一種牛樟芝深層發酵復方制品及其制備方法

一種牛樟芝深層發酵復方制品及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種牛樟芝深層發酵復方制品及其制備方法，以茯苓粉、山藥粉、葛根粉、蜂花粉、大豆粉、酵母粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等配制深層發酵培養基，經深層發酵培養富含牛樟芝多糖的牛樟芝菌絲體發酵液，與采用超臨界CO2技術提取、酶解、分離、過濾、濃縮制得的佛手、黃精、枸杞、砂仁、余甘子、枳椇子等中草藥提取液配制而成。本發明優化了牛樟芝多糖等活性成分的含量，具有產量高、時間短、成本低，可以工業化生產，是一種高效環保的生物工程生產技術，具有顯著的開發應用前景。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥復方制品及生物醫藥領域，具體涉及一種牛樟芝深層發酵復方制 品及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 牛樟芝簡稱"樟芝"，學名為AntrodiaCamphorata,俗名牛樟燕、紅樟芝、樟內 燕、樟燕、血靈芝等。野生牛樟芝唯一賴以為生的宿主----臺灣牛樟樹（Cinnamomum kanehirai)，牛樟樹為臺灣獨有之原生珍貴樹種，生長在海拔450米至2000米之間，牛樟芝 生長于老齡牛樟樹干腐朽的中空內部或倒伏樹干的潮濕表面，生長期在每年六至十月，子 實體形態多變化，有板狀、鍾狀、馬蹄狀或塔狀；初生時鮮紅色，漸長變為白色、淡紅褐色、淡 褐色或淡黃褐色。牛樟芝氣芳香味辛苦、平。有祛風行氣、化淤活血、溫中消結、解毒消腫、鎮 靜止痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、提升機體免疫力之效；對于治療胃腸疼痛、腹瀉嘔吐、食物中 毒、毒蕈中毒、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、肝硬化、肝癌等更是有獨特功能。牛樟芝是有許多的 生理活性成分，如多糖體、三萜類化合物、超氧歧化酶、腺苷、蛋白質(含免疫蛋白）、維生素、 微量元素、核酸、凝集素、氨基酸、纖維素、血壓穩定物質等。牛樟芝的有效成分中以多糖和 三萜類化合物為最特別，是其他菇菌無法相比的。樟芝在子實體階段多醣體含量，約2%，具 有免疫生理活性、預防及控制腫瘤等生理活性，主要含P-D-glucan(P-D-葡聚糖)）其作 用是透過激發巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞以及自然殺手細胞等來增強免疫功能，進 而達到抗腫瘤的效果。牛樟芝多糖體中有強心、降血壓、降血糖、抗血栓等功效。由于牛樟 芝在臺灣被視為獨特而珍貴的藥用真菌，因此具有極高的研究和商業價值，也是目前臺灣 最昂貴的野生真菌，在港澳被稱為"神芝"，臺灣民間稱之為"森林中的紅寶石"。
[0003] 茯苓 菌核含0 -茯苓聚糖約占干重93%和三萜類化合物乙酰茯苓酸、茯苓酸、3P-羥基羊 毛甾三烯酸。含大量淀粉，同時含有樹膠、甲殼質、蛋白質、脂肪、留醇、卵磷脂、葡萄糖、腺嘌 呤、組氨酸、膽堿、P-茯苓聚糖分解酶、脂肪酶、蛋白酶等。
[0004] 茯苓醫藥用途極廣。茯苓性平、味甘淡、益脾、安神、利水滲濕，能治療脾虛泄瀉、心 悸失眠、小便不暢、水腫等癥。
