專利名稱：Mage腫瘤排斥抗原前體衍生的與hla-a2分子形成復合物的分離肽的制作方法
相關申請本發明是1994年8月15日申請的序列號08/290,381的部分繼續申請，后者是1994年6月17日申請的序列號08/261,160的部分繼續申請，而08/261,160又是1994年3月24日申請的序列號07/217,186的部分繼續申請，本案要求所有申請的優先權，所有這些申請引入本文作參考。發明領域本發明涉及免疫遺傳學與肽化學。特別地，它涉及到肽類，尤其是應用于各種方式，包括作為免疫原和HLA-A2分子配位體使用的十肽和九肽。更特別地，它涉及到一種稱作“腫瘤排斥抗原”的，來自于腫瘤排斥抗原前體的。并且被HLA-A2分子所呈遞的肽。
有關癌細胞被宿主有機體識別或是這種識別作用的喪失的研究已在許多不同的方向上開展起來。對該領域的了解意味著對基礎的免疫學及腫瘤學的一些了解。
在小鼠腫瘤方面的早期研究揭示出，這些被呈遞的分子能夠在把腫瘤細胞移植到同源動物體內時導致對這些腫瘤細胞的排斥作用。這些分子被受體動物的T-細胞“識別”，喚起一種細胞溶解性T-細胞反應，將移植的細胞溶解。這一證據的第一次獲得是在體外用化學致癌物質，例如甲基膽蒽誘發的腫瘤中。后來發現由腫瘤所表達的能引起T-細胞反應的抗原在每種腫瘤中是不同的。見以下有關講授用化學致癌物誘發腫瘤及細胞表面抗原差異的文獻Prehn，etal.，J.Natl.Canc.Inst.18769-778(1957)；Klein et al.，Cancer Res.201561-1572(1960)；Gross，Cancer Res.3326-333(1943)；Basombrio，Cancer Res.302458-2462(1970)。這一類抗原后來被稱作“腫瘤特異性移植抗原”或“TSTAS”。在觀察到當用化學致癌物誘導時這類抗原的存在以后，當在體外通過紫外照射誘發腫瘤時也得到了類似的結果。見Kripke，J.Natl.Canc.Inst.53333-1336(1974)。
當在上述類型的腫瘤中觀察到T-細胞介導的免疫反應時，自發性腫瘤通常被認為是非免疫原性的。因而相信在這些腫瘤攜帶者體內不會出現能引起針對這些腫瘤的反應的抗原。見Hewitt，et al.，Brit.J.Cancer 33241-259(1976)。
tum-抗原呈遞細胞株家族是通過誘變小鼠腫瘤細胞或細胞株而得到的致免疫性突變體，如Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)所述，該文獻引入本文作參考。為了驗證，通過突變在同源小鼠中不產生免疫應答并將形成腫瘤的腫瘤細胞(即“tum-”細胞)而獲得tum-抗原。當這些tum+細胞被誘變時，它們被同源小鼠排斥，不能形成腫瘤(因而叫“tum-”)。見Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74272(1977)(引入本文作參考)許多種類型的腫瘤已被發現表現出這種現象。見Frost etal.，Cancer Res.43125(1983)。
因為tum-突變體能產生一個免疫排斥過程，因而它們似乎不能形成進行性的腫瘤。支持該假說的證據包括，不能以正常方式形成腫瘤的“tum-”腫瘤突變體，在其免疫系統被亞致死量射線處理抑制過的小鼠中又恢復了形成腫瘤的能力。見Van Pel et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA 765282-5285(1979)。還包括觀察到的腹腔注射的肥大細胞瘤P815 tum-細胞在以指數級數增殖12-15天后，在注入淋巴細胞及巨噬細胞僅僅幾天后就消失了。(Uyttenhove et al.J.Exp.Med.1521175-1183，1980)。更多的證據包括觀察到小鼠獲得了一種免疫記憶，這樣使得它們能抵抗隨后的同種tum-突變體的攻擊，即使是在給予同種tum-突變體之前給予免疫抑制量的射線時。見Boon et al.，Proc Natl Acad.Sci.USA 74272-275(1977)；Van Pel etal.，supra；Uyttenhove et al.，supra。
后期的研究發現，當自發性腫瘤易被誘變時，就生產出能引起反應的致免疫性突變體。確實，這些突變體能夠引發一種針對原始腫瘤的免疫保護性反應。見Van Pel et al.，J.Exp.Med.1571992-2001(1983).由此可見在腫瘤中引起作為同源排斥反應的靶的物的“腫瘤排斥抗原”的呈遞是可能的。在外源基因轉染到自發性腫瘤中時也得到了類似的結果。見Fearon et al.，Cancer Res.482975-1980(1988)。
已經辯認出一種抗原，它被呈遞于腫瘤細胞的表面，并被細胞溶解性T細胞所識別，從而導致溶解。后文中將把這類抗原稱作“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs可能也可能不會引起抗體反應。有關這些抗原的進一步的研究是通過體外的細胞溶解性T細胞特征研究，例如通過特定細胞溶解性T細胞亞系(后文中稱之為“CTL”)對抗原的鑒定的研究而進行的。該亞系在識別被呈遞的腫瘤排斥抗原后增殖，呈遞抗原的細胞被溶解。特征性研究已經鑒別出特異性裂解表達該抗原的細胞的CTL克隆。這些工作的實例可見Levy et al.，Adv.Cancer Res.241-59(1977)；Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)；Brunner et al.J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol 126406-412(1982)；Palladino et al.，Canc.Res.475074-5079(1987)。其它類型的被CTLS識別的抗原也要求進行這類分析，包括次要組織相容性抗原，雄性特異性H-Y抗原，以及在此討論的被認為是“tum-”抗原的抗原。
