用于檢測鮑曼不動桿菌的lamp試劑盒及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鮑曼不動桿菌的LAMP試劑盒及其專用引物與其在檢測鮑曼不動桿菌中的應用。用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的五條引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2(F3)、SEQ ID NO：3(B3)、SEQ ID NO：4(FIP)、SEQ ID NO：5(BIP)和SEQ ID NO：6(LF)所示。本發明可實現在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢出鮑曼不動桿菌，無需復雜儀器，為鮑曼不動桿菌的檢測提供了新的技術平臺。本發明可用于畜牧業生產單位、基層醫療衛生單位和各疾病預防控制中心篩查和檢測鮑曼不動桿菌，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。
【專利說明】用于檢測鮑曼不動桿菌的LAMP試劑盒及其專用引物
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】中細菌的分子生物學檢測方法，特別是涉及一種鮑曼不 動桿菌的LAMP試劑盒及其專用引物與其在檢測鮑曼不動桿菌中的應用。
【背景技術】
[0002] 鮑曼不動桿菌臨床感染及治療現狀
[0003] 鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab)是一種非發酵、需氧的革蘭陰性桿 菌，屬于不動桿菌屬（Acinetobacter)。鮑曼不動桿菌主要存在于醫院環境中，是醫院獲得 性肺炎和呼吸機相關性肺炎的主要致病菌之一，特別是重癥監護病房的患者，感染鮑曼不 動桿菌的機率更高，這與患者免疫力低下、患嚴重基礎性疾病、接受呼吸機等侵入性治療以 及大量使用廣譜抗菌藥物關系密切。此外，有研究表明，醫院公共設施的污染，特別是呼吸 機、靜脈導管等的污染，通過醫務工作者手的交叉感染，是導致醫院獲得性鮑曼不動桿菌感 染的主要因素。
[0004] 鮑曼不動桿菌的可怕之處在于它不僅曾引起世界范圍內的多次爆發流行，更因其 不斷增加的耐藥性使廣大臨床工作者束手無策。鮑曼不動桿菌曾經對青霉素、頭孢菌素、 氨基糖苷類、喹諾酮類抗生素等均敏感，但隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用等原 因，世界各地鮑曼不動桿菌泛耐藥菌（pan-drug resistant Acinetobacter baumannii， F1DR-AB)或多重耐藥菌（multi-drug resistant Acinetobacter baumannii，MDR-Ab)的 報道層出不窮，甚至對之前一直有較好治療效果的亞胺培南（Imipenem，IP)和美羅培南 (Meropenem，MP)等碳青霉烯類抗生素耐藥性的菌株亦屢見不鮮。一些較新的抗菌藥物如 多粘菌素、替加環素等亦出現了耐藥性報道。
[0005] 因此，快速準確診斷病原菌，予以規范合理的抗生素治療，是控制鮑曼不動桿菌感 染的有效措施。
[0006] LAMP技術介紹
[0007] 環介導恒溫核酸擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 由 Notomi(Notomi T, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000 ;28(12):63.)發明的一種新型基因擴增技術。具體方法是針對靶基因 (DNA或者cDNA)的6個區域，設計4-6種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下 進行基因擴增反應，結果直接靠擴增副產物焦磷酸鎂的沉淀濁度進行判斷。LAMP技術具有 快速高效、特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測直觀和設備要求低等特點。
[0008] 自2000年發明以來，LAMP技術已被迅速用于病原微生物檢測、遺傳病診斷、 食品安全等領域的分子生物學檢測領域。近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原 體檢測。2011年Nakauchi M等建立了基于LAMP技術的HlNl實驗室快速診斷方法 (Nakauchi M, et al. Evaluation of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays for rapid diagnosis of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus. J Med Virol. 2011 Jan ;83 (I) :10-5.)。目前，LAMP技術已被廣泛用于肺炎支原體 (Gotoh K,et al.Assessment of the loop-mediated isothermal amplification assay for rapid diagnosis of Mycoplasma pneumoniae in pediatric community-acquired pneumonia. Jpn J Infect Dis. 2013 ;66 (6): 539-42.)