專利名稱：：水稻抗褐飛虱基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種水稻抗褐飛虱基因萬/7W么同時還涉及該基因在水稻及水稻種子抗褐飛虱中的應用。
背景技術：
：水稻是一種重要的糧食作物，世界上有超過一半的人以其為主食。同時,由于水稻基因組精細遺傳圖和物理圖譜已完成，其轉基因技術相對容易，并且與其它禾本科作物基因組具有共線性，因而被視做模式植物。隨著包括水稻在內的多種生物基因組測序的完成，人類開始進入后基因組時代。全面開展功能基因組研究已成為生命科學的前沿領域。因此水稻功能基因的研究對社會經濟發展和生物學研究具有重大意義。糧食安全問題，是全世界人民面臨的挑戰。50、60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育兩次科技革命使水稻產量大幅度提高。但近幾十年來水稻受到大面積的病蟲為害，使水稻生產受到威脅。褐飛虱是我國水稻生產中的主要害蟲，其成蟲和若蟲以口針刺吸水稻汁液，引起黃葉或枯死，導致減產或絕收。據中國農業年鑒記載，1966、1969、1973、1977、1983和2003年全國性大發生，1987、1991、2005、2006和2007年全國性特大發生，褐飛虱危害面積達到水稻總面積的50%以上，給我國水稻生產造成了嚴重的損失。由于褐飛虱的危害多發生在水稻成熟灌漿期，此時大量使用殺蟲劑，對稻谷的污染也是非常嚴重的問題。利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中最為經濟有效的方法。國際水稻研究所(IRRI)的研究結果和東南亞的水稻生產實踐證明，即使是只有中等抗性水平的水稻品種，也足以將褐飛虱的群體控制在造成危害的水平以下，不至于對水稻造成實際的危害和產量損失。因此，挖掘水稻抗褐飛虱基因并在水稻育種項目中應用是防治水稻褐飛虱的根本措施。3水稻抗褐飛虱基因的研究始于上世紀70年代初。至今已命名了19個主效抗蟲基因(具體綜述見YangHY等，2004High-resolutiongeneticmappingattheBphl5locusforbrownplanthopperresistanceinrice.TheorApplGenet.110:182-191)。其中，Mudgo、C022和MTU15三份材料的抗性受到一個顯性基因的控制，該基因被命名為^pW，而另一個與萬p/z/緊密連鎖的隱性基因控制著ASD7的抗性。Lakshminarayana和Khush在對28個品種的遺傳學研究中發現RathuHeenati攜帶一個顯性抗褐飛虱基因^^3，這一基因獨立于5/W遺傳，此外Babawee中有一個隱性基因6//^,這個基因也獨立于6;/^遺傳。Sidhu和Khush發現5//3與6p/^是緊密連鎖的，^W還與半矮化基因W-7連鎖。Khush等對ARC10550的遺傳分析證明它含有隱性基因6/^5。Kabir和Khush在對17份抗生物型4但對其它三種生物型敏感的材料的研究中發現，Swamalata、T12分別含一個抗蟲基因，命名為5pM和6p/7。6;M、5;妙的發現與其它幾個基因類似，隱性基因6;/2S與^;2、*/^不等位，顯性基因5;妙與^/3、5/W不等位。上述抗褐飛虱基因中，6/7/25、Sp/z6、6/^7褐飛虱抗生物型4，而對生物型1、2、3均表現為敏感。野生稻資源中有大量的抗褐飛虱材料。1994年Ishii等從澳洲野生稻(a"z^ra"m^)的一個轉育系IR65482-4-136-2-2中鑒定出一個新的顯性抗褐飛虱基因這個基因抗褐飛虱生物型1、2、3。從O.e/c/H'"gw中鑒定出紛7力U。帶有褐飛虱基因的水稻能抑制褐飛虱的取食、生長發育和繁殖，從而達到抗蟲的目的(HaoPY等，2008Herbivore-inducedcallosedepositiononthesieveplatesofrice:animportantmechanismforhostresistance.PlantPhysiology146:1810-1820)。但是，至今尚未克隆到水稻的抗褐飛虱基因。圖位克隆(map-basedcloning)又稱為定位克隆(positionalcloning),是隨著分子標記遺傳連鎖圖譜的發展而發展起來的一種基因克隆技術。圖位克隆法步驟包括對目標基因進行遺傳定位、物理定位、序列分析及遺傳轉化驗證功能。從理論上講，任何一個能定位的基因都可用圖位克隆法分離。圖位克隆法一般適合于基因組比較小的物種，如單子葉模式植物水稻，具有基因組小、基因組物理距離與遺傳距離之比小而且標記豐富的特點。水稻作為禾本科模式植物，其基因組是麥、高梁等七種禾本科植物基因組組成的同心圓的圓心，是最適合應用圖位克隆法分離目的基因的作物之一。