一種木聚糖酶的液態深層發酵方法

一種木聚糖酶的液態深層發酵方法
【專利摘要】本發明提供了一種木聚糖酶的液態深層發酵方法，屬于生物酶制劑生產【技術領域】。本發明以玉米芯為主要原料，利用玉米芯稀酸汽爆料水浸液為誘導物來源，采用黑曲霉液態深層發酵法，包括：a）菌種的制備及擴大培養，b）補料發酵培養，c）木聚糖酶的提純和d）發酵液殘渣的處理，特別地，在b）補料發酵過程中連續流加玉米芯稀酸汽爆料水浸液為誘導的培養基，同時在一個發酵周期內間歇排出發酵醪液，經板框過濾，超濾濃縮，添加防腐劑后，得液體木聚糖酶產品。本發明所得木聚糖酶酶活力提高60~70%，產量提高40~50%，在原料消耗及能耗不增加的情況下，大幅度提高產品酶活力和出產率，增加產能，提高設備利用率，降低單位酶活力發酵成本。
【專利說明】一種木聚糖酶的液態深層發酵方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物酶制劑生產【技術領域】，具體地涉及一種木聚糖酶的液態深層發酵方法。

【背景技術】
[0002]木聚糖酶是指可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括外切β-1，4-木聚糖酶、內切β-1,4-木聚糖酶和β_木聚糖酶。木聚糖酶在飼料、食品、造紙、紡織、醫藥及能源等領域有著廣泛的應用。木聚糖酶用作飼料酶制劑，可以有效解除木聚糖的抗營養作用，促進畜禽對粗飼料的消化吸收。木聚糖酶作為新型的紙漿漂白助劑，降低漂白用氯，解決紙漿工業中的環境污染問題。在纖維素燃料乙醇的生產實踐中，添加木聚糖酶可剝離木質素與纖維素之間的聚合態，易于酶解過程中的酶與底物的充分接觸，利于酶解反應的發生，同時能夠分解半纖維素成為酵母可利用的單糖，提高出酒率，降低纖維乙醇的成本。隨著纖維素乙醇產業化進程的加快，木聚糖酶的開發研究更加備受關注。
[0003]木聚糖酶的生產菌種主要由細菌、真菌和霉菌。其中，霉菌具有許多表達木聚糖酶的基因，產酶水平高于酵母菌和細菌，在木聚糖酶的發酵方面應用最為廣泛。木聚糖酶主要通過以上微生物發酵生產獲得，根據發酵工藝的不同，可分為固態發酵和液態發酵兩種。固態發酵是傳統的發酵方式，菌種大多是霉菌，具有控制簡單、成本較低、無污染、產率較高等優點，但是固態發酵同時也存在以下缺點:不易控制，酶系復雜，纖維素等酶含量高，難以精酶化等。液態深層發酵是液態發酵的常用發酵方式，已經成為發酵工業的主導方式，該方法便于在生產過程中進行實時檢測、控制，易于擴大生產規模。同時，由于液體輸送方便，便于機械化操作，產品也易于提取精制。
[0004]CN 101182470 A公開了一種制備木聚糖酶的液態深層發酵方法，采用黑曲霉發酵法，其特征在于將適量黑曲霉菌株無菌條件下接入不銹鋼母罐中，生產發酵罐加入發酵培養基至罐體積70?75% ;培養發酵:30°C，15(T200r/min，通風0.Γ?.5VVM，70?80Η，在發酵中后期4(Γ60Η之間補充營養物質；停止發酵:發酵至7(Γ80Η，依據鏡檢菌體形態，若菌體開始自溶即停止發酵；發酵液主要有三種處理方式:酶粗品的鹽析法和噴霧干燥法，絮凝-超濾法制得精制固體酶和精制液態酶。液態深層發酵比固態發酵的酶活力要高出1(Γ30%，粗酶每噸生產成本降低20%以上。該發明所得木聚糖酶的酶活力提高有限，可能是由于產酶階段發酵罐中的誘導物對木聚糖酶合成的促進作用不明顯導致的。
[0005]高效生產木聚糖酶的因素有很多，關鍵因素是選擇合適的誘導底物和最佳培養基組成。在發酵過程中，還有一些因素影響著木聚糖酶的產生，如底物的可接近性、低聚木糖的釋放速率和數量及化學特性，還有所能產生的木糖量等。若酶與底物結合得緊密，則會有一部分木聚糖酶因結合在不溶性底物上而在處理酶液時被丟失。因此酶與底物結合的緊密程度也會影響到木聚糖酶的產量。另外，微生物菌體本身產生的代謝酶(如蛋白酶、糖苷轉移酶等)都會影響到木聚糖酶的產量。
[0006]我國具有豐富的玉米芯、甘蔗渣、小麥麩、秸桿等富含半纖維素類自然資源的農林廢棄物，長期以來未受到充分重視和開發利用。而現有技術生產木聚糖酶的成本仍比較高，而大多數合成原料價格又比較貴，如何利用廉價的纖維素材料高效生產木聚糖酶是研究者和生產者關注的重點。


【發明內容】

[0007]本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術的不足，提供一種木聚糖酶液態深層發酵方法，在原料消耗及能耗不增加的情況下，大幅度提高產品酶活力和出產率，增加產能，提高設備利用率，降低單位酶活力發酵成本。
[0008]為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:一種木聚糖酶的液態深層發酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態深層發酵法，具體包括以下步驟:
a)菌種的制備及擴大培養:將黑曲霉菌株Aspergillusniger CGMCC N0.5833轉接至PDA斜面培養基上，30 0C，培養4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養基(121?124。。，滅菌30min)中，于180?220r/min，28?32°C條件下，培養18?24h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3、.5% (v/v)的接種量接入一級種子罐中，于28?32°C，通氣比1:
0.6、.8 (v/v)的條件下，培養If 20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以8?10% (v/V)的接種量接入二級種子罐，于28?32°C，通氣比1:0.6、.8 (v/v)的條件下，培養8?12h，得到二級種子液；
b)補料發酵培養:在發酵罐中加入發酵基礎培養基，裝料系數為5(Γ60%(ν/ν)，調節pH值為4.5^5.0,于12f 124°C，滅菌30min ;待培養基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發酵培養基體積的10?15%的接種量接入所述二級種子液，接種后(TlOh，通氣比為1:0.6?1.5(v/V)，攪拌轉速為15(T200r/min，培養溫度為30?32°C;接種1h以后，通氣比1:0.5?1.0 (v/V)，攪拌轉速10(T200r/min，培養溫度28?30°C ;當還原糖濃度在0.1% (w/w)以下時，開始加入補料培養基進行補料，補料速率為每小時補料量為發酵培養基的1.2^1.6%(w/w)，控制還原糖的濃度在0.2% (w/w)以下；當發酵液體積達到發酵罐體積的80%時進行排料，至發酵液體積達發酵罐體積的70%時停止排料，一個發酵周期內重復排料操作，發酵周期為5?7天;
c)木聚糖酶的提純:發酵結束，將發酵液經板框壓濾機進行過濾，所得過濾液用有機膜進行超濾，濃縮至所需倍數；然后加入防腐劑，得液體木聚糖酶產品；
d)發酵液殘渣的處理:將經過板框壓濾機所得的發酵液殘渣進行烘干處理，使之含水量為10?15% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
[0009]步驟a)中所述三角瓶種子培養基、一級種子罐及二級種子罐的組成均為，以質量百分比計，葡萄糖1.5%，麩皮4%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，余量為水；
步驟b)中所述發酵基礎培養基組成為，以質量百分比，玉米芯5.(Γ7.0%，麩皮
1.0?2.0%，玉米漿1.5?3.0%，硫酸銨0.4?0.6%，磷酸二氫鉀0.2?0.4%，硫酸鎂0.1?0.3%，氯化鈣0.05、.15%，微量元素0.05、.2%，余量為水。
[0010]進一步的，所述玉米芯的粒度小于0.5mm。
[0011]步驟b)中所述補料培養基組成為，質量百分比計，葡萄糖3.(Γ5.0%，玉米漿
2.0?3.0%，硫酸銨0.6?0.8%，磷酸二氫鉀0.4?0.8%，硫酸鎂0.2?0.4%，氯化鈣0.1?0.3%，微量元素0.05、.1%，其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
[0012]進一步的，所述微量元素的組成為，質量百分比計，鑰酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%，余量為水。
[0013]進一步的，所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯，于0.5?1.0% (w/w)的硫酸溶液中浸泡,6?1kg壓力下保持10?15min,進行汽爆處理，然后添加水分，使汽爆處理后的玉米芯固形物含量保持在6?10% (w/w)，浸泡f2h，利用板框壓濾機進行過濾，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
[0014]進一步的，步驟c)中所述有機膜為膜分子量為10000道爾頓的有機膜。
[0015]進一步的，步驟c)中所述防腐劑的組分配比為:氯化鈉7g?10g，苯甲酸鈉
0.1g?0.3g。
[0016]由于本發明一種木聚糖酶的液態深層發酵方法，包括a)菌種的制備及擴大培養，
b)補料發酵培養，c)木聚糖酶的提純和d)發酵液殘渣的處理，該方法無廢棄物排出，環保無污染，具有以下有益效果:
(O該方法能夠在原料消耗及能耗不增加的情況下，增加產能，提高設備利用率，降低單位酶活力發酵成本，所得產品的酶活力提高6(Γ70%，出產率提高4(Γ50% ；