、結核桿菌（Kumar P，et al.Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and sensitive diagnosis of tuberculosis. Pandya D,Singh N, J Infect. 2014 Sep 9. [Epub ahead of print])、SARS(Poon LL,et al. Rapid detection of the severe acute respiratory syndrome (SARS)coronavirus by a loop-mediated isothermalamplification assay. Clin Chem. 2004 Jun ；50(6):1050-2.) > HIV(Curtis KA, et al. Real-Time Detection of HIV-2 by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. J Clin Microbiol.2014 Jul ;52(7):2674-6.)等病原體的檢測及相關疾病的診斷中。目前，國內 外均未見有用于檢測鮑曼不動桿菌的LAMP試劑盒及其專用引物。
【發明內容】
[0009] 本發明提供了用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的引物，以實現鮑曼不動桿菌 的批量檢測，提高檢測的特異性和靈敏度。
[0010] 本發明所提供的用于檢測鮑曼不動桿菌的LAMP引物，是根據鮑曼不動桿菌0 -內 酰胺酶0XA-51基因（Wara^51)的特異性保守序列設計的，用以定性檢測純菌、患者痰液、血 液及其它分泌物等樣品中的鮑曼不動桿菌，所述LAMP引物由五條引物組成，包括外引物F3 和B3、內引物FIP和BIP、以及環引物LF的組合；所述鮑曼不動桿菌Waffl^51基因的特異性 保守靶序列如序列表中SEQ ID NO :1所示。
[0011] 具體來講，所述用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的五條引物的核苷酸序列如 序列表中 SEQ ID N0:2(F3)、SEQ ID N0:3(B3)、SEQ ID N0:4(FIP)、SEQ ID N0:5(BIP)和 SEQ ID NO :6 (LF)所示。
[0012] 所述的LAMP引物，為F3和B3、FIP和BIP、以及LF按摩爾比5:40:20的組合物。
[0013] 本發明的第二個目的是提供一種用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的試劑盒。
[0014] 本發明所提供的試劑盒，包括上述用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的引物。
[0015] 具體來講，所述試劑盒包括以下用于25 ill反應體系的試劑：20mM Tris ? HCl (pH 8.8)，10禮1((：1，1〇1111(順4)2504,0.1%了￥661120,0.811甜菜堿〇^七31116)，811111%50 4，1.41111 dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量為：5pmol 引物 F3 和 B3,40pmol 引物 FIP 和 BIP，20pmol 引物 LF。
[0016] 為方便檢測，所述試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為鮑曼 不動桿菌標準株基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系，如雙蒸水。
[0017] 上述LAMP引物或試劑盒在鮑曼不動桿菌LAMP檢測中的應用也屬于本發明的保護 范圍。
[0018] 本發明的第三個目的是提供一種鮑曼不動桿菌的LAMP檢測方法。
[0019] 本發明所提供檢測方法，可包括以下步驟：
[0020] 1)以待測樣品基因組DNA為模板，在上述引物的引導下進行LAMP擴增，25 iU LAMP 反應體系包括：待測樣品基因組 DNA 2iil，20mM Tris .HCKpH 8.8)，10mM KC1， IOmM(NH4)2S04,0. l%Tween20,0.8M甜菜堿（betaine)，8mM MgS04，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量為：5pmol 引物 F3 和 B3,40pmol 引物 FIP 和 BIP，20pmol 引物 LF ;LAMP擴增條件為：置60-65°C恒溫40-50min ;
[0021] 2)反應結束后進行結果判定：在反應液中添加鈣黃綠素指示劑，根據反應液的顏 色變化判斷結果，綠色表示待測樣品中存在鮑曼不動桿菌，橙色表示待測樣品中不存在鮑 曼不動桿菌；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應前后反應液的濁度變化來 判斷結果，濁度上升表示待測樣品中存在鮑曼不動桿菌，濁度無變化表示待測樣品中不存 在鮑曼不動桿菌。