水稻中已經克隆的多個基因都是通過圖位克隆法克隆的，如抗白葉枯病基因義a-2/(SongWY等1995，AReceptorKinase-LikeProteinEncodedbytheRiceDiseaseResistanceGene，^x2入5We"ce,270:1804-1806)、^7-/(Yoshimura等1998,ExpressionofXa-l，abacterialblight-resistancegeneinrice,isinducedbybacterialinoculation.iWJ51，95:1663-1668)和(Sun等2004，X<x26ageneconferringresistanceto^3涵o膨wospv.oryzaeinrice,encodesanLRRreceptorkinase-likeprotein._P/a"f/owrwa/，37:517-527)，抗稻瘟病基因尸"(Wang等1999,ThePi-bgeneforriceblastresistancebelongstothenucleotidebindingandleucine-richrepeatclassofplantdiseaseresistancegenes.尸/awfJow7a/，1999，19:55-64)和(Bryan等2000，Asingleaminoaciddifferencedistinguishesresistantandsusceptibleallelesofthericeblastresistancegene尸/awfCe〃,12:20332046)，以及我國科學家克隆的分蘗基因(Li等2003,Controloftilleringinrice.A^we422:618-621)、耐鹽基因(Ren等2005，Aricequantitativetraitlocusforsalttoleranceencodesasodiumtransporter.7Vaft^eGewerics37(10):1141-1146)和高產基因(WeiyaXue等2008,NaturalvariationinG7zd7isanimportantregulatorofheadingdateandyieldpotentialinrice.7Vart^eG^w幼'cs40，761誦767)。
發明內容本發明的目的在于提供一種水稻抗褐飛虱的基因^pW4，其具有SEQ.ID.No.l所示的核苷酸序列。本發明另一目的是提供一種抗褐飛虱基因BpW4在水稻選育中的應用。本發明的再一個目的在于提供一種抗褐飛虱基因5pW4在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應用。本發明釆用遺傳學的方法，構建水稻抗褐飛虱的分離群體，利用圖位克隆的方法，分離到水稻抗褐飛虱基因萬pW(通過共分離標記檢測表明該基因與抗褐飛虱性能是共分離的，通過遺傳轉化BpW4基因，使感性水稻出現抗褐飛虱的表型，證實了該基因的功能。本發明^W4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，該基因全長9921bp,具有l個內含子和2個外顯子，其CDS分別為區段分別為3387-7289和7936-8004，cDNA全長3972bp，編碼1323個氨基酸，其蛋白序列如序列表SEQIDN0.3所示。該蛋白屬于NBS-LRR家族，活性中心180-464區段為保守的NB-ARC區，包括保守的P-loop,ATP結合區，激酶la等。應當理解，在不影響Bphl4蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本領域技術人員可對SEQIDNO.3所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響蛋白表達的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。因此，本發明還包含對編碼上述蛋白的基因序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體、含有所述載體的宿主細胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉化的植物細胞和轉基因植物。本領域技術人員應能理解，根據本發明公開的序列來設計或產生分子標記可用于抗褐飛虱水稻的選育工作。本發明通過如下步驟克隆得到5pW4基因1.創建定位群體利用抗褐飛虱水稻RB5與普通水稻品種TN1雜交，F,代自交獲得F2群體，作為抗褐飛虱基因定位群體。2.抗褐飛虱鑒定應用苗期集團法鑒定定位群體的抗褐飛虱性能。從F2代植株上收獲F3種子，每份F2代植株收獲的F3種子于秧盤中播種20棵苗(稱為l個家系)。2葉l心期，放入2-4齡的褐飛虱若蟲(10頭/株)，記錄各家系的受害情況,每份材料重復3次實驗。根據抗蟲鑒定結果，對定位群體家系的進行了抗蟲級別的劃分。3.抗褐飛虱基因定位用PCR(polymerasechainreaction)和聚丙烯酰胺凝膠電泳，以及RFLP標記和Southern雜交的方法，檢測F2各個單株的SSR和RFLP分子標記的分離情況，結合相應各家系的抗蟲級別，應用JoinMap3.0和MapQTL5.0軟件，構建水稻第3染色體的分子標記遺傳連鎖圖，將^pW4定位在分子標記R1925和G1318之間。4.加密目標區段分子標記與精細定位根據國際水稻基因組計劃公布的水稻基因組序列，設計第3染色體5;W4所在目標區段的SSR標記和STS標記的引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法檢測標記在F2大群體中的分離，通過篩選得到的重組單株的表型與基因型的關系，將抗褐飛虱基因BpW4定位在分子標記SM1和G1318之間。5.