以上所述的腫瘤的一個范例是P185。見Deplaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274-2278(1988)；Szikora et al.，EMBO J.91041-1050(1990)，以及Sibille et al.，JExp.Med.17235-45(1990)，所述文獻引入本文作參考。P815腫瘤是一種肥大細胞瘤，用甲基膽蒽在DBA/2小鼠中誘發，并以體外腫瘤及細胞株形式培養。P815株經過誘變后產生許多tum-突變體，包括P91A(Deplaen，supra)，35B(Szikora，supra)以及P198(Sibille，supra)突變體。與腫瘤排斥抗原形成對照的是-并且這是一個關鍵性的差別-tum-抗原僅僅在腫瘤細胞被誘變后才呈遞。腫瘤排斥抗原呈遞于給定的無須誘變的腫瘤細胞。因此，一種細胞株可以是tum+的，例如稱作P1的株，也能夠被引發而產生tum-突變體。由于tum-的表型與其父代細胞株有差異，因此可以預期這兩種細胞株的DNA也會有差別，這種差別就可以被開發來在tum-細胞中定位感興趣的基因。其結果是，已經發現tum-突變體，例如P91A，35B和P198，其基因與其正常等位基因的差別在于基因的編碼區域發生了點突變。見Szikoraand Sibille，supra，以及Lurquin et al.，Cell 58293-303(1989)。已證明本發明的TRAs不是這種情況。這些文獻還闡明了衍生于tum-抗原的肽為了被CTLs識別而被Ld分子呈遞。P91A被Ld呈遞。P35被Dd以及P198被Kd所呈遞。
于1992年5月22日申請的PCT申請PCT/US92/04354，講授了一個人的腫瘤排斥抗原前體編碼基因家族，稱作MAGE家族。這些基因中的幾個還在以下文獻中討論過Van der Bruggen et al.，Science 2541643(1991)。另外參見USP5,342,774，作為公開MAGE基因的文獻引入本文作參考。現已清楚MAGE家族的各種基因在腫瘤細胞中表達，并可作為診斷這種腫瘤的標記，并用于該文討論的各種應用。另外參見Traversari et al.，Immunogenetics 35145(1992)；Van der Bruggen et al.，Science 2541643(1991)。有關某蛋白質被修飾及其在細胞表面呈遞的機制現在已得到很好的證明。對該領域發展的粗略的了解可參看Barinaga“Getting Some‘Backbone’How MHC Binds Peptides”，Science 257880(1992)；Fremont et al.，Science 257919(1992)；Matsumura etal.，Science 257927(1992)，Latron etal.，Science 257964(1992)。這些文獻普遍地指出的一個要求是，這些結合到MHC/HLA分子的肽長度為9個氨基酸(一種“九肽”)，而且九肽的第一個和第九個殘基很重要。如此處所述，若這一“規則”普遍正確，則MHC-I類分子能結合的肽類的長度還有一些余地。
有關MAGE家族基因的研究現已揭示出，在一些腫瘤細胞的表面確實呈遞著某特定的九肽，而且要求呈遞分子是HLA-A1。MAGE-1腫瘤排斥抗原(TRAs或九肽)復合物導致呈遞它的細胞被細胞溶解生T細胞(“CTLs”)所溶解。
應注意的是，例如Traversari et al.，的申請號08/217,188，申請日1994年3月24日，以及Melief et al.的申請號08/217,187，申請日1994年3月24日中的其它MAGE衍生肽類；美國專利申請Serial No.07/938,334(1992年8月31日申請)及073,103，(1993年6月7日申請)的研究表明，比較MAGE-1基因中編碼相關九肽的區域與各種MAGE基因的同源區域時，有著大量的同源性。實際上，這些觀察結果導致本發明的一個方面，即九肽家族中的所有成員具有相同的N-端和C-端氨基酸。這些九肽可用于各種目的，包括用作免疫原，無論是單獨使用還是與載體肽偶聯。九肽已有足夠的大小以構成抗原決定簇，由其而產生的抗體可用來鑒定這些九肽，無論其單獨存在，或者作為一個較大的多肽的一部分。
這些文獻，尤其是申請號為073,103的申請，顯示出在HLA-A1與MAGE-3之間的一種聯系；然而，僅僅有大約26％的白人和17％的黑人在其細胞表面呈遞HLA-A1分子。因此，尋找一些能被其它類型的MHC分子呈遞的肽的信息是極其有用的，這樣相當比例的人口將從以上的討論過的研究工作中受益。
現在已經發現，MAGE-3衍生肽的抗原呈遞并非僅僅局限于HLA-A1分子。本發明鑒定出了衍生于MAGE-3及其它MAGE TRAPs的肽類，它們能與MHC一類I分子HLA-A2形成復合物。這一發現的應用，包括在治療和診斷方面的用途，都在本發明的內容之內并在下文中描述。
圖1顯示在本文所描述的肽類的初步篩選結果；圖2顯示用SEQ ID NO2及SEQ ID NO6所得到的滴定數據。
圖3描述了在確定對肽與HLA分子復合物特異的CTLs能否被激活的實驗中所得到的結果。X軸表示效應子靶細胞的比例，Y軸通過鉻釋放表示溶解百分數。
圖4A，4B，4C及4D顯示了在有限稀釋分析實驗中得到的四種特異性CTLs中的每一種的溶解百分數；靶細胞是T2細胞。
圖5A-5D顯示每種CTLs在針對各種轉化細胞與非轉化細胞以及轉染細胞的試驗中所得到的結果。
圖6A與6B顯示當COS-7細胞被一種或多種HLA-A2，MAGE-3和MAGE-12cDNA轉染后所得到的結果。所用的分析方法是使用了WEHI-164克隆13細胞的一種TNF釋放分析方法。在對照實驗中，僅使用HLA-A2，MAGE-3以及MAGE-12cDNA的一種。圖6A包括使用CTL克隆279/19的試驗，而圖6B用了CTL克隆297/22。