[0022] 在上述檢測方法中，所述步驟1)中的LAMP反應體系中還設有陽性對照和陰性對 照，所述陽性對照為鮑曼不動桿菌標準株基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增 體系，如雙蒸水；所述LAMP擴增條件優選為：置65°C恒溫50min。
[0023] 所述步驟2)中鈣黃綠素指示劑的添加量可為IiU (終反應體系為26 yl)，含有 0. 5mM興黃綠素和IOmM氯化猛。
[0024] 本發明提供了一種鮑曼不動桿菌的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。本發 明檢測的鮑曼不動桿菌原理是采用LAMP技術，對鮑曼不動桿菌基因組blaOXA-51基因進行 檢測。blaOXA-5為鮑曼不動桿菌天然攜帶的、編碼具有碳青霉烯類抗生素水解能力的D類 3 _ 內醜胺酶（Carbapenem hydrolyzing class D 0-lactamase，CHDL)，可作為鮑曼不動 桿菌標志基因之一。
[0025] 本發明具有以下優點：
[0026] 1、操作簡單，設備要求低。本發明只需將檢測樣品和檢測反應液放入60_65°C恒溫 水浴鍋中孵育40-50分鐘后即可判斷結果。檢測結果可通過肉眼觀察（鈣黃綠素顯色）或 濁度儀判斷，無需復雜儀器。
[0027] 2、特異性好，靈敏度高。本發明設計的五條引物對鮑曼不動桿菌靶序列特異區域 的識別保證了 LAMP擴增的高度特異性，S卩LAMP能從相差僅1個核苷酸的基因標本中找出 相應的靶序列進行擴增；靈敏度可比普通PCR高10-100倍。
[0028] 3、檢測時間短、擴增效率高。整個LAMP擴增反應可在一小時內完成，目的基因產 率可達到0. 5mg/mL。
[0029] 綜上所述，本發明可實現在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢出鮑 曼不動桿菌，無需復雜儀器，為鮑曼不動桿菌的檢測提供了新的技術平臺。本發明可用于畜 牧業生產單位、基層醫療衛生單位和各疾病預防控制中心篩查和檢測鮑曼不動桿菌，具有 廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。
[0030] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031] 圖1為五套引物的LAMP反應曲線；
[0032] 圖2為鮑曼不動桿菌LAMP檢測方法特異性的濁度儀檢測結果；
[0033] 圖3為鮑曼不動桿菌LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果；
[0034] 圖4為鮑曼不動桿菌LAMP檢測方法靈敏度的鈣黃綠素指示劑檢測結果；
[0035] 圖5為鮑曼不動桿菌普通PCR檢測方法靈敏度的檢測結果。
【具體實施方式】
[0036] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見： ((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J. ,Russell,David ff. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)〇
[0037] 所述百分比濃度如無特別說明均為質量/質量（W/W，單位g/lOOg)百分比濃度、 質量/體積（W/V，單位g/100mL)百分比濃度或體積/體積（V/V，單位mL/100mL)百分比濃 度。
[0038] 實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達 到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的 來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提 示替換使用。
[0039] 所用引物均由北京生工生物公司合成。
[0040] 實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的 操作過程，實施例將有助于理解本發明，但是本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0041] 實施例1、用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的引物設計
[0042] 從NCBI 的核酸數據庫 GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)檢索獲得鮑曼不 動桿菌的￠-內酰胺酶0XA-51基因（blaQXA_51)序列（GenBank號：DQ385606. 1)，通過BLAST 軟件進行同源性分析，獲得鮑曼不動桿菌￠-內酰胺酶0XA-51基因（Waw^51)的特異性保 守序列（序列表中SEQ ID NO :1)，再根據該特異性保守序列，用軟件Primer design V4設 計用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的引物，設計出五套引物，經過實驗對比，最終選取 了引物組合0XA-4,引物序列如表1所示。