候選基因確定應用高密度膜Southern雜交方法篩選抗褐飛虱水稻B5的基因組文庫，獲得陽性克隆，以雙脫氧終止法(Sanger法)進行大片段測序，得到5;^W所在區段的基因組序列，應用RiceGAAS軟件預測基因，并通過與日本晴和9311序列作對比分析，確定^pW4的候選基因。6.根據序列設計引物進一步做共分離檢測根據5pW4候選基因序列設計引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對F4的大群體進行檢測，這些引物對應的標記與抗褐飛虱的表現型共分離，篩選得到了抗褐飛虱的水稻株系。7.全長cDNA克隆根據預測的cDNA序列，以3'末端的序列設計引物，從抗褐飛虱水稻B5的cDNA中擴得探針，篩選cDNA全長文庫，最終獲得^p/z"的全長cDNA。然而，本領域技術人員應當理解，根據本發明公開的^pW4的核苷酸序列，通過設計恰當的PCR引物，即可從抗褐飛虱水稻基因組中擴增得到5/W4基因。例如，弓l物5'ctccctgactgaagaagagaagag3,，5'tgctagctgtgattctcttatgatg3，，釆用長片段PCR擴增試劑盒，擴增抗褐飛虱水稻或野生稻的基因組DNA即可得到該序列。8.遺傳轉化5pW4基因來驗證其功能根據5;W4基因所在BAC克隆的序列，用和K/7"I雙酶切9921bp的片段連入pCAMBIA1301,釆用農桿菌EHA105介導的遺傳轉化方法，將基因組載體導入正常秈稻品種Kasalath中，最后獲得B;W4陽性植株14株。用丁2代純合的5pW4陽性植株進行了抗蟲鑒定。苗期釆用集團法鑒定，對照水稻Kasalath全部死亡，轉基因陽性植株存活，抗蟲級別為3-5級；成熟期的水稻植株按每個分蘗80頭褐飛虱接入3-4齡褐飛虱，14天后Kasalath死亡，轉基因陽性植株存活。取食電位儀(EPG)和蜜露法檢測褐飛虱的取食行為，褐飛虱在轉基因陽性植株上的取食明顯減少。這些結果說明萬/W4基因具有抗褐飛虱的功能。因此，抗褐飛虱基因5pW4可以在水稻中應用也可以在水稻種子中應用，培育具有抗褐飛虱性能的水稻品種。本發明的優點和效果1.本基因的成功克隆進一步證實了圖位克隆法法克隆水稻重要基因的可靠性，該方法克隆的基因其功能明確、效果好。2.水稻中多個編碼具有NBS結構蛋白的基因雖已被克隆，但大多與抗病性有關，本發明克隆的5/W4基因具有明顯的抗褐飛虱性能，這對全面理解該類基因的生物學功能有重要意義。3.國際上尚未克隆到水稻的抗褐飛虱基因，對水稻抗褐飛虱的分子機理仍不清楚。而本發明克隆的5pW4基因能夠提高水稻對褐飛虱的抗性，這對水稻抗褐飛虱的分子機理研究將有極大的推動作用。4.萬/7/2^使水稻抗褐飛虱性能大大提高，通過遺傳轉化或雜交將5pW4應用于水稻育種中，可以改善水稻品種的抗褐飛虱性，從而減輕褐飛虱的為害，達到增產和穩產的目的。5.刺吸式昆蟲是農業生產中的一大類蟲害，5;^"基因克隆和抗褐飛虱功能證實，對于其他植物的抗刺吸式昆蟲研究具有重要參考作用。圖1.A:RI35為藥用野生稻與栽培稻雜交后代中選育的抗蟲水稻資源，攜帶有一個抗褐飛虱基因B^W4;TN1為褐飛虱感蟲品種；RI35和TN1雜交構建F2定位群體。B:苗期集團法鑒定F2群體中的抗蟲植株和感蟲植株，褐飛虱危害后存活的為抗性植株，死亡的為感蟲植株，左圖為苗期鑒定放蟲前，右圖為放蟲后。圖2.SSR標記76B10-2檢測單株的電泳圖。前兩個泳道為抗蟲親本RI35和感蟲親本TN1，后面為F2群體單株的基因型。圖3.5pW4的定位。A:5p/zW初步定位結果。染色體上邊為標記名稱，數值是標記間的遺傳距離(cM),QTL掃描結果在分子標記R1925和G1318之間有一個最大的LOD值49.3。B:精細定位結果。分子標記之間數值表示標記與^pW4重組單株數，5;/"與分子標記SM1和G1318之間。C:SM1和G1318之間的物理圖譜，位于SM1-G1318間34kb的區域。圖4.轉基因所用載體。圖5.轉基因陽性植株鑒定。M為100bp分子量標準，pBphl4K為構建的質粒，Kasalath為轉基因受體植株，用潮霉素和GUS探針鑒定T0代轉基因植株(1~14)。圖6.A、C、E:轉5/W4基因抗褐飛虱水稻K4-20的鑒定結果。A:成熟期的抗蟲鑒定，對照的Kasalath明顯死亡，而K4-20仍然存活；C為EPG記錄的褐飛虱在不同品種取食行為，明顯可以看出褐飛虱在轉基因抗褐飛虱水稻K4-20上的取食時間減少了30%;E為褐飛虱取食不同品種排泄物的量，顏色深淺和面積反應了排泄物的多少，顏色越深，面積越大，取食越多，排泄量越大。轉基因抗褐飛虱水稻K4-20上顏色面積很小。B、D:不同轉基因株系T2代純合植株苗期鑒定。B:放蟲前和放蟲后14天的比較；D:轉基因株系的抗蟲級別(上)和5;/l^基因表達的RT-PCR檢測，Bp/l^基因表達的轉基因株系均對褐飛虱有明顯抗性。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例UM^基因的定位克隆1.5/W初步定位結果將抗褐飛虱水稻材料RB5(HaoPY，LiuCX，WangYY,ChenRZ，TangM,DuB,ZhuLL,HeGC(2008)Herbivore-inducedcallosedepositiononthesieveplatesofrice:animportantmechanismforhostresistance.PlantPhysiology146:1810-1820)與褐飛虱感性水稻品種(臺中本地1號，TNl，購自國家水稻種質資源庫)雜交構建了含5pW4的F2群體。