圖7A與7B顯示一個TNF釋放分析的結果，其中將細胞HLA-A2+/MAGE-3+與MAGE-3或HLA-A2陽性細胞做了比較，但后者未同時使用。在圖7A中用了CTL279/19，而圖7B中用了CTL297/22來產生數據。
圖8表示一個51Cr釋放分析，其中HLA-A2+細胞被驗證其與SEQ ID NO6(細胞株T2)的結合，還試驗了HLA-A2+/MAGE-3+細胞(即SK23-MEL，LB43-MEL，LB273-MEL4.0)。
圖9顯示T2細胞與下述之一溫育后的溶解情況(i)九肽Phe LeuTrp Gly Pro Arg Ala Leu Val(SEQ IDNO6)或(ii)Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile(SEQ ID NO12)。
實施例1在這一系列實驗中所應用的方法學是根據下述文獻中的描述Elvinet al.，J.Imm.Meth.158161-171(1993)；Townsend et al.，Nature 340443-448(August 10，1989)；Townsend et al.，Cell 62285-290(July 27，1990)，所有文獻引入本文作參考。
如同所述使用了細胞株174。它是一種呈遞HLA-A2細胞株，在將肽運送到內質網上的MHC-I類雜合二聚體裝配位點這一途徑有缺陷。該細胞可以裝配MHC-I類分子，但它們不穩定，當細胞溶解時，在保溫過夜后解離成自由的重鏈與輕鏈。然而，在體外通過加上合適的肽類配位體可以使雜合二聚體得到穩定。見Townsend et al.，Nature 340443-448(1989)；Townsend et al.，Cell 62285-295(1990)。這樣，穩定后的分子可以與對MHC-I類分子有特異性的抗體一起免疫沉淀。
在這些實驗的第一部分中，檢測肽類以確定它們是否使HLA-A2在細胞株中易于裝配。被試驗的肽包括SEQ ID NO1 Gly Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala LeuSEQ ID NO2 Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu LeuSEQ ID NO3 Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly LeuSEQ ID NO4 ILe Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu LeuSEQ ID NO5 His Leu Tyr ILe Phe Ala Thr Cys LeuSEQ ID NO6 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu ValSEQ ID NO7 Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu ValSEQ ID NO8 Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu ValSEQ ID NO9 Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro ValSEQ ID NO10 Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val細胞通過暴露于[35S]甲硫氨酸中進行標記(1-2×107細胞懸液，用100-200μCi用60分鐘接觸標記)。然后用磷酸緩沖鹽水洗滌細胞一次，再重懸于10ml溶解緩沖液中(0.5％ NP-40；0.5％Mega 9，150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris[PH7.5]，2mM 苯基甲基磺酰氟，5mM吲哚乙酰胺)。然后將溶解液與肽(10μM和20μM)保溫15-18小時。在微型離心管中沉淀細胞核，溶解液于4℃用0.2ml洗滌過的10％(w/v)的Staphylococcus A預澄清處理過夜。將溶解液分成兩部分，加入單克隆抗體BB7.2使其終濃度為5μg/ml。該單抗是一種構象專一性的，HLA-A2識別性單抗，見Parham et al.，Hum Immunol.3277-299(1981)所述。混合液水浴90分鐘，隨后加入終濃度為1％(w/v)的牛血清白蛋白，以及100μl 5％(w/v)的蛋白-ASepharose顆粒。轉動管子45分鐘，然后用1ml洗滌緩沖液(0.5％NP-40，150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris[PH7.5])洗滌顆粒四次。樣品洗脫出來后，在12％聚丙烯酰胺凝膠上參照Townsend et al.，Nature 340443-448(1989)的方法分析。
圖1顯示了在這些實驗中給出陽性結果的肽。它們是SEQ ID NOS2，6，7，8以及10，在圖中顯示出黑帶，指明在所有的膠中是相同的，并代表著在電泳前與這些肽復合的MHC分子(HLA-A2)的免疫沉淀。
圖中按從左到右的順序顯示了有關SEQ ID NOS2，6，7，8和10的工作。垂直的帶將有關SEQ ID NO10的實驗與標有“.174”，“A2 Line”以及“.174 Matrix”的條帶分開。174是一個MHC-I類分子重鏈的“陰性”對照。根據上文所提到的該細胞系在沒有外源肽類存在時不呈遞穩定的MHC-I類分子，而且由于BB7.2是構象特異性的，它將不能沉淀未復合的MHC-I類分子。“A2”是指一種已知的呈遞HLA-A2的細胞株(該細胞株為LBL721，描述于DeMars et al.，Hum.Immunol.1177(1984)，但任何呈遞穩定的HLA-A2分子的細胞將以相同的方式起作用。“.174Matrix”顯示當.174細胞與一種對照肽GILGFVFTL(SEQID NO11)一起保溫時的結果，該肽來源于流感病毒，并已知能被HLA-A2呈遞。