[0043] 表1用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的引物組合0XA-4
[0044]
【權利要求】
1. 用于檢測鮑曼不動桿菌的LAMP引物，是根據鮑曼不動桿菌0 -內酰胺酶0XA-51基 因（blaraA_51)的特異性保守序列設計的，用以定性檢測純菌、患者痰液、血液及其它分泌物 等樣品中的鮑曼不動桿菌，所述LAMP引物由五條引物組成，包括外引物F3和B3、內引物 FIP和BIP、以及環引物LF的組合；所述鮑曼不動桿菌@ -內酰胺酶0XA-51基因（bla()XA_51) 的特異性保守序列如序列表中SEQ ID NO :1所示。
2. 根據權利要求1所述的LAMP引物，其特征在于：所述用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP 檢測的五條引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :2(F3)、SEQ ID NO :3(B3)、SEQ ID NO :4 (FIP)、SEQ ID NO :5 (BIP)和 SEQ ID NO :6 (LF)所示。
3. 根據權利要求2所述的LAMP引物，其特征在于：所述的LAMP引物，為F3和B3、FIP 和BIP、以及LF按摩爾比5:40:20的組合物。
4. 一種用于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的試劑盒，包括權利要求1或2或3所述用 于對鮑曼不動桿菌進行LAMP檢測的引物。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括以下用于25 yl反應 體系的試劑：20mM Tris ? HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S04,0. 1% Tween20,0.8M 甜菜 喊（betaine)，8mM MgS04，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量為：5pmol 引物 F3 和 B3,40pmol 引物 FIP 和 BIP，20pmol 引物 LF。
6. 根據權利要求5所述的LAMP引物，其特征在于：所述試劑盒中還可包括陽性對照 和陰性對照，所述陽性對照為鮑曼不動桿菌標準株基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的 LAMP擴增體系，如雙蒸水。
7. 權利要求1或2或3所述的LAMP引物或權利要求4或5或6所述的試劑盒在鮑曼 不動桿菌的LAMP檢測中的應用。
8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于：一種鮑曼不動桿菌的LAMP檢測方法，包 括以下步驟： 1) 以待測樣品基因組DNA為模板，在權利要求1或2或3所述引物的引導下進行LAMP 擴增，25 ill LAMP反應體系包括：待測樣品基因組DNA2 iil，20mM Tris ? HC1 (pH8. 8)，10mM KC1，10mM(NH4)2S04,0. 1% Tween20,0. 8M甜菜堿（betaine)，8mM MgS04,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量為：5pmol 引物 F3 和 B3,40pmol 引物 FIP 和 BIP，20pmol 引物LF ;LAMP擴增條件為：置60-65°C恒溫40-50min ; 2) 反應結束后進行結果判定：在反應液中添加鈣黃綠素指示劑，根據反應液的顏色變 化判斷結果，綠色表示待測樣品中存在鮑曼不動桿菌，橙色表示待測樣品中不存在鮑曼不 動桿菌；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應前后反應液的濁度變化來判斷 結果，濁度上升表示待測樣品中存在鮑曼不動桿菌，濁度無變化表示待測樣品中不存在鮑 曼不動桿菌。
9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于：所述步驟1)中的LAMP反應體系中還設 有陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為鮑曼不動桿菌標準株基因組DNA，所述陰性對照為 不含DNA的LAMP擴增體系，如雙蒸水；所述LAMP擴增條件優選為：置65°C恒溫50min。
10. 根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于：所述步驟2)中鈣黃綠素指示劑的 添加量可為1 U 1 (終反應體系為26 ill)，含有0. 5mM鈣黃綠素和10mM氯化錳。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450942SQ201410837589
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優先權日:2014年12月29日
【發明者】袁靜, 柏長青, 李璞媛, 劉威, 李環, 牛文凱, 鄒大陽, 苑鑫, 劉慧瑩 申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所, 中國人民解放軍第三〇七醫院