(2)本發明以玉米芯為主要原料通過液態深層發酵生產木聚糖酶，為玉米芯的綜合開發與利用提供了新方法和新途徑；
(3)本發明在補料過程中所采用的玉米芯稀酸汽爆料水浸液中含有一定量的低聚木糖，在木聚糖酶的發酵過程中有利于誘導黑曲霉菌株產酶；與以往直接以粉碎后的玉米芯補料相比，降低了玉米芯的粉碎成本，同時以液體方式補料避免了玉米芯顆粒堵塞管道的風險；
(4)本發明所采取的連續流加、間歇放料模式，可有效解除發酵過程中營養物質的匱乏及產物的反饋抑制，提高木聚糖酶的發酵水平；
(5)本發明所用原料玉米芯為可再生資源，且來源廣泛，價格低廉，以其為原料發酵生產木聚糖酶，不僅能夠變廢為寶，而且還降低了木聚糖酶的生產成本，所得殘渣還可做飼料添加劑使用。

【具體實施方式】
[0017]下面結合實施例對本發明做一步的說明。
[0018]實施例一
下面以1m3發酵罐為例對本發明做進一步詳細地說明。
[0019]本發明木聚糖酶的液態深層發酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態深層發酵法，可按以下步驟進行:
a)菌種的制備及擴大培養:將黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833轉接至PDA斜面培養基上，于30°C條件下培養4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養基(121?124°C下，滅菌30 min)中，搖床轉速為180r/min，28°C條件下培養24h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3% (v/v)的接種量接入一級種子罐中，于28°C,通氣比1:0.8 (v/v)的條件下，培養20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以8% (v/v)的接種量接入二級種子罐，于28°C，通氣比1:0.6 (v/v)的條件下，培養10h，得到二級種子液；此步驟中，所述的三角瓶種子培養基、一級種子罐及一級種子罐的組成均為，以質量百分比，葡萄糖1.5%，麩皮4%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，余量為水；
b)補料發酵培養:在1m3發酵罐中，裝入5m3發酵基礎培養基(以質量百分比計，粒度小于0.5mm的玉米芯6.0%，麩皮1.0%，玉米漿2.0%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.1%，氯化鈣0.12%，微量元素0.05%，余量為水)，將所述發酵基礎培養基的pH值調節為5.0，于12f 124°C下滅菌30min ;待培養基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發酵培養基體積10%的接種量接入所述二級種子液，接種后6h，通氣比為1:0.6(v/v)，攪拌轉速為200r/min，培養溫度為320C ;接種后20h，通氣比為1:0.5 (v/v)，攪拌轉速為150r/min，培養溫度為29°C ;發酵35h時，還原糖濃度為0.05%(w/w)，加入補料培養基進行補料，補料速率為60L/h,還原糖的濃度控制在0.15% (w/w);當發酵液體積達到8m3時,開始進行排料,至發酵液體積達7m3時，停止排料；一個發酵周期內重復排料操作，發酵周期為6天；
其中，所述補料培養基的質量百分比組成為，葡萄糖3.0%，玉米漿2.5%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.3%，氯化鈣0.1%，微量元素0.08%,其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液，調節PH值為4.7，于12fl24°C下滅菌30min。所述微量元素的質量百分比組成為，鑰酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯，于0.7%(w/w)硫酸溶液中浸泡，8kg壓力下保持12min，進行汽爆處理，然后添加一定量的水分，使處理后的玉米芯固形物含量保持在8% (w/w)，浸泡1.5h，利用板框壓濾機進行過濾，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提純:發酵結束，將發酵液經板框壓濾機進行過濾，所得過濾液用膜分子量為10000道爾頓的有機膜進行超濾，濃縮至所需倍數；然后加入防腐劑，其組分配比為氯化鈉7g，苯甲酸鈉0.lg，得液體木聚糖酶產品；