通過重鏈(HC)條帶與那些從A2和.174Matrix中得到的條帶的比較所得的事實，表明了MHC-I類分子的穩定化。事實上，MHC分子已被還原性膠所破壞；但是，若在被還原前是穩定的，其重鏈分子將仍然與構象特異性的單克隆抗體結合在一起。這就是事實上凝膠所顯示的，即所述的肽類結合到HLA-A2分子上，并使之穩定。實施例2一旦結合的肽類被鑒別出來，就進行一系列的滴定實驗。此時，根據文獻Townsend et al.，Cell 62285-295(July27，1990)中293頁(引入本文作參考)，各種不同濃度的肽類，被加入到上文所述的細胞溶解液中，根據免疫沉淀的發生情況以確定這些肽發生結合時的最佳濃度。
圖2顯示了從兩種肽SEQ ID NO2和6中得到的結果。對照一種已知的HLA-A2結合肽SEQ ID NO11滴定這些肽，從20μM開始進行10倍的稀釋，濃度降至2，0.2和0.002μM。
使用這些肽(即SEQ ID NO2和6)進行了實驗。在SEQ ID NO2實驗中，此處未報道的是該肽在5-10nM滴定，這個濃度與對照(SEQ ID NO11)相當。實施例3進行了一系列的實驗，來顯示肽SEQ ID NO6誘導對該肽與HLA-A2的復合物有特異性并能溶解這類復合物的細胞溶解性T淋巴細胞(“CTLs)的能力。在此描述這些反應中的第一個步驟。
外周血液淋巴細胞(“PBLs”)取自于正常的供給者，即沒有任何癌癥腫瘤的個體。該稱之為“LB705”的供給者，分類為HLA-A1，A2，B8，B27。在開始時(“O日”)，從供給者中得到的PBLs以106細胞/ml的濃度懸浮于Iscove’s培養基以及10％胎牛血清和“AAG”(Asp＋Arg＋Glu)、20ug/ml的兔抗人IgM抗體，20ng/ml重組人IL-4(“r-hu-IL4”)以及0.005％Pansorbin細胞中。該混合液分到24孔組織培養板中(每孔2ml)。
在第3日，將細胞離心并重懸于Iscove’s培養基和10％人血清與AAG及20ng/ml r-hu-IL4中。
兩天以后，即第5日，再次離心細胞，并重懸于新鮮的Iscove’s培養基與10％人血清和AAG以及20ng/ml r-hu-IL4，20u/ml重組人γ干擾素中。
在第6日，將細胞再次離心，以5×106細胞/ml濃度重懸于無血清Iscove’s培養基以及50μg/ml的肽SEQ ID NO6中，并加入2.5ug/ml的人β2微球蛋白。該混合液中的細胞于37℃培養4小時，然后以50Gy放射線處理。再次離心細胞，重懸于Iscove’s培養基和10％人血清+AAG。然后將細胞放入24孔組織培養板的每個孔中，每孔1百萬個細胞。
然后加入應答細胞，它們是同樣取自于供給者LB705的CD8+T細胞，使用公知的分離T細胞部分的技術從供給者的PBLs中獲得了CD8+細胞，應答細胞以5×106細胞/孔的濃度加到孔中。最終的體積是2ml。在加完細胞之后，隨之加入1000U/ml的重組人IL-6(“r-hu-IL-6”)，10ng/ml的重組人IL-12(“r-hu-1L-12”)。
七天以后，即在第十三日，重新刺激應答細胞即CD8+細胞。該步驟的完成是通過將上述混合培養物轉移到自粘連細胞中并加入10U/ml r-hu-IL-2及5ng/ml的r-hu-IL-7而實現的。自粘連細胞預先如下制備，培養5×106放射處理過(50Gy)的從LB705中得來的PBLs，于37℃在1ml Iscove′s培養基+10％人血清+AAG中培養2小時。移棄任何非粘連細胞，并加入溶于0.5ml無血清培養基中的50μg/ml的肽SEQ ID NO6和2.5μg/ml的人β2微球蛋白。該混合液于37℃培養2小時，然后洗滌。隨后將應答CD8+細胞加入其中。
在第21天，再刺激一次應答細胞，即加入2×106PBLs，后者于50Gy放射線處理，并已在無血清培養基+50μg/ml人β2微球蛋白+50μg/ml SEQ ID NO6中培養2小時，隨后并洗滌過。
該程序的結果是產生了對SEQ ID NO6和HLA-A2的復合物有專一性的CTLs，如下面的實施例中所顯示。實施例4這些實驗在第28天進行以確定根據本發明的肽類分子當其與HLA-A2復合時，是否會激起被CTLs溶解的反應。
使用了T2細胞系。該細胞系在其表面呈遞HLA-A2分子，但它在抗原加工上有缺陷因此有著增強了的呈遞外源肽類的能力。見Cerundolo，et al.，Nature 345449(1990)，該文描述了這個細胞系。其它等價的細胞系也是可以接受的。
T2細胞樣品用放射性鉻(51Cr)標記，并與1μM的肽SEQ IDNO6一起培養。在引入CTLs之前預培養進行一個小時。T2細胞的對照樣品不與肽一起培養。
根據上文中實施例3，制備CTLs，使用自發APCs刺激CD8+細胞，并與SEQ ID NO6肽一起預培養21天。
圖3顯示了結果。X軸表示效應細胞/靶細胞的比例，而Y軸表示特異性溶解的百分數。該百分比通過測定鉻的釋放確定，參看文獻Boon，et al.，J.Exp.Med 1521184(1980)，引入本文作參考。在每一試驗小孔中，通過在使用的1,000個51Cr標記的T2靶細胞中加入50,000個K562細胞，可消除非特異性溶解的影響。K562細胞之所以能消除非特異性溶解，是因為其作為天然殺傷細胞或稱“NK”的細胞優先溶解該細胞株。
可以清楚地看到該肽被HLA-A2分子呈遞時，能夠激發T2細胞的溶解。實施例5在實施例4中所描述的工作產生了一種混合培養物，其中有對SEQ IDNO6與其呈遞的HLA-A2分子形成的復合物具有特異性的CD8+T細胞，還有非特異性CTLs。為了分離出具有所要特異性的CTL克隆，參照簡述于此的Herin et al.，Int.J.Cancer 39390-396(1987)上的方法(該文引入本文作參考)，進行一種有限稀釋分析。