[0005] 山藥 山藥富含淀粉、蛋白質、維生素A、B2、C，含有鈣、磷、鐵、碘等微量元素和無機鹽，以 及粘液質、氨基酸、纖維素等。具有健脾胃、補腎肺、滋補強壯的功效。
[0006] 葛根 葛根含異黃酮成分葛根素、葛根素木糖甙、大豆黃酮、大豆黃酮甙及3 _谷留醇、花生 酸，又含多量淀粉、碳水化合物、植物蛋白、多種維生素和礦物質，此外還含有黃酮類物質： 大豆素，大豆甙，還有大豆素-4, 7-二葡萄糖甙，葛根素，葛根素-7-木糖甙，葛根醇，葛根藤 及異黃酮甙等。葛根是藥食同源中草藥，主治傷寒溫熱、頭痛項強(頸僵)、煩熱消渴、泄瀉、 痢疾、麻疹不透、高血壓、心絞痛、耳聾等證。
[0007] 蜂花粉 蜂花粉主要含有：蛋白質20% - 25%，氨基酸總量20%以上，游離氨基酸I% - 2%， 碳水化合物40% - 50%，脂肪5%-10% ;還有豐富的天然維生素、微量元素、酶類、激素、 生物活性物質等多種營養物質。還含有多種礦物質，其中：鉀20?40%、鎂1?20%、鈣1? 15%、鐵1?12%、硅2?10%、磷1?20%，以及大量的的活性蛋白酶、核酸、黃酮類化合物及 其它活性物質等。蜂花粉中的元素可預防和治療高血壓、糖尿病、冠心病和腎臟疾病等。具 有抗動脈硬化、降低膽固醇、解疼、防輻射、抗腫瘤等作用。
[0008] 黃精 黃精中含有黃精多糖甲乙丙3種，由葡萄糖，甘露糖，和半乳糖醛酸組成，其分子量均 大于20萬；黃精中總多糖含量為11. 74%，含有多種留體皂苷和賴氨酸，蘇氨酸，異亮氨酸， 絲氨酸，亮氨酸，谷氨酸，酪氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天門冬氨酸，高絲氨酸，二氨基丁 酸等多種氨基酸和人體的必須元素。藥理作用具有延緩衰老，降血壓，降血糖，降血脂，防止 動脈粥樣硬化，延緩衰老和抗菌等作用，黃精多糖具有免疫激活作用. 佛手 佛手鮮果約含蛋白質1.2%、脂肪1.3%、總糖8. 7%、粗纖維I. 1 %、灰分0.7%、水分 86. 9%，果皮內部含有香豆精類化合物，檸檬內酯、黃酮類化合物還有多種維生素和礦物 質。其中維生素C含量為0. 04%，礦物元素主要有鈣、鎂、鐵、鋅、錳、銅、磷、鉀、鈉、硫等。在 碳水化合物中有多種不同分子量的多糖，具有生理活性作用。
[0009] 枸杞子 枸杞子含有甜菜堿，阿托品，天仙子胺，胡蘿卜素，硫胺素，核黃素，煙酸，維生素C。同 時含氨基酸：天冬氨酸，脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，絲氨酸，甘氨酸，谷氨酸，半胱氨 酸，賴氨酸，精氨酸，異亮氨酸，蘇氨酸，組氨酸，酷氨酸，色氨酸，蛋氨酸。又含牛磺酸，Y-氨 基丁酸，還含鉀、鈣、鈉、鋅、鐵、銅、鉻、鍶、鉛、鎳、鎘、鈷、鎂等天然活性元素。枸杞多糖含量 為7. 09%，具有促進免疫作用。
[0010] 余甘子 余甘子含碳水化合物6. 63%?14. 10%，脂肪0. 19%?1. 09%，灰分0. 62%?0. 70%，蛋白 質0. 69%?2. 18%，維生素B1、維生素B2、維生素C和胡蘿卜素等多種維生素，其中尤以Vc 含量高而著稱，為IOOg果肉中含470?680mg，最高達1814mg/100g，平均含量是柑橘的 100倍，蘋果的160倍，獼猴桃的3?5倍，含有多種氨基酸和豐富的鈣、鐵、鉀、磷、硒、鍺等 人體必須的常量和微量元素，其中鐵、鋅是人體生長和發育的重要元素，硒、鎂、錳具有抗氧 化、防衰老、防癌癥和抗心血管疾病的功能。具有生津止渴、潤肺化痰、消滯化積、降低膽固 醇等作用。
