可評價脂肪基質細胞成骨向分化的螢光素酶報告系統的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶報告系統，將小鼠骨鈣素的啟動子克隆到螢光素酶報告基因的上游，當有成骨向分化潛能細胞(如脂肪基質細胞)向成骨細胞分化時，成骨相關的啟動子轉錄活性增強，能激活螢光素酶表達，能夠快捷、特異且定量的檢測出細胞在體外的成骨向分化情況，并且使將來能夠活體監測小動物外源移植細胞的成骨分化成為可能。
【專利說明】可評價脂肪基質細胞成骨向分化的螢光素酶報告系統
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種成骨向分化檢測技術，尤其涉及一種可評價脂肪基質細胞成骨向 分化的螢光素酶報告系統。
【背景技術】
[0002] 自從提出組織工程的概念以來，組織工程尤其是骨組織工程獲得了飛速發展，目 前被認為是最快能獲實際應用的領域。十余年來大量工作圍繞骨組織工程三要素（細胞， 支架材料，生長因子）開展。而幾乎所有的研究，都會用到成骨的檢測與評價。
[0003] 現有技術中，比較常用的成骨向分化檢測方法包括堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅 染色等方法檢測鈣的含量以及反轉錄-實時定量PCR檢測骨形成的分化標記物等（如I型 膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白等）。
[0004] 堿性磷酸酶能通過水解磷脂釋放出無機磷，增加局部鈣、磷的濃度，并在膠原原纖 維中沉積，從而促進基質鈣化。堿性磷酸酶檢測是骨組織工程使用最多的檢測骨形成和骨 間質礦化的手段，堿性磷酸酶活性的高低是反映成骨細胞成熟狀態的一個重要指標，然而 該方法的特異性較低，因此使其應用受到了一定的限制；茜素紅能與鈣離子以螯合方式形 成復合物，用來識別組織細胞的鈣鹽成分。通過茜素紅染色，產生桔紅色沉積（即鈣結節）， 但會受到其他金屬離子的干擾；反轉錄實時定量PCR雖然在檢測成骨分化時具備特異性 高、敏感性高等特點，但是其操作需經歷RNA提取反轉錄等繁瑣步驟，另外受制于熒光定量 試劑的高成本，使其在處理較大樣本量情況下力不從心。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種能夠快捷、特異且定量的檢測出細胞在體外的成骨向分 化情況的可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶報告系統。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0007] 本發明的可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶報告系統，將成骨 相關的啟動子克隆到螢光素酶報告基因的上游，當有成骨向分化潛能細胞向成骨細胞分化 時，成骨相關的啟動子轉錄活性增強，能激活螢光素酶表達。
[0008] 由上述本發明提供的技術方案可以看出，本發明實施例提供的可評價有成骨向分 化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶報告系統，由于將成骨相關的啟動子克隆到螢光素酶報 告基因的上游，當有成骨向分化潛能細胞向成骨細胞分化時，成骨相關的啟動子轉錄活性 增強，能激活螢光素酶表達，能夠快捷、特異且定量的檢測出細胞在體外的成骨向分化情 況，并且使將來能夠活體監測小動物外源移植細胞的成骨分化成為可能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發明實施例提供的可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素 酶報告系統的構建及檢測流程示意圖；
[0010] 圖2為本發明實施例中將小鼠骨鈣素的啟動子克隆到螢光素酶報告基因的上游 的構建過程示意圖；
[0011] 圖3為本發明實施例中茜素紅礦化結節染色實驗結果示意圖；
[0012] 圖4為本發明實施例中熒光素酶報告基因分析結果示意圖。
【具體實施方式】