在第29日，參照上述的Herin et al的方法用已知可表達MAGE-3和HLA-A2的射線處理過的SK23-MEL細胞，與作為飼養細胞(feeder cells)的LG2 EBV細胞一起，與CTLs混合培養物結合。同時加入到混合物中的還有50U/ml的IL-2，5U/ml的IL-4。結果產生了CTL克隆297/19，CTL297/22，CTL297/27，以及CTL297/36。實施例6
在實施例4中，使用固定量的肽及變化的效應子/靶細胞比例，顯示出了呈遞肽SEQ ID NO6的細胞溶解的誘導作用。而在本例的這些實驗中，效應子/靶細胞的比率保持恒定，改變的是肽的數量。如同實施例4中對T2細胞及CTLs做的一樣，進行一次51Cr釋放分析。使用的是實施例5中的四種不同的CTLs。
圖4A，4B，4C和4D顯示了這些結果，指出溶解作用有一定的劑量依賴性。當T2細胞未與肽溫育過時，溶解總是低于2％。實施例7在另外一套實驗中，在一個宿主細胞本身不表達HLA-A2的模型中檢驗了肽SEQ ID NO6的溶解效應。
使用細胞株COS-7。該細胞用以下之一轉染(i)HLA-A2.01的染色體DNA和MAGE-3的cDNA；(ii)僅僅是HLA-A201的染色體DNA或(iii)僅僅是MAGE-3的cDNA。在每種情況中，轉染載體都是pcDNA/AmpI，其中DNA連接在EcoRI人工接頭上，并根據廠商指導被克隆到質粒的EcoRI位點中。受體細胞以15,000個細胞/孔的濃度接種于裝有DMEM＋10％胎牛血清的培養基的組織培養平板底部的小孔內。細胞過夜培養后，棄掉培養基，再加入30μl/孔的含有10％Nu血清，400μg/ml DEAE葡聚糖，100μM氯喹以及100ng按此處所述制備的質粒的DMEM。作為又一個對照，COS-7細胞單獨用HLA-A2轉染(通過在pcDNA/AmPI中的HLA-A2.01)，并根據實施例4，與1μM的肽SEQ ID NO6預先培育1小時。
另外，還使用了已知可以表達MAGE-3的并且屬于HLA-A2+的黑素瘤細胞株。在圖中這些細胞分別是LB373，LB43，LB24克隆409，以及SK23。細胞株MZ2-MEL.43是HLA-A2-的。在附加試驗中該細胞株也用pcDNA/AmpI中的HLA-A2基因轉染。
參照Traversari et al.，Immunogenetics 35145-152(1992)中的方法(引入本文作參考)，并做了一些改變后，進行了TNF釋放分析。具體地，1500個CTLs與30,000個靶細胞結合(CTLs是以上討論過的一種克隆)，細胞在有25U/ml的IL-2存在下共同培養。24小時以后，培養上清用對TNF敏感的WEHI164克隆13細胞進行檢驗。在WEHI164克隆13中加入了LiCl以提高其敏感性(20mM)，參看Beyart，et al，PNAS869494-9498(1989)。
這些實驗的結果描述于圖5A-5D。每張圖中表示的是不同的CTL克隆中，轉染過細胞(圖的上條帶)以及腫瘤細胞(圖的下條帶)分別具有的TNF釋放值(pg/ml)。圖中表明單獨用MAGE-3或是用HLA-A2轉染，都不足以激起溶解反應，而并不讓人吃驚的是，用MAGE-3和HLA-A2共同轉染則足以激起反應。然而，真正出乎意料的是，當把肽SEQ ID NO6加入到用HLA-A2單獨轉染的細胞中后，促成了溶解的升高。圖中的第二條帶也注意到這種模式，表示“MZ2-MEL.43/HLA-A2＋1μM SEQ NO6”的數據證明了相對于其它所有的來說的超常的溶解。這種模式，正如所指示出的，在所有被檢驗的CTL克隆中都是重復出現的。實施例8進行了另外一套實驗來試驗在腫瘤細胞鉻釋放分析中該肽的溶解效應。實施例6中的TNF分析比鉻釋放分析要敏感得多，所以后者將能更加確證TNF分析的結果。
有關51Cr釋放分析的描述可見Boon，et al.，J.ExpMed.1521184-1193(1980)。使用同樣的分析方法，并使用了CTL克隆297/19和297/22，以及一系列已知是HLA-A2陽性的靶細胞。細胞株LB4和SK23也已知能表達MAGE-3。而細胞株T2是HLA-A2+及MAGE-3-的。
下表中列出了在不同的效應子/靶細胞比率中得到的數據。但是，該比率都很低。數據表示為在4小時及20小時后細胞溶解的百分數。表1 HLA-A2＋MAGE-3＋細胞的溶解在收集上清前將鉻標記的靶細胞與CTL保溫4小時或20小時
最小 12446764275 64 213最大 871830734 720 352 338自發釋放(％) 12％ 35％ 8％ 28％ 15％ 39％即使是在低的E/T(效應子/靶細胞)比值下，仍然有顯著的溶解發生，顯示出誘導溶解的能力。實施例9延續著實施例7中的工作路線進行了一個實驗。檢驗了用含有HLA-A2基因，以及編碼MAGE-12或MAGE-3的cDNA中的一種的pcDNA/Amp轉染的COS-7細胞對CTL克隆297/19和297/22的刺激作用。作為對照的細胞用HLA-A2，MAGE-3或MAGE-12cDNA中的一種轉染。為了提供一個表達HLA-A2的對照，一個轉染的COS-7細胞樣品與肽SEQ ID NO6預先保溫了1個小時。總量為1500的CTLs加到轉染子中，24小時后，按前述的方法，通過分析其對WEHI-164克隆13細胞的毒性，測得上清中的TNF水平。
如圖6A和6B所示，MAGE-3和MAGE-12被加工成似乎相同的腫瘤排斥抗原。給出的MAGE-12腫瘤排斥抗原的氨基酸序列含有一段與SEQ ID NO6相同的氨基酸順序。因此可以說，許多MAGE-TRAPS中的一個能夠產生相同的腫瘤排斥抗原。實施例10在另外一套實驗中，用以前已經被鑒定分類為HLA-A2+和MAGE-3+的黑素瘤細胞檢驗了CTL克隆297/19和297/22。實驗中應用了30,000個腫瘤細胞(靶細胞)，1500個CTLs(效應細胞)，共同培養使其結合。通過以上所述的方法及WEHI-164克隆13細胞測定了釋放到共培養液中的TNF。