[0011] 枳犋 枳犋每百克含水分59. 1克，糖28. 55克，脂肪0.07克，蛋白質0.03克，維生素C16. 3 毫克。枳犋性味甘酸平，具有清熱，止煩渴，補中益氣、潤五臟、舒筋絡的功效。治醉酒、煩熱、 口渴、嘔吐、二便不利。《本草拾遺》載"止渴除煩，潤五贓，利大小便。
[0012] 根據上述原料有效成分的特點，采用深層發酵技術已有相關的報道。然而很多研 究只是采用常規的方式進行，其制品有效活性成分不高，提取得率不高，牛樟芝的多醣體重 量低，加上采用單一原料，綜合效價協同不廣譜，有效成分未能成分被人體吸收。因此，采 用天然植物山藥粉、葛根粉、蜂花粉、茯苓粉等中草藥作為培養基，營養全面，能不斷補充氮 源、碳源，能有效滿足牛樟芝菌絲體生長對營養的需求，提高獲得大量菌體與代謝產物，大 幅提高多糖體等有效活性成分的含量。由于中草藥佛手、黃精、枸杞、砂仁、余甘子、枳犋子 及蜂王漿具有多種天然活性物質，采用超臨界CO2萃取、酶解工藝，萃取的提取液與牛樟芝 發酵液復合配制的復方制品，尚未見有相關報道。


【發明內容】

[0013] 本發明的目的在于提供一種牛樟芝深層發酵復方制品及其制備方法，優化了牛樟 芝多糖等活性成分的含量，具有產量高、時間短、成本低，可以工業化生產，是一種高效環保 的生物工程生產技術，具有顯著的開發應用前景。
[0014] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 一種牛樟芝深層發酵復方制品，主要由牛樟芝菌絲體發酵液和中草藥提取液配制而 成，所述的中草藥為佛手、黃精、茯苓、枳犋子、余甘子、枸杞和砂仁。
[0015] 牛樟芝菌絲體發酵液和中草藥提取液的重量比為1:1，牛樟芝菌絲體發酵液的濃 度Brix=18. 0-20. 0%，中草藥提取液的濃度Brix=18. 0-20. 0%。（Brix為白利比重計測定的 液體密度） 制備方法包括以下步驟： (1)牛樟芝菌絲體發酵液的制備 培養基： 斜面培養基：馬鈴薯煮汁IOOOmU葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨20g、硫酸鎂0. 2wt. %，pH自然； 深層發酵培養基：茯苓粉1.5wt. %、山藥粉1.5wt. %、葛根粉1.5wt. %、大豆粉2.0wt. %、蜂花粉2.0wt. %、葡萄糖3.0wt. %、酵母粉0.3wt. %、硫酸鎂0.2wt. %、磷酸氫二鉀 0. 3wt. %、氯化鈉 0. 2wt. %、余量為水，pH:5-7,粉末：80-100 目； 制備工藝： 1) 將接種的斜面于26-28°C下培養5-7d; 2) 將長滿菌絲體的斜面接種于深層發酵培養基，搖床180r/min轉速下，26-28°C振蕩 培養2-3d; 3) 種子罐種子培養：按種量10-15%、溫度26-28°C，光照條件：連續黑暗條件，攪拌速度 150-180r/min，無菌空氣通氣量為每分鐘1:0. 5v/v，罐壓0. 04-0. 05MPa，培養40-48h，pH降 至 3. 5-4. 0 ; 4) 發酵培養：接種量15-20%，溫度26-28°C，攪拌速度150-200r/min，無菌空氣通氣量 為每分鐘1: 〇. 5v/v，罐壓0. 04-0. 05MPa，培養40-48h，pH降至3. 5-4. 0,殘糖量降至0. 3% ; 5) 酶解：加入復合蛋白酶0. 5wt. %、纖維素酶0. 5wt. %和淀粉酶0. 