d)發酵液殘渣的處理:將經過板框壓濾機所得的發酵液殘渣進行烘干，使之含水量在10% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
[0020]木聚糖酶的酶活力單位統一定義(U):在pH=4.8，50°C條件下，每分鐘降解底物生成I μ moL木糖所需的酶量為I個活力單位。
[0021]經測定，本實施例所得木聚糖酶的酶活力為2568.35U/mL，單罐單批發酵液總量12.4噸；與現有的木聚糖酶液態深層發酵工藝相比，木聚糖酶的酶活力提高了 60%，出產率提高40%，單位酶活力發酵成本降低8%。
[0022]實施例二
下面以20m3發酵罐為例對本發明做進一步詳細地說明。
[0023]本發明木聚糖酶的液態深層發酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態深層發酵法，可按以下步驟進行:
a)菌種的制備及擴大培養:將黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833轉接至PDA斜面培養基上，于30°C條件下培養4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養基(121?124°C下，滅菌30 min)中，搖床轉速為200r/min，30°C條件下培養20h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.5% (v/v)的接種量接入所述一級種子罐中，于30°C，通氣比1:0.7的條件下，培養18h，得到一級種子液；將所述一級種子液以10% (v/v)的接種量接入二級種子罐，于30°C，通氣比1:0.7的條件下，培養12h，得到二級種子液。其中，所述的三角瓶種子培養基、一級種子罐及二級種子罐的組成均為:以質量百分比，葡萄糖1.5%，麩皮4%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，余量為水；
b)補料發酵培養:在20m3發酵罐中，裝入發酵基礎培養基12m3(以質量百分比，粉碎粒度小于0.5mm的玉米芯7.0%，麩皮1.5%，玉米漿3.0%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.2%，氯化鈣0.05%,微量元素0.1%，余量為水)，將上述培養基調節pH值為4.8，于12f 124°C下滅菌30min，；待培養基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發酵培養基體積的12% (v/v)的接種量接入所述二級種子液,接種后9h,通氣比為1:1，攪拌轉速為160r/min,培養溫度為30°C;接種后15h，通氣比為1:0.8，攪拌轉速為110r/min，培養溫度為28°C;發酵32h，還原糖濃度為0.08%，加入補料培養基進行補料，補料速率為每小時補料量為發酵基礎培養基1.4% (w/w),還原糖控制在0.1% (w/w);當發酵液體積達到發酵罐體積的80%時進行排料，至發酵液體積達發酵罐體積的70%時停止排料，一個發酵周期內重復排料操作，維持發酵液體積在發酵罐體積的70%之間，發酵周期為7天；
其中，所述補料培養基的質量百分比組成為，葡萄糖4.0%，玉米漿2.0%，硫酸銨0.7%，磷酸二氫鉀0.7%，硫酸鎂0.4%，氯化鈣0.2%，微量元素0.06%,其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液，調節PH值為4.5，于12f 124°C下滅菌30min。所述微量元素的質量百分比組成為，鑰酸銨0.04%,硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯，于0.5%(w/w)硫酸溶液中浸泡，6kg壓力下保持lOmin，進行汽爆處理，然后添加一定量的水分，使處理后的玉米芯固形物含量保持在6% (w/w)，浸泡lh，利用板框壓濾機進行過濾，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提純:發酵結束，將發酵液經板框壓濾機進行過濾，所得過濾液用膜分子量為10000道爾頓的有機膜進行超濾，濃縮至所需倍數；然后加入防腐劑，其組分配比為氯化鈉8g，苯甲酸鈉0.2g，得液體木聚糖酶產品；
d)發酵液殘渣的處理:將經過板框壓濾機所得的發酵液殘渣進行烘干，使之含水量在13% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
[0024]經測定，本實施例所得木聚糖酶的酶活力為2968.04U/mL，單罐單批發酵液總量32.5噸；與現有的木聚糖酶液態深層發酵工藝相比，木聚糖酶的酶活力提高了 65%，出產率提高46%，單位酶活力發酵成本降低6%。