分別對應于CTL297/19和CTL297/22的圖7A和7B，顯示CTLs可以溶解那些HLA-A2+及MAGE-3+的細胞，但不溶解那些僅僅表現為一種陽性的細胞。注意HLA-A2+/MAGE-3+的細胞MZ2-MEL.43/HLA-A2，它是由MZ2-MEL.43(HLA-A2-，MAGE-3+)被HLA-A2轉染而得到的。實施例11在此實施例中檢驗了HLA-A2+/MAGE-3+的黑素瘤細胞被CTL克隆297/22溶解的情況。在這些實驗中，靶細胞黑素瘤細胞與100U/ml IFN-γ和1ng/ml TNFα一起預先培養72小時，并用與上述相同的方法用51Cr標記。標記后的細胞與不同比例的效應細胞一起培養。5個小時以后測量51Cr的釋放。
結果描繪于圖8中，再一次顯示出呈遞HLA-A2與肽SEQ IDNO6的復合物的腫瘤細胞被CTLs所溶解。實施例12進行了一系列的實驗，其中的COS-7細胞樣品用編碼HLA-A2的DNA和/或編碼MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4和MAGE-12的cDNA中的一種轉染。
在這些實驗中，使用前述的DEAE-葡聚糖-氯喹方法，使用以下之一的DNA轉染15,000個COS-7細胞(a)100ng的質粒pcDNAI/Amp(含有編碼HLA-A2的染色體DNA)，(b)100ng的質粒pcD-SRα，(c)100ng的質粒pcDNAI/Amp，含有MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4或MAGE-12的cDNA中的一種；或者是(d)，(a)和(c)一起轉染。
在一天以后，使用胞溶性T細胞系CTL297/22及前述的TNF釋放分析方法，檢驗得到的轉染子。進行TNF釋放分析時，在100μl的含有10％人血清及20U/ml的重組人IL-2的Iscove’s培養基中，加入了1500個CTLs。24小時以后，收集上清，按前述的操作步驟，使用一種MTT比色分析法，通過檢驗其對TNF敏感性WEHI-164克隆13細胞的毒性效應來確定TNF的水平。這些實驗中的50％死亡的WEHI-164克隆13細胞是用6pg/ml的TNF-β得到的。
表2列出了結果。
表2LB705-CTL297/22對經HLA-A2基因和MAGE-2，MAGE-3或MAGE-12 cDNA中的一種轉染后的COS-7細胞的識別用下述材料轉染的COS-7細胞 由LB705-CTL297/22釋放的TNF(pg/ml)no DNA 6HLA-A2 2MAGE-1 5MAGE-2 4MAGE-3 6MAGE-4 3MAGE-12 5HLA-A2＋MAGE-1 7HLA-A2＋MAGE-2 56HLA-A2＋MAGE-3 93HLA-A2＋MAGE-4 5HLA-A2＋MAGE-12 8015000個COS-7細胞通過DEAE-葡聚糖-氯喹方法用100ng的質粒pcDNA1/Amp(含有HLA-A2基因)與100ng質粒pcD-SRα或pcDNA1/Amp(含有MAGE-1，2，3，4或12的cDNA)轉染。
轉染子一天后通過LB705-CTL294/22檢驗其刺激TNF產生的能力。
在含有靶細胞的小孔中，于含10％的人血清和20U/ml r-hu-IL2的100μl Iscove培養基(Gibco BRL)中加入1,500個LB705-CTL297/22細胞。
24小時以后，收集上清，在一個MTT比色分析中檢測其對WE HI-164克隆13細胞的細胞毒性以確定上清中TNF的含量。
在此實驗中，通過6pg/ml的TNFβ得到50％致死的WEHI-164克隆13細胞。
MAGE-3和MAGE-12的成功是不出意料的，因為它們都加工為肽SEQ ID NO6。肽SEQ ID NO6也被MAGE-6編碼。因此，可以預期的是，CTL297/22應該能識別源于SEQ ID NO6的加工的HLA-A2和SEQ ID NO6的復合體。而MAGE-2的成功，則暗示還有其它的九肽參與。MAGE-2包括一段與SEQ IDNO12相對應的序列，即Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile但不是SEQ ID NO6。實施例13根據實施例12給出的結果，合成了一個與SEQ ID NO12相對應的肽，然后在一個按前述方法進行的51Cr釋放分析實驗中進行了驗證。使用不同濃度的肽，并用了不同比例的E/T，所有其它參數如前述。
如圖9中所示，九肽SEQ ID NO12確實能夠激起呈遞它的細胞的溶解反應。
前面描述了來源于MAGE腫瘤排斥抗原前體并能夠與MHC-I類分子HLA-A2相互作用的肽類的鑒定。特別感興趣的并且是本發明的一部分的，是由SEQ ID NO1-10和12所代表的肽類。這一些肽類很容易用Merrifield合成法或者是其它肽類合成方法來合成。
具有特殊興趣的肽是符合下列公式的肽(Xaa)1(Xaa)2-7(Xaa)8(Xaa)9(SEQ ID NO13)更為特別的是Xaa Leu Xaa Gly(Xaa)nLeu(SEQ ID NO14)以及Xaa Leu Xaa Gly(Xaa)n Val(SEQ ID NO15)其中n＝4或5，Xaa為任一氨基酸。在SEQ ID NO13中，(Xaa)1優選的是Ala，Leu，Ile或Cys，最優選的是Gly或Phe。在(Xaa)2-7中的六個氨基酸可以是任意氨基酸，條件是(Xaa)2-7中的第二個氨基酸，或(Xaa)3，不能是Asp，(Xaa)3可以是Leu，Met或Pro，而(Xaa)9是任一氨基酸。特別優選的是像SEQ IDNO6這樣的肽，它是所有這些種類中的例子。