5wt. %，50-55°C酶 解浸提2-3h;其中蛋白酶的酶活力2X105U/kg、淀粉酶的酶活力I.OXIO5U/kg、纖維素酶 的酶活力1.5X105U/kg; 6) 均質處理：經酶解處理的牛樟芝發酵液先經膠體磨均質，旋轉磨轉速SOO-IOOOr/ min，再經高壓均質機均質，壓力40-60MPa，最后過200目膜過濾，得到牛樟芝菌絲體發酵 液； (2)中草藥提取液的制備 1) 前處理：按重量百分數計：佛手10%、黃精10%、茯苓15%、枳犋子15%、余甘子20%、枸 杞20%、砂仁10%，分別進行粉碎，細度為3-5mm，混合，按料液比為1:10加水，浸泡3-5小時； 2) 超臨界CO2萃取；萃取條件為：萃取釜壓力24-30MPa，萃取溫度60-80°C，I級分離 釜壓力8-10MPa，II級分離釜壓力6-8MPa，CCV流量120-150L/h; 3) 離心分離得萃取液：轉速2000-3000r/min，時間6-10min; 4) 萃余物酶解提取：將萃余物按料液比為1:10加純凈水，調節pH=4. 5-6. 0,60-80°C 浸煮6-12h，然后降溫至50-55°C，加入纖維素酶，酶解l_2h，再加入淀粉酶，酶解l-2h;升溫 至100-1KTC，滅酶3-5min，過濾得酶解提取液；酶解過程在超聲輔助條件下進行，超聲波 頻率為25-30kHz;所述纖維素酶的酶活力為2. 5萬u/g,酶用量為萃余物重量的1. 0-1. 2% ; 所述淀粉酶的酶活力為1萬u/g，酶用量為萃余物重量的1. 0-1. 2% ; (3 )將牛樟芝菌絲體發酵液、中草藥萃取液和中草藥萃余物酶解提取液混合均勻，經濃 縮，加入蜂王漿，制成復方口服液制品或復方固體制品。
[0016] 復方口服液制品的制備：將牛樟芝菌絲體發酵液、中草藥萃取液和中草藥萃余 物酶解提取液混合均勻，壓力〇.〇9MPa下，減壓濃縮至可溶性固形物含量為10-12%，濃度Brix=18. 0-20. 0%，冷卻至室溫，加入5wt. %蜂王漿，攪拌均勻，均質處理，添加食品調味劑， 調配pH=5. 0-6. 0,用棕色瓶罐裝。
[0017] 復方固體制品的制備：將牛樟芝菌絲體發酵液、中草藥萃取液和中草藥萃余物 酶解提取液混合均勻，壓力〇.〇9MPa下，減壓濃縮至可溶性固形物含量為12-15%，濃度 Brix=20. 0-23. 0%，冷凍干燥制粉，加入5wt. %蜂王漿干粉、10wt. %葡萄糖和15wt. %麥芽 糊精，經混合、制粒、整粒，制成顆粒劑、片劑或膠囊劑。
[0018] 本發明的顯著優點在于：本發明優化了牛樟芝多糖等活性成分的含量，具有產量 高、時間短、成本低，可以工業化生產，是一種高效環保的生物工程生產技術，具有顯著的開 發應用前景。

【具體實施方式】
[0019] 一種牛樟芝深層發酵復方制品，主要由牛樟芝菌絲體發酵液和中草藥提取液配制 而成，所述的中草藥為佛手、黃精、茯苓、枳犋子、余甘子、枸杞和砂仁。
[0020] 牛樟芝菌絲體發酵液和中草藥提取液的重量比為1:1，牛樟芝菌絲體發酵液的濃 度Brix=18. 0-20. 0%，中草藥提取液的濃度Brix=18. 0-20. 0%。
[0021] 制備方法包括以下步驟： (1)牛樟芝菌絲體發酵液的制備 菌種：由臺灣中華海峽兩岸中醫藥合作發展文化協會提供的牛樟芝菌種。
