無菌風吹干制成菌膜，然后置于離子注入機真空靶室進行N+注入，注入能量為20KeV，劑量為2.0 X 1016ions/cm2,脈沖時間6s,間隔時間IOs,真空度為1.5 X IO^3Pa0
[0044]3)固體培養:經過步驟2)后，用2mL含有紅豆杉基因組DNA的Tris-EDTA緩沖液(TE，pH8.0)浸泡離子注入后的菌膜，然后于37°C溫育2h后用移液器進行洗脫，收集洗脫液并用無菌刮鏟將菌全部刮下得菌液B，分別取0.1mL菌液B均勻涂布于YPD有機固體培養基后于37 °C培養72h。
[0045]4)初篩:經過步驟3)后，將培養獲得的菌落轉接入試管中進行液體培養(37°C、110rpm/min培養120h),然后于10000r/min離心10min收集發酵液進行檢測分析。職類物質的檢測主要采用香草醛反應和FeCl3試驗。首先利用香草醛反應對重組菌株的發酵液進行分析，觀察樣品液的顏色變化(陽性結果為淡紫色)。然后，再利用FeCl3試驗對上述出現淡紫色的重組菌株的發酵液進一步分析，觀察是否出現紅色斑點(陽性結果為出現紅色斑點)。上述兩種陽性反應結果表明重組菌株的發酵液中存在萜類化合物，可作為后續分析的初篩重組菌株。
[0046]5)定性、定量檢測:將初篩重組菌株接種于含IOmL液體無機培養基的試管中，并于37°C、110r/min下培 養12h得種子培養液，以體積為5 %的接種量將種子培養液接種于含IOOmL液體無機培養基的500mL三角瓶中，然后于110r/min、37°C下培養90h，然后于7000r/min離心10min，離心得到的菌體用蒸餾水沖洗兩次后于85°C烘干至恒重進行稱重分析，離心得到的上清液用于產物定性、定量檢測，主要采用薄層層析(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。
[0047]薄層層析法定性鑒定:分別用毛細管將5μ L的初篩重組菌株濃縮發酵液、陰性對照酵母菌株的濃縮發酵液及紫杉醇標準品點于薄層板上，然后將薄層板在展開劑氯仿-甲醇(V/V，90:10)中進行展開。結果如圖1所示，初篩重組菌株濃縮發酵液在與紫杉醇標準品相對應的位置上出現同樣斑點，其Rf值為0.435，與紫杉醇標準品Rf值(0.438)非常接近，而陰性對照酵母菌株的濃縮發酵液在該處未出現斑點，表明初篩重組菌株發酵過程有新物質合成。
[0048]HPLC法定量鑒定:分別將初篩重組菌株濃縮發酵液、陰性對照酵母菌株的濃縮發酵液及紫杉醇標準品進行HPLC分析，結果如圖2所示，保留時間為20.441min處初篩重組菌株濃縮發酵液中出峰(圖2C)，與紫杉醇標準品出峰(圖2A)的保留時間20.550min基本一致，而陰性對照酵母菌株的濃縮發酵液在該處未出峰，表明初篩重組菌株具有生物合成紫杉醇的能力。通過上述步驟，最終本發明篩選得到了一株重組菌株DL-781，本發明篩選獲得的重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha),該重組菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏日期為2014年4月3日；保藏編號為CGMCC N0.8999。
[0049](四)重組菌株的發酵及紫杉醇分離提取
[0050]重組菌株(CGMCC N0.8999)的發酵工藝:采用5L全自動發酵罐對篩選出來的重組菌株(CGMCC N0.8999)進行高密度發酵生產紫杉醇，重組菌株經種子培養(參照上述種子培養液的培養條件)后以5% (體積比)的接種量接種于液體無機培養基中，于37°C、轉速為200r/min下進行連續發酵120h，發酵中同時流加0.5% (w/v，IOOmL水中含0.5g甘油)的甘油水溶液，流速為12.5mL/h，發酵60h后，每隔12h取發酵液500mL，測定酵母細胞生物量和紫杉醇。結果如圖3所示，菌體濃度隨著培養時間的增加不斷升高，培養96h后細胞生物量達到最高為39.92g/L，接著進入生長平穩期；紫杉醇從72h開始出現，并隨著時間延長，產量隨之增長，108h時產量達到最高，達1.106mg/L。
[0051]紫杉醇分離純化:依據上述發酵工藝，將重組菌株(CGMCC N0.8999)進行高密度發酵12011，于6011、7211、8411，9611和120h分別取500mL發酵液進行分離純化檢測分析。具體為將發酵液500mL經過12000r/min離心10min后，將上清液于80°C濃縮至10mL，采用H60大孔樹脂對紫杉醇進行分離。將濃縮后的上清液配成體積分數為50%的甲醇-水(甲醇與水的體積比為50:50)的溶液作為上樣液，流速為1.5mL/min上樣，再用體積分數為80%的乙醇水溶液作洗脫液，流速為0.5mL/min洗脫。利用HPLC進行定量分析表明，樣品中紫杉醇回收率達85%。
[0052](五)重組菌株的遺傳穩定性[0053]將重組菌株(CGMCC N0.8999)活化后接種于含有500mL液體無機培養基的2000mL三角瓶中進行搖瓶培養(37°C、160r/min)，傳代培養10代測定重組菌株的遺傳穩定性。結果如圖4所示，表明傳代培養過程中重組菌株發酵液中紫杉醇含量基本不變，傳代培養10代后紫杉醇含量為1.081mg/L，相比于第一代重組菌株的紫杉醇含量(1.106mg/L)降低了
1.8 %，說明該重組菌株遺傳穩定。
[0054]總之，本發明利用低能離子注入技術轉化酵母構建產紫杉醇重組酵母菌，微生物發酵生物合成紫杉醇具有生產成本低、生產周期短、不受自然氣候影響、節約土地、胞外產物分離提取簡單等優點，這為解決紫杉醇來源短缺問題、保護紅豆杉科植物資源并實現其可持續發展提供了新途徑。
【權利要求】
1.一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:該重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha),所述重組菌株保藏于CGMCC,保藏編號為CGMCC N0.8999。
2.根據權利要求1所述一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:所述重組菌株的發酵方法包括以下步驟:于37°C、轉速為200r/min下培養72~120h。
3.根據權利要求2所述一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:所述發酵采用的培養基為液體無機培養基，發酵中同時流加0.5%的甘油水溶液，流速為12.5mL/h。
4.一種如權利要求1所述多形漢遜酵母重組菌株在紫杉醇生物合成中的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK103923848SQ201410175122
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】錢衛東, 趙德志, 蔡長龍, 毛培宏, 王婷, 陳雪峰, 施春陽 申請人:陜西科技大學