同樣優選的還有以下形式的肽Phe (Xaa)2-7Leu Xaa(SEQ ID NO16)其中Xaa是任一氨基酸，或是Gly (Xaa)2-7Leu Xaa(SEQ ID NO17)同樣其中的Xaa是任意氨基酸，除了(Xaa)3有前面所述的限制。這些組合包括在其它的MAGE基因中與SEQ ID NO6和SEQ ID NO12相應的九肽。這樣的肽的例子有Phe Leu Leu PheLys Tyr Gln Met Lys(SEQ ID NO18)；Phe Ile Glu Gly Tyr Cys Thr Pro Glu(SEQ ID NO19)；Gly Leu Glu Gly AlaGln Ala Pro Leu(SEQ ID NO20)；以及Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu(SEQ ID NO2，見前述)。這些九肽預期有強的結合HLA-A2的能力，因此可以用做確定某細胞是否HLA-A2陽性的試劑。尤其優選的是那些能滿足前述的結構標準，并能結合HLA-A2，以及能激發對九肽和HLA分子復合物特異的細胞溶性T細胞的溶解反應的九肽。
正如所指出的，這些肽能與HLA-A2結合，這些復合體己被免疫沉淀，導致了本發明的另一方面，即分離的由這些肽中的任何一個與HLA-A2分子形成的復合體。
這些肽及其復合體在多個方面都是有用的。正如所顯示出來的，這些肽與HLA-A2可結合，因而它們可用來分析在一個樣品中是否存在HLA-A2呈遞細胞。肽可以以某種可確定的形式與感興趣的樣品接觸，例如一種被標記的肽(放射性標記、顯色標記、等等)，或結合到固相支持物上，例如一種柱子或瓊脂糖或SEPHAROSE微粒上，以及使用標準的分析方法，結合待確定的細胞。
這些肽及其分離的復合體均可用于生產對前面所提到的復合體有特異性的單克隆抗體或細胞溶解性T細胞克隆。完成此工作所需的方法對本領域熟練技術人員來說很熟悉，而且有關細胞溶解性T細胞克隆的生產在前面已有例子。由于某些癌癥細胞呈遞MAGE-3衍生肽如SEQ ID NOS2，6，7，8，10和12與HLA-A2的復合體，這些單克隆抗體和細胞溶解性T細胞克隆可做為試劑用于診斷癌癥，因為沒有發現正常的細胞即非致癌細胞呈遞這些復合體。上述的鉻釋放分析是用CTLs確定感興趣的靶細胞的一種分析方法的范例，而且現有技術非常熟悉免疫分析及其操作方法。
如此衍生而來的細胞溶解性T細胞可用于諸如過繼轉移等方案。見Greenberg et al.，J.Immunol.136(5)1917(1986)；Reddel et al.，Science 257238(1992)；Lynch et al.，Eur.J.Immunol.211403(1991)；Kast et al.，Cell 59603(1989)所有文獻引入本文作參考。在這種方法中，前面所列舉出的肽與抗原呈遞細胞(“APCS”)結合形成穩定的復合體。已知許多這類方法，例如，披露于Leuscher et al.，Nature 35172-74(1991)；Rometo et al.，J.Exp.Med.174603-612(1991)；Leuscher et al.，J.Immunol.1481003-1011(1992)；Romeroet al.，J.Immunol.1503825-3831(1993)；Romero et al.，J.Exp.Med.1771247-1256(1993)等文獻上的方法(所有文獻引入本文作參考)。隨后，使呈遞細胞接觸細胞溶解性T細胞(源)，產生對感興趣的復合體有特異性的細胞溶解性T細胞克隆。較好的做法是使用發現于待用CTLs治療的患者血樣中的一種自體性T細胞克隆。CTLs產生之后，就重注入待治療的對象體內，其劑量應足以改善癌變的狀況，如抑制其繁殖，或是通過溶解癌細胞。
如實施例中所表明的，本發明的另一方面，是聯合使用IL-6和IL-12來激活T細胞，特別是細胞溶解性T細胞。同在此處的術語“激活”，指的是促使T細胞行使其預定功能的能力。當然，對于CTLs來說，就是識別與溶解在其表面呈遞合適的肽與MHC分子的結合體的細胞。激活的T細胞可以用于診斷，如，確定某特定肽/MHC結合體，是否存在于其試驗樣品的某一細胞亞群中。使用結合的細胞因子也能使某特定CTLs的鑒別變得容易。已知在一CTL樣品中，僅僅只有很小的一個亞群是可能對某一MHC/肽結合體有特異性的。通過在與呈遞所需結合體的樣品的結合中使用細胞因子，并通過溶解反應，比較其與對照值，就可確定激活與否。對照中，除了樣品中未混有附加的材料外，其它都保持不變。它提供必不可少的對照值。
本發明的另一方面是一種用于T細胞激活作用的藥盒。該藥盒包括兩個獨立的組分白介素-6和白介素-12，兩個獨立的組分包裝于一個容器之內。感興趣的藥盒還可以包括例如一份分開的待呈遞的肽，和/或一種載體或HMC的編碼區域，甚而或者是一種載體或MHC分子與該肽兩者編碼的序列。例如，該肽可能是SEQ ID NO6。載體可能包含有一個HLA-A2編碼區或是HLA-A2與SEQ ID NO6的聯合。本發明的另一個方面是一種基本上由IL-6和IL-12組成的組合物，其數量足以激活T細胞，例如CTLs。
用于此處時，“IL-6”和“IL-12”指的是這些分子的所有形式，它們可能是天然產生的也可能是重組生產的，人類的，鼠類的，或任何其它種屬的，以及其它所有具有IL-6和IL-12的相同的激活性質的不同分子。
所用的IL-6和IL-12的量可以不同；然而，優選的方案是從約500-約1000U/ml的IL-6，以及從約1-約10ng/ml的IL-12，當然根據技術人員的發現，這些范圍可以不同。
本發明的其它方面對于熟練技術人員很清楚，在此無須重述。
在此處所用的一些術語與表達僅是出于描述的需要而非限制，并且這些術語和表達的使用不排除任意等價的被顯示或描述的特征或其部分，在本發明的范疇之內各種修改是可能的。