[0022] 培養基： 斜面培養基：馬鈴薯煮汁IOOOmU葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨20g、硫酸鎂0. 2wt. %，pH自然； 深層發酵培養基：茯苓粉1.5wt. %、山藥粉1.5wt. %、葛根粉1.5wt. %、大豆粉2.0wt. %、蜂花粉2.0wt. %、葡萄糖3.0wt. %、酵母粉0.3wt. %、硫酸鎂0.2wt. %、磷酸氫二鉀 0. 3wt. %、氯化鈉 0. 2wt. %、余量為水，pH:5-7,粉末：80-100 目； 制備工藝： 1) 將接種的斜面于26-28°C下培養5-7d; 2) 將長滿菌絲體的斜面接種于深層發酵培養基，搖床180r/min轉速下，26-28°C振蕩 培養2-3d; 3) 種子罐種子培養：按種量10-15%、溫度26-28°C，光照條件：連續黑暗條件，攪拌速度 150-180r/min，無菌空氣通氣量為每分鐘1:0. 5v/v，罐壓0. 04-0. 05MPa，培養40-48h，pH降 至 3. 5-4. 0 ; 4) 發酵培養：接種量15-20%，溫度26-28°C，攪拌速度150-200r/min，無菌空氣通氣量 為每分鐘1: 〇. 5v/v，罐壓0. 04-0. 05MPa，培養40-48h，pH降至3. 5-4. 0,殘糖量降至0. 3% ; 5) 酶解：加入復合蛋白酶0. 5wt. %、纖維素酶0. 5wt. %和淀粉酶0. 5wt. %，50-55°C酶 解浸提2-3h;其中蛋白酶的酶活力2X105U/kg、淀粉酶的酶活力l?0X105U/kg、纖維素酶 的酶活力1.5XIO5U/kg; 6) 均質處理：經酶解處理的牛樟芝發酵液先經膠體磨均質，旋轉磨轉速SOO-IOOOr/ min，再經高壓均質機均質，壓力40-60MPa，最后過200目膜過濾，得到牛樟芝菌絲體發酵 液； 天然牛樟芝與牛樟芝發酵液主要成分檢測對照表

【權利要求】
1. 一種牛樟芝深層發酵復方制品，其特征在于：主要由牛樟芝菌絲體發酵液和中草藥 提取液配制而成，所述的中草藥為佛手、黃精、茯苓、枳犋子、余甘子、枸杞和砂仁。
2. 根據權利要求1所述的牛樟芝深層發酵復方制品，其特征在于：牛樟芝菌絲體發酵 液和中草藥提取液的重量比為1: 1，牛樟芝菌絲體發酵液的濃度Brix=18. 0-20. 0%，中草藥 提取液的濃度Brix=18. 0-20. 0%。
3. -種制備如權利要求1所述的牛樟芝深層發酵復方制品的方法，其特征在于：包括 以下步驟： (1) 牛樟芝菌絲體發酵液的制備 培養基： 斜面培養基：馬鈴薯煮汁l〇〇〇mL、葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨20g、硫酸鎂0. 2wt. %， pH自然； 深層發酵培養基：茯苓粉1.5 wt. %、山藥粉1.5 wt. %、葛根粉1.5 wt. %、大豆粉2.0 wt. %、蜂花粉2.0 wt. %、葡萄糖3.0 wt. %、酵母粉0.3 wt. %、硫酸鎂0.2 wt. %、磷酸氫二鉀 0. 3 wt. %、氯化鈉 0. 2 wt. %、余量為水，pH :5-7,粉末：80-100 目； 制備工藝： 1) 將接種的斜面于26-28°C下培養5-7d ; 2) 將長滿菌絲體的斜面接種于深層發酵培養基，搖床180r/min轉速下，26-28°C振蕩 培養2-3d ; 3) 種子罐種子培養：按種量10-15%、溫度26-28°C，光照條件：連續黑暗條件，攪拌速度 150-180r/min，無菌空氣通氣量為每分鐘1:0. 5v/v，罐壓0. 04-0. 05MPa，培養40-48h，pH降 至 3. 5-4. 