[0025]實施例三
下面以50m3發酵罐為例對本發明做進一步詳細地說明。
[0026]本發明木聚糖酶的液態深層發酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態深層發酵法，可按以下步驟進行:
a)菌種的制備及擴大培養:將黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833轉接至PDA斜面培養基上，于30°C條件下培養4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養基(121?124°C下，滅菌30 min)中，搖床轉速為220r/min，32°C條件下培養18h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.4% (v/v)的接種量接入所述一級種子罐中，于32°C，通氣比1:0.6的條件下，培養20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以9% (v/v)的接種量接入二級種子罐，于32°C，通氣比1:0.8的條件下，培養8h，得到二級種子液。其中，所述三角瓶種子培養基、一級種子罐及二級種子罐的組成均為:以質量百分比，葡萄糖1.5%，麩皮4%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，余量為水；
b)補料發酵培養:在60m3發酵罐中，裝入發酵基礎培養基36m3(以質量百分比，粉碎粒度小于0.5mm玉米芯5.0%，麩皮2.0%，玉米漿1.5%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.3%，氯化鈣0.15%，微量元素0.2%，余量為水)，將上述培養基調節pH值為4.5，于12f 124°C下滅菌30min ;待培養基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發酵培養基體積的15%(v/v)的接種量接入所述二級種子液,接種后4h,通氣比為1:1.5,攪拌轉速為150r/min,培養溫度為32°C ;接種后llh，通氣比為1:1，攪拌轉速為100r/min，培養溫度為29°C ;發酵30h，還原糖濃度為0.02%,加入補料培養基進行補料，補料速率為每小時補料量為發酵基礎培養基1.6% (w/w),還原糖控制在0.12% (w/w);當發酵液體積達到發酵罐體積的80%時進行排料，至發酵液體積達發酵罐體積的70%時停止排料，一個發酵周期內重復排料操作，維持發酵液體積在發酵罐體積的80%之間，發酵周期為5天；
其中，所述補料培養基的質量百分比組成為，葡萄糖5.0%，玉米漿3.0%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.4%，氯化鈣0.3%，微量元素0.1%，其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液，調節PH值為4.5，于12fl24°C下滅菌30min。所述微量元素的質量百分比組成為，鑰酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯，于1.0% (w/w)硫酸溶液中浸泡，1kg壓力下保持15min，進行汽爆處理，然后添加一定量的水分，使處理后的玉米芯固形物含量保持在10% (w/w)，浸泡2h，利用板框壓濾機進行過濾，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提純:發酵結束，將發酵液經板框壓濾機進行過濾，所得過濾液用膜分子量為10000道爾頓的有機膜進行超濾，濃縮至所需倍數；然后加入防腐劑，其組分配比為氯化鈉10g，苯甲酸鈉0.3g，得液體木聚糖酶產品；
d)發酵液殘渣的處理:將經過板框壓濾機所得的發酵液殘渣進行烘干，使之含水量在15% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
[0027]經測定，本實施例所得木聚糖酶的酶活力為3485.65U/mL，單罐單批發酵液總量97.6噸；與現有的木聚糖酶液態深層發酵工藝相比，木聚糖酶的酶活力提高了 70%，出產率提高50%，單位酶活力發酵成本降低7.5%。
【權利要求】