權利要求
1.選自以下一組的分離的肽SEQ ID NO2SEQ ID NO6SEQ ID NO7SEQ ID NO8SEQ ID NO10以及SEQ ID NO12。
2.權利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO2。
3.權利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO6。
4.權利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO7。
5.權利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO8。
6.權利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO10。
7.權利要求1的分離的肽，被命名為SEQ ID NO12。
8.具有通式(Xaa)1(Xaa)2-7(Xaa)8(Xaa)9(SEQ ID NO13)的分離的肽，其中(Xaa)1指的是任一氨基酸，(Xaa)2-7是任意六個氨基酸，條件是所說的六個氨基酸中的第二個不能是Asp，(Xaa)8是Leu，Met，或Pro，(Xaa)9是任一氨基酸。
9.權利要求8的分離的肽，具有通式(Xaa)1Leu(Xaa)3Gly(Xaa)5-8Leu(SEQ ID NO14)。
10.權利要求8的分離的肽，具有通式(Xaa)1Leu(Xaa)3Gly(Xaa)5-8Val(SEQ ID NO15)。
11.權利要求8的分離的肽，其中(Xaa)1是Ala，Leu，Ile，Cys，Phe，或Gly。
12.權利要求11的分離的肽，其中(Xaa)1是Phe或Gly。
13.權利要求8的分離的肽，其中(Xaa)1是Phe，(Xaa)8是Leu。
14.權利要求8的分離的肽，其中(Xaa)1是Gly，(Xaa)8是Leu。
15.權利要求11的分離的肽，選自由SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，和SEQ ID NO20′組成的一組。
16.HLA-A2和權利要求1的分離的肽的分離的復合體。
17.權利要求16的分離的復合體，其中所說的肽被命名為SEQ ID NO6。
18.權利要求16的分離的復合體，其中所說的肽是SEQ ID NO12。
19.分離的細胞溶解性T細胞克隆，它對HLA-A2與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10以及SEQ ID NO12一組的肽形成的復合體有特異性。
20.單克隆抗體，它特異性地結合HLA-A2與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10以及SEQ ID NO12一組的肽形成的復合體。
21.治療帶有癌變的患者的方法，所述癌變的特征是在其表面呈遞HLA-A2與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10以及SEQ ID NO12一組的肽形成的復合體的癌細胞，所述方法包括對所說的患者給予足以溶解所說癌細胞的量的權利要求16的分離的細胞溶解性T細胞克隆。
22.鑒定處于癌變狀況的患者的方法，包括使從所說患者中取得的樣品于體外接觸對HLA-A2與選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQID NO10以及SEQ ID NO12一組的肽形成的復合體有特異性的試劑，確定由所說的試劑與所說樣品中的細胞的反應來確定癌變癥狀。
23.權利要求22的方法，其中所說的試劑是細胞溶解性T細胞克隆。
24.權利要求22的方法，其中所說的試劑是單克隆抗體。
25.激活T細胞的方法，包括使T細胞接觸足以激活所說T細胞的數量的IL-6和IL-12的結合物。
26.權利要求25的方法，其中所說的T細胞是細胞溶解性T細胞。
27.權利要求25的方法，其中所說的IL-6的給藥量從大約500-1000u/ml，所說的IL-12的給藥量從約1-10ng/ml。
28.用于激活T細胞的藥盒，包括分開的IL-6和IL-12各一份，其量足以激活T細胞，以及包裝這兩個獨立成分的容器。
29.權利要求28的藥盒，還包括一份分開的肽。
30.權利要求28的藥盒，還包括一種編碼MHC分子的核酸分子。
31.權利要求28的藥盒，還包括一種編碼MHC分子以及被所說的MHC分子呈遞的肽的核酸分子。
32.權利要求28的藥盒，還包括一種編碼腫瘤排斥抗原前體或腫瘤排斥抗原的核酸分子。
33.權利要求28的藥盒，還包括一種編碼MHC分子以及能加工成被所說的MHC分子呈遞的腫瘤排斥抗原的腫瘤排斥抗原前體的核酸分子。
34.基本上由其量足以刺激T細胞的IL-6及IL-12組成的組合物。
35.權利要求34的組合物，其中所說的IL-6的數量范圍從大約500ug/ml到大約1000ug/ml。
36.權利要求34的組合物，其中所說的IL-12的數量范圍從大約1ng/ml到大約10ng/ml。
全文摘要
本發明鑒定了衍生于MAGE腫瘤排斥抗原前體的腫瘤排斥抗原。這些“TRAs”結合MHC-I類分子HLA-A2，所得到的復合體刺激溶解呈遞細胞的細胞溶解性T細胞的產生。該肽與復合體能用于診斷，治療，以及作為生產抗體的免疫原，或作為產生細胞溶解性T細胞克隆的靶等多種用途。
文檔編號C07K7/06GK1150805SQ95192261
公開日1997年5月28日 申請日期1995年3月22日 優先權日1994年3月24日
發明者阿蘭·湯森, 朱迪·巴斯廷, 蒂爾瑞·博恩-法勒爾, 皮埃爾·范德布魯根, 皮埃爾·庫利, 托馬斯·加耶夫斯基, 科尼利斯·J·M·梅利夫, M·W·威塞倫, W·M·凱斯特 申請人:路德維格癌癥研究所, 牛津大學, 萊頓大學