為了鑒定F2定位群體中每個單株的抗褐飛虱表型，釆用了苗期集團法考察群體中各個單株的抗性表現(見圖1B)。F2單株的抗蟲級別按對應的Fw家系所有單株的抗蟲級別的平均值計算。用PCR(polymerasechainreaction)和聚丙烯酰胺凝膠電泳，以及RFLP探針和Southern雜交的方法(見《分子克隆》第四版)，檢測F2各個單株的SSR和RFLP分子標記的分離情況。根據F2的分子標記分型，應用JoinMap3.0軟件，構建水稻染色體的分子標記遺傳連鎖圖。對苗期集團法中收集到的數量化抗褐飛虱表現型數據，借助數量性狀分析軟件MapQTL5.0進行區間作圖定位分析。結果顯示在第3染色體分子標記R1925和G1318之間存在著一個QTL峰值，LOD值達到49.3，對表型方差貢獻率為90.6%。2.5/^24的精細定位根據前期結果，用PCR(polymerasechainreaction)和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，以R1925和G1318外側的兩個SSR標記RM514和SMI篩選F2群體得到了54株重組單株。整合重組單株的分子標記，對分子標記相同且抗蟲鑒定的級別處于同一水平的單株合并(表1)。RT25-RT15這12株單株除SA69這個單株，表型與分子標記SM1完全一致，但在SA69中，表型與G1318相同。因此，將5;/L^定位在SMl和G1318之間。表lF2重組單株的抗蟲表現單株編號RM514SG1R1925SG9SG6RM570SM1G1318表型抗蟲級別RT1RRRRRRHHH5.6RT5RRRRRHHHH4.74RT16RRHHHHHHH5.83RT2RHHHHHHHH5.49SA50RHHHHHRRR3.93SA74HHHHHHRRR3.96SA55SHHHHRRRR3.86RT18HHHHHRRRR4.04RT83HHHHRRRRR4.56RT82HHHRRRRRR4.1RT10HRRRRRRRR4.43RT25HHHSSSHHH4.88SA51HHSSSHHSH4.48SA66HHSSsHHSH4.78SA69SSSSsHHsS7.38RT84HHHHHHSsS7.23RT24HHHHHSSsS8.55SA60HHHSSSSss7.55RT3HSSSsSSss8.25SA102SSSSssSHs8.32RT8SSsSssHHH5.58RT7SSsssHHHH5.39RT17SSssHHHHH4.35RT15sHHHHHHHH4.963.抗褐飛虱水稻基因組文庫的構建ii植物高分子量基因組DNA的制備參照張洪斌等的方法(Zhang等，PreparationofmegabaseDNAfromplantnuclei.PlantJ1995，7,175-184)。提取抗褐飛虱水稻B5(WangBN,HuangZ,ShuiLH,RenX,LiXH,HeGC(2001)Mappingoftwonewbrownplanthopperresistancegenesfromwildrice.ChineseScienceBulletin46:1092-1095)的嫩葉細胞核，用低熔點瓊脂糖包埋。將包埋塊加入適量的限制性內切酶BamHI進行部分酶切，用CHEFMapper脈沖電泳儀進行交變脈沖電泳分離所需片段。切下含所需大片段區域的最濃部分的膠條放入透析袋中，電泳透析回收所需的DNA大片段(Strong等,MarkedimprovementofPACandBACcloningisachievedusingelectroelutionofpulsed-fieldgel-separatedpartialdigestsofgenomicDNA.NucleicAcidsRes.1997,25,3969-3961)。電透析分離的大片段DNA被收集到1.5ml離心管中，按600ng回收的DNA片段(50-250Kb)與200ng的BIBAC2脫磷載體混合在60。C加熱10min冷卻至室溫，加入T4DNA連接酶，在16。C下連接16h。取2^il連接產物和40plDH10B感受態細胞用GenePulserSystem進行電擊轉化，37。C培養過夜。挑取上述平板上長出的陽性菌落到含有7(^1培養液的384孔細胞培養板中，37'C培養30h。文庫構建完畢，用GenetixQ-PIX拷貝兩份，-S(TC保存。為了估算插入片段大小和克隆體積的分布情況，從文庫中隨機挑取30個BIBAC克隆，按堿裂解法提取質粒，用適量的NotI酶切后，脈沖電泳檢測插入片段的大小(ShiZY，RenX,WengQM,LiXH,HeGC(2003)ConstructionofgenomiclibraryofaBPH-resistantricelinewithbinaryvectorandphysicalmapofQbpllocus.PlantScience1165:879-885)。4.SM1-G1318區段物理圖譜的構建篩選出R1925-G1318區段所有的BAC克隆，用B";wHI和￡coRI雙酶切后電泳、轉膜。