0 ; 4) 發酵培養：接種量15-20%，溫度26-28°C，攪拌速度150-200r/min，無菌空氣通氣量 為每分鐘1: 〇. 5v/v，罐壓0. 04-0. 05MPa，培養40-48h，pH降至3. 5-4. 0,殘糖量降至0. 3% ; 5) 酶解：加入復合蛋白酶0. 5wt. %、纖維素酶0. 5wt. %和淀粉酶0. 5 wt. %，50-55°C酶 解浸提2-3h;其中蛋白酶的酶活力2X105U/kg、淀粉酶的酶活力1.0X105 U /kg、纖維素酶 的酶活力1.5X105 U /kg; 6) 均質處理：經酶解處理的牛樟芝發酵液先經膠體磨均質，旋轉磨轉速800-1000r/ min，再經高壓均質機均質，壓力40-60MPa，最后過200目膜過濾，得到牛樟芝菌絲體發酵 液； (2) 中草藥提取液的制備 1) 前處理：按重量百分數計：佛手10%、黃精10%、茯苓15%、枳犋子15%、余甘子20%、枸 杞20%、砂仁10%，分別進行粉碎，細度為3-5mm，混合，按料液比為1:10加水，浸泡3-5小時； 2) 超臨界C02萃取；萃取條件為：萃取釜壓力24-30MPa，萃取溫度60-80°C，I級分離 釜壓力8-10MPa，II級分離釜壓力6-8MPa，CCV流量120-150L/h ; 3) 離心分離得萃取液：轉速2000-3000r/min，時間6-10min ; 4) 萃余物酶解提取：將萃余物按料液比為1:10加純凈水，調節pH=4. 5-6. 0,60-80°C 浸煮6-12h，然后降溫至50-55°C，加入纖維素酶，酶解l_2h，再加入淀粉酶，酶解l-2h ;升溫 至100-1KTC，滅酶3-5min，過濾得酶解提取液；酶解過程在超聲輔助條件下進行，超聲波 頻率為25-30kHz ;所述纖維素酶的酶活力為2. 5萬u/g,酶用量為萃余物重量的1. 0-1. 2% ; 所述淀粉酶的酶活力為1萬u/g，酶用量為萃余物重量的1. o-l. 2% ; (3 )將牛樟芝菌絲體發酵液、中草藥萃取液和中草藥萃余物酶解提取液混合均勻，經濃 縮，加入蜂王漿，制成復方口服液制品或復方固體制品。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于：復方口服液制品的制備：將牛樟芝菌絲體 發酵液、中草藥萃取液和中草藥萃余物酶解提取液混合均勻，壓力〇. 〇9MPa下，減壓濃縮至 可溶性固形物含量為10-12%，濃度Brix=18. 0-20. 0%，冷卻至室溫，加入5wt. %蜂王漿，攪拌 均勻，均質處理，添加食品調味劑，調配pH=5. 0-6. 0,用棕色瓶罐裝。
5. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于：復方固體制品的制備：將牛樟芝菌絲體 發酵液、中草藥萃取液和中草藥萃余物酶解提取液混合均勻，壓力〇. 〇9MPa下，減壓濃縮至 可溶性固形物含量為12-15%，濃度Brix=20. 0-23. 0%，冷凍干燥制粉，加入5 wt. %蜂王漿干 粉、10 wt. %葡萄糖和15 wt. %麥芽糊精，經混合、制粒、整粒，制成顆粒劑、片劑或膠囊劑。
【文檔編號】A23L1/28GK104473145SQ201410791469
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月19日 優先權日:2014年12月19日
【發明者】郭震宇, 郭耀榮, 吳松剛, 黃建忠, 林金科 申請人:福建華爾康生物科技有限公司