1.一種木聚糖酶的液態深層發酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態深層發酵法，其特征在于，它具體包括以下步驟: a)菌種的制備及擴大培養:將黑曲霉菌株nigerCGMCC N0.5833轉接至PDA斜面培養基上，300C，培養4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入于12f 124°C，滅菌30min的三角瓶種子培養基中，于18(T220r/min，28?32°C條件下，培養18?24h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3^0.5% (v/v)的接種量接入所述一級種子罐中，于28?32°C，通氣比1:0.6^0.8的條件下，培養18?20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以8?10% (v/v)的接種量接入二級種子罐，于28?32°C，通氣比1:0.6^0.8的條件下，培養8?12h，得到二級種子液； b)補料發酵培養:在發酵罐中加入發酵基礎培養基，裝料系數為5(Γ60%(ν/ν)，調節pH值為4.5^5.0,12Γ124°0，滅菌30min ;待培養基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發酵培養基體積的1(Γ?5%(ν/ν)的接種量接入所述二級種子液，接種后(TlOh，通氣比為1:0.6?1.5，攪拌轉速為15(T200r/min，培養溫度為3(T32°C;接種1h以后，通氣比1:0.5?1.0，攪拌轉速10(T200r/min，培養溫度28?30°C;當還原糖含量在0.1% (w/w)以下時，開始加入補料培養基進行補料，補料速率為每小時補料量為發酵培養基1.2^1.6%(w/w)，控制還原糖的含量在0.2% (w/w)以下；當發酵液體積達到發酵罐體積的80%時進行排料，至發酵液體積達發酵罐體積的70%時停止排料，一個發酵周期內重復排料操作，發酵周期為5?7天； c)木聚糖酶的提純:發酵結束，將發酵液經板框壓濾機進行過濾，所得過濾液用有機膜進行超濾，濃縮至所需倍數；加入防腐劑，得液體木聚糖酶產品； d)發酵液殘渣的處理:將經過板框壓濾機所得的發酵液殘渣進行烘干，使之含水量在10?15% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
2.如權利要求1所述的木聚糖酶的液態深層發酵方法，其特征在于:步驟a)中所述三角瓶種子培養基、一級種子罐及二級種子罐的質量百分比組成均為，1.5%葡萄糖，4%麩皮，1%玉米漿，0.5%酵母粉，余量為水。
3.如權利要求1所述的木聚糖酶的液態深層發酵方法，其特征在于:步驟b)中所述發酵基礎培養基的質量百分比組成為，玉米芯5.(Γ7.0%，麩皮1.(Γ2.0%，玉米漿1.5^3.0%，硫酸銨0.4?0.6%，磷酸二氫鉀0.2?0.4%，硫酸鎂0.1?0.3%，氯化鈣0.05?0.15%，微量元素0.05?0.2%，余量為水。
4.如權利要求3所述的木聚糖酶的液態深層發酵方法，其特征在于:所述玉米芯的粒度小于0.5mmο
5.如權利要求1所述的木聚糖酶的液態深層發酵方法，其特征在于:步驟b)中所述補料培養基的質量百分比組成為，葡萄糖3.(Γ5.0%，玉米漿2.(Γ3.0%，硫酸銨0.6^0.8%，磷酸二氫鉀0.4?0.8%，硫酸鎂0.2?0.4%，氯化鈣0.1?0.3%，微量元素0.05?0.1%，其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
6.如權利要求5所述的木聚糖酶的液態深層發酵方法，其特征在于:所述微量元素的質量百分比組成為，鑰酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%。
7.如權利要求5所述的木聚糖酶的液態深層發酵方法，其特征在于:所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯,于0.5"?.0% (w/w)硫酸溶液中浸泡，6?10kg壓力下保持l(Tl5min，進行汽爆處理，然后添加一定量的水分，使處理后的玉米芯固形物含量保持在6?10% (w/w)，浸泡f2h，利用板框壓濾機進行過濾，SP得玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
8.如權利要求1所述的木聚糖酶的液態深層發酵方法，其特征在于:步驟c)中所述有機膜為膜分子量為10000道爾頓的有機膜。
9.如權利要求1所述的木聚糖酶的液態深層發酵方法，其特征在于:步驟c)中所述防腐劑的組分配比為:氯化鈉7g?10g，苯甲酸鈉0.lg^0.3g。
【文檔編號】C12R1/685GK104357428SQ201410638530
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】王林風, 趙子高, 閆德冉, 楊付偉, 王蕊 申請人:河南天冠纖維乙醇有限公司