再將酶切后的克隆末端用放射性a-"P-dCTP標記，與BAC克隆膜進行Southern雜交，方法同前，根據雜交信號判斷哪些BAC克隆有重疊以及重疊片段的大小，以此構建物理圖譜(圖3C)。BAC陽性克隆末端分離參照劉耀光等(LiuandWhittier,ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPIandYACclonesforchromosomewalking.Genomics25:674—681)發明的TAIL-PCR方法。篩選以及TAIL-PCR結果顯示BAC克隆76B10包含了完整的^7/zW基因(圖3C)。5.SM1-G1318區段候選基因的分析對5pW4基因所在克隆的全序列進行了測序分析，并以該序列為目標序列，搜索NCBI數據庫，得到曰本晴基因組在該區段的同源序列。用RiceGAAS進行基因預測和注解，同樣用ClustalW進行比較分析(表2)。表2Sp力"基因區段抗蟲水稻預測基因與日本晴預測基因的比較該區段日本晴預測的基因該區段抗蟲水稻預測的基因相似編號預測功能氨基外顯編預測功能氨基外顯度酸數子數號酸數子數(%)gl假定的ARPC蛋白752gl假定的ARPC蛋白753100p20p20g2假定的B細胞受體2173g2假定的B細胞受體189294.7相關蛋白31相關蛋白31g3假定的逆轉錄轉座革19974g4丁假定的NO誘導蛋2384g3假定的NO誘導蛋246496.6白畫白NOIg4假定的抗病蛋白1333283.4g5假定的RPM1的互148433.8作蛋白RIN4g5假定的抗病蛋白13151g6假定的抗病蛋白1121399.6g6未知蛋白152g7假定蛋白1483g7未知蛋白1322g8假定蛋白1153g8假定的RPM1的互1683g9未知蛋白2233作蛋白RIN4g9未知蛋白492gio假定蛋白872gll假定的抗病蛋白6802gio假定的抗病蛋白680299.7比較兩者預測的基因，發現抗蟲水稻的第4個基因編碼的抗病蛋白與曰本晴差異較大。目前均認為刺吸式昆蟲吸食水稻與病原菌對水稻的侵染過程類似，水稻抗刺吸式昆蟲的機理就有可能和抗病原菌相同。因此，將該基因確定為為5/7/Z/《136.cDNA文庫的篩選以預測基因所對應的EST作探針，對褐飛虱誘導的抗蟲水稻B5cDNA文庫(WangXL,WengQM,YouAQ,ZhuLL，HeGC(2003)CloningandcharacterizationofriceRH3geneinducedbybrownplanthopper.ChineseScienceBulletin48:1976-1981)進行唾菌體原位雜交篩選。經過三輪原位雜交，將挑選的單個噬斑PCR檢測，再酶切檢測插入片段的大小，測序分析得到BpW4的全長cDNA,其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。實施例2:5;;/^/基因的功能驗證和應用1.遺傳轉化載體的構建所用載體為pCAMBIA1301(購自澳大利亞CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)。根據基因組測序的結果，設計引物(5，cggaattcctccctgactgaagaagagaagag3',5，cggaattctgctagctgtgattctcttatgatg3，)，其包括^^RI的接頭，擴增抗蟲水稻B5的基因組(Z.Huang等，Identificationandmappingoftwobrownplanthopperresistancegenesinrice.r/^wJ/^/Ge"W，2001，102:929-934)。PCR反應總體積50jlU:1jn1DNA，10xbuffer5m1，10mMdNTP1|a1，10uM引物各3|a1，高保真Taq酶1U;反應程序94°C2min，94°C15s，58°C30s,72。C7min30s，共30個循環；產物加1/10體積的3mMNaAC和2x體積的無水乙醇純化。所得序列包括5pW4上游1960bp的啟動子、4997bp的基因組序列以及下游436bp的3，非翻譯區。用&o貝酶切，酶切反應體系總體積為20jal:PCR產物約5ial(liag)、lx反應緩沖液、汝o及IlU,混勾后37。C酶切過夜，1/10體積的3mMNaAC和2x體積的無水乙醇沉淀，回收所需片段。pCAMBIA1301載體酶切體系同上，試劑盒純化回收。連接反應基因組片段lml,載體0.5jlU，2UT41igase，5xbuffer2ju1，總10ial體積，4。C連接過夜；連接產物與大腸桿菌DH10B混勻，42。C熱激90s，加400ju1LB，復蘇45分鐘，取200jul涂于含卡那霉素的LA平板，37°C，過夜。挑單克隆，擴大培養，抽質粒，酶切驗證。挑陽性克隆，把構建好的載體電轉農桿菌EHA105，抽質粒，PCR驗證正確，取750^ll含構建好載體的農桿菌菌液加等體積的50%甘油混勻，-7(TC保存。根據cDNA全長序列，設計引物，包括和^Z)fll的接頭(5，tccccccgggatggcggagctaatggccac3'，5'gctctagactacttcaagcacatcagccta3')。用Invitrogen公司的TRIzol從B5葉鞘中提取總RNA，再用Fermentas公司的逆轉錄試劑盒獲得B5的cDNA,反應體系總RNAl昭，oligo(dT)1^1，5xbuffer4|il，inhibitor1^1,10mMdNTP2|a，逆轉錄酶1^1,42。C反應1小時。用設計的引物擴增B5的cDNA,PCR反應體系同上，程序72。C延伸4min，即得到5;/2/4的cDNA序列。同時轉錄cDNA序列所需的啟動子可以從pCAMBIA1301中存在的35S啟動子PCR擴增獲得。設計引物包括五coRI和Xmal的接頭(5'cggaattcatggtggagcacgacactct3，,5'tccccccgggatctcattgccccccgggat3，)，從pCAMBIA1301擴增35S的啟動子序列。PCR反應體系同上，反應延伸時間為lmin。將35S的啟動子和pCAMBIA1301載體分別用五coRI和^)wfll酶切回收后連接轉化，獲得的陽性克隆再和^pW4的cDNA序列分別用Xmal和^&al酶切，回收，連接轉化，構建35S:B/W4的載體，并將構建好的35S:5//zW的載體電轉到農桿菌EHA105中，具體過程同上。2.遺傳轉化釆用農桿菌EHA105介導的遺傳轉化方法(Hiei等，1994，Efficienttransformationofrice(Ojzasa&vaL.)mediatedbyv4grofeacfe〃.wwandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.尸/a"fJbwr"a/6:271-282)將上述5pW4基因組轉化載體和cDNA轉化載體分別導入褐飛虱感性的普通水稻品種Kasalath(購自國家水稻種質資源庫或國際水稻研究所)，同時采用空載體(pCAMBIA1301)作對照。3.5/;/L^基因表達的結果和應用兩個轉化載體分別獲得的組培苗14株，對照4株。田間播種，分別收獲了Tl代后，選擇純合株系(各14個株系)做抗蟲鑒定。經過苗期鑒定以及成熟期植株的抗蟲鑒定，轉基因植株對褐飛虱的抗性均明顯增強，而對照株不具有抗褐飛虱抗性。轉基因水稻苗期的抗蟲級別均在3-5級之間，成熟期的轉基因植株放蟲后存活良好，且能正常結實。同時，取食電位儀EPG(PeiyingHaoetal，Herbivore-inducedcallosedepositiononthesieveplatesofrice:animportantmechanismforhostresistance.PlantPhysiol,2008,146:1810-1820)檢測褐飛虱取食轉基因植株時，軔皮部的取食時間明顯減少；蜜露量(P.Paguia,HoneydewexcretionmeasurementtechniquesfordeterminingdifferentialfeedingactivityofbiotypeofM/a/"rv"to/wge"jonricevarieties.J.Econ.Entomol，1980,73:35-40)的檢測證實了褐飛虱取食轉基因植株時的排泄量減少。因此，克隆得到的5pW4能使水稻對褐飛虱的取食產生抗性。實施例3:分子標記輔助選擇帶有5/^W基因的抗褐飛虱水稻根據5/W4基因的基因組序列和cDNA序列，可設計多對SSR標記或STS標記的引物。本例中釆用引物對5'ctgctgctgctctcgtattg3，，5'cagggaagctccaagaacag3，，作為標記引物，來選育具有抗蟲功能的水稻，其擴增片段長度為172bp。提取抗蟲水稻，感蟲品種以及其雜交、回交后代植株的基因組DNA,應用^W4基因序列設計的引物PCR擴增后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，進行分子標記檢測。雜交后代植株中與抗蟲水稻PCR帶型一致者(擴增產物中含有172bp的片段)，即為選擇出來的含有5;W4基因的植株(如圖2)。這些植株的抗蟲性通過苗期集團法鑒定和成熟期鑒定確認(如圖1),通過自交和農藝性狀選擇，培育成抗褐飛虱的水稻。序列表說明SEQIDNo.1是^/z"基因的核苷酸序列，SEQIDNo.2是其cDNA序列，SEQIDNo.3是其編碼的蛋白序列；SEQIDNo.4&5以及SEQIDNo.6&7是用于從B5基因組中擴增5pW4基因的引物對；SEQIDNo.8&9是用于擴增5pW4基因的cDNA的引物對；SEQIDNo.lO&ll是用于從pCAMBIA1301中擴增35S啟動子的引物對;SEQIDNo.l2&13是，"基因的標記引物。序歹U表〈110>武漢大學<120〉水稻抗褐飛虱基因及其應用<130〉KHP08113283.6<勝13〈170>Patentlnversion3.5<210>1〈211>9600<212>DNA〈213>0ryzasativa〈400〉1cccgggcctttctccagtatctccatgatgattgtttggattaacagacctccctggaga60tttacccttgcgggcattttcgaaatactgtgtgtag鄉tgttcaccacggtcttcatc120ctcccagcttccaaatttaggaacttgtttatgctggtagagattaacaa180tttgcgttaggcagacagcatatgctgattgctgaatctactacacgggcttgttgcctt240gtcagttgtcatctttcatatgt犯cagga幼tagtatataattctagcc300ttccatccgtatatttctagattcattagctactagaatg360acttac3ttgt犯aacagagaaagtatgattatct肌actctcagatagtctattgtaat420cattgt3tgccttgtgtcaaagctgcagctttgttggatc480tactagttctaaaaaaaacagaatttacttagatcctgctgaaagacttcgggccaatta540gaagcccagtatttggccca犯actggtgt犯3Ct3C3ggcccataatsga^犯t犯gttc6003Ctggaiggtcccccaacttaacaccgagatttttttg鄉tcccttaacc660犯tgcgtacccctaaactatgt犯aaccgtaaggtcccgaggcagtatag720Ugctcggtttcgctgacgtggcatcctagtcagcaaaaaaaatatgtgg780ggcccacatgt犯gtg柳ga犯atggtgtgggccccacatttctcctttcttttctttt840tctcttctcttctctcccgattttctcgagtgggcgcggcggcagagggg900ccggcggtggagcgggggtggtggg卿ggggggctggcgcgacgtcggcggcgggag犯960卿g柳ggaggcggctggcgcgacggcgagctcggacggcaacggcgggaggaggagga1020gg柳gg3ggcagtcggcgctgtaa犯cgcgcatgggatgcggcggatgatgtcgagcgg1080gacggtgtcctcatcaccatcttcctcatcgtcatcgcagtctgcgggtgccgggcggag1140cggtttgggagggagggggaggcggccsgcgagcccgttcgagctcgcccggcctgcgcg1200cgagctcgcccctcccatagcttggtgtgctggggacgacgscgagg犯aggggg卿犯1260ggaattgacggccgatgatagc犯tggcgggcgagcgcggcgccgggctgctcatgctcg1320ccgaccaggcccccggcttcgccgcactcgtccgccgtgctcgcccacgcactcgccgac1380ctccgctccacccgccgctcctgcccgctgcccgctgcccgccggcctccctgactgaag1440agaaaaaaag1500atgtgtagctgacatgtgggccccatgtacuuttatntttttgctgactagaatgcc1560acgtcagcgagL3CC3CCC3tatatactgtcataggaccttgagtgcatagtttgtgtgag1620tttagggatacacatttctcgttttgtagttaagggacctCgt犯3犯tCtcgctgttaa1680gttg卿gacccctccggtgaacttattcccccaaatetttttctccatgctctgggctc31740aacgcactcttggatgggccgtgtaa/tctacaccatttctggcccaatccaacgaaggta1800gctccagactcctaactccgccgccgcatgcccaatcctcgccggccgccgctgccatct1860cccttcccccaccgccaccgtcgccttctccgttcccccaacaaaggctcagtagc兆ca1920gccgcggcgcgg卿gc卿ggccttggagggcctgcagaggagcgcccgcgtcgacgaa1980gacgacatcagcaggcagtggacatggcgactgcgaatgctatcgccgacgtgggagctt2040C3ggCg娜3tgcgtggccttcatcagctgctgctcccttacctgctctggtttgtcatt2100gtgUggttcgtggtttgggg3tstc3ggatgggg犯gggg犯tgggtttcgtgccatgt2160tgttctattgtgcaatttgatgttctcttgtcgaatttcatggtgattcaatctgcatct2220gtgttattggttgtc犯gca犯cattttatttctttcgagatgggtgtttcatctgaaat2280tggtgtgtctgatgatgtgaccttgtgcaaatcattgtttcattttcttctattccacag2340agatttttttgtttagagtttattctaccatcttcttaccttttgaatgctatgcaccac2400agatttctgatttttacacattcaatcacagtgccgacccttggcg犯tttaaaattttc2460tcaccgtcaaaatttaatca犯catctgatctaacagtagtagcgccagcax:ggctggto2520ttt犯ggC3g犯3ga犯ggttgcg鄉gcg3ggsgttggtgatgatctgccggtcgtgtc2580gtgactttaggcteLt犯et3gatagctgtttaaccsteLtgaagcgsisitcatc2640gatggccgstagcgagattatatccaactatc犯cttt犯tcttttgtga2700gctacaagtttcgtggtg犯ggcatatacttcatggctgcagcg犯tc犯2760cgagatgcatttgtcttgcacatttcccaccggatactttgccatccatggctttatctc2820ctccatgattgtatccccttcttcctcaacaaggaacgatcgatcattgtttgcttcttt2880ctctgacgacactttggtgcctctttcctgg犯ctcgtcccgtgagctcc2940ttcctggctacatcctccttaattccttgccgatttccggcttcgtcttcactatcgtca3000gttcatttctcccgctctgcctgagagtccagtttcttggagatagtcgccggcttgctc3060tctctctctctctcccttctcatcgccagctccagctcacaatccgagcttacgtggtgg3120aatcgctatcgccacctctcgg冊g3ttattgtactttgccttgcctacttcttgagtcc3180atccatcatgcatctgtttgtacttgcattcttccagttt3240aactccgtccgcaagtcaatacttgcattcaatttccatttcctacaaaagcagctgctc3300agactcttgccttctccacccagcaatcgtgtttccttccctgtatcctgcgcgtgtgtt3360cttagctgctCt鄉gg3tCcttcc幼tggCgg￡LgCt3￡ltggCC3CC3tggtggtcgggc3420cactgctgtccatggtg卿gacaaggcctccagctacctcctggagceigtacaaggtga3480tggagggcatggagg兆c3gcacgagatcctc犯acgcaagctgccagccatcctcgacg3540tcatcgccgacgccg3ggagcaggcggcta3￡tc3C3ggga>3ggggtga犯gcatggctcg3600aggcgctccgg犯ggtggcctaccaggccaatgacgtcttcgacgagttc￡l￡lgt3Cg￡Lgg3660cactccgccgc犯ggccaaggggcactacEiagatgctcagcagcatggttgt犯tc犯gc3720tcattcctactcacaaccgtattctgttcagttataggatgggc犯c卿ctcaggatga3780ttctgaatgccattgaagttagatg犯tgcctttaggtttaaattccgac3840cagagccaccaatgtcgtccgg卿ac柳ttctaa犯tctccgaccttt390018<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>caaagct犯gtgacttagagatatcta犯ggcaatcaaceiaatatccctacaggcagcca6300gC3g3C6lt3ttacttcsttgtccagtctcgttctgcatttgtccactgatg3C3C3g3336360cagcatcggtggccaagcaacaagattcgagtgatttggtgattgaggat6420gtcataaatctcccctgg犯cttatggtcttgagtcggtgcaaccttttattctctcacc6480caagtgcactggctctgtggacatgttttgctcagctcctagatctgaaaattcggtatg6540ttgatgcgcttgtcagctggccagaagaggtgttcc鄉gcttagtttccUg3gg33gt6600tagagatttctgtatgcgagaatctgaceigagctcgtgggcaatctacac6660ccgcacc犯gtgaactcctgccacgtttggagtccctagagataacgtgttgtgattcta6720ttgtggaggtccccaatctaccggcgtctctcaagctattagaaattagggggtgccccg6780gcctggagtccatcgtattc犯tC3gcagcaggat柳acgatgttggtg6840gctttgcagagcaggataagtcatcgttaatatcagggtcC3caagcgsgaccaacgatc6900acgtccttccacgcctagaatctcttgtaat犯attggtgcgatcgtttggaggttctcc6960atcttcctccgtccatcaag犯3ttgggtatttatagctgtg犯3犯Cttcggtccctct7020cagta犯gctggatgccgttcgag犯tt犯gtatcagacattgcgggagcttga幼tcac7080tgg犯tcttgcttagg柳gctc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