[0013] 下面將對本發明實施例作進一步地詳細描述。
[0014] 本發明的可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶報告系統，其較佳 的【具體實施方式】是：
[0015] 將成骨相關的啟動子克隆到螢光素酶報告基因的上游，當有成骨向分化潛能細胞 向成骨細胞分化時，成骨相關的啟動子轉錄活性增強，能激活螢光素酶表達。
[0016] 所述成骨相關的啟動子包括小鼠骨鈣素的啟動子。
[0017] 將所述成骨相關的啟動子克隆到螢光素酶報告基因的上游后，進行慢病毒的包裝 并篩選出陽性克隆后，感染需評價的有成骨向分化潛能細胞。
[0018] 所述有成骨向分化潛能細胞包括脂肪基質細胞。
[0019] 骨鈣素 Osteocalsin (0C)是成骨標志物的一種，本發明將小鼠骨鈣素 (Osteocalsin，0C)的啟動子克隆到螢光素酶Luciferase報告基因的上游，篩選出陽性克 隆，進行慢病毒的包裝后感染有成骨向分化潛能細胞（如人脂肪基質細胞），成功構建出了 可用于評價成骨向分化的螢光素酶報告系統，該方法能夠快捷、特異且定量的檢測出細胞 在體外的成骨向分化情況，并且使將來能夠活體監測小動物外源移植細胞的成骨分化成為 可能。
[0020] 當細胞向成骨細胞分化時，0C的啟動子轉錄活性增強，從而激活螢光素酶表達。 為了驗證該系統的有效性，在hASCs成骨誘導的第7、14天，同時進行了熒光素酶報告基因 的檢測和茜素紅鈣化結節染色實驗，結果熒光素酶表達的趨勢與茜素紅染色一致，驗證了 該系統的良好效能。
[0021] 具體實施例，如圖1所示：
[0022] 1.構建 pLVX-〇Cpr()-Luc-Puro 載體：
[0023] 為了將小鼠的0C的啟動子（從-1100到+163)克隆到螢光素酶Luciferase報告 基因的上游，構建示意圖如圖2所示。
[0024] 首先以小鼠的基因組DNA為模板PCR擴增小鼠0C啟動子（OCpro)以及以 ERE-tk-Luc載體為模板PCR擴增Luciferase (Luc)的編碼序列；然后分別使用XhoI/BamHI 酶切0C啟動子的PCR產物，BamHI/Notl酶切Luc編碼序列的PCR產物，將二者純化作為插 入片段；利用Xhol和Notl將pLentiX-pTRE-puro的pTRE啟動子序列切掉后將剩余質粒片 段作為載體，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Qiagen，德國）回收線性化的載體，將以上三者者 按照OCpro/Luc/載體=6 :6:1 (分子數比）的比例混合，用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸 桿菌DH5a感受態菌株，在含氨芐青霉素（lOOmg/L)的平皿培養12?16h。挑單克隆培養 12小時后，利用PCR方法鑒定OCpro以及Luc是否成功插入載體中，將雙陽性克隆送上海英 俊生物技術有限公司測序。
[0025] 2.慢病毒的包裝：
[0026] 按如下要求準備：pLVX-〇Cpr〇-Luc-Puro:pMDLg/pRRE:pRSV-REV:pVSVG = 2:1:1:1,共25g質粒。1.5ml無血清的改良伊格爾培養基稀釋60 μ 1脂質體Lipofectamin 2000(InVitr〇gen，美國）；混勻，25°C放置5min ;1. 5ml無血清的改良伊格爾培養基稀釋 25 μ g DNA，混勻；將上述稀釋液混合后，混勻，25°C放置20min。將3ml的混合液加入含有適 量培養基的293T細胞的培養皿（10cm)中。37°C孵育，4?6h更換新鮮的培養基。24h收 集上清液；4°C避光保存。48h再次收集上清液。4000Xg離心5min，棄沉淀，0.45μπι濾器 過濾上清液。超速離心，濃縮含病毒的上清液。收集病毒濃縮液，分裝適量的病毒液進行感 染實驗。
[0027] 3.噪呤霉素（Puromycin)篩選陽性克隆：
[0028] 由于構建的pLVX-OCpro-Luc-Puro質粒帶有噪呤霉素抗性，因此經慢病毒 pLVX-OCpro-Luc-Puro感染的hASCs細胞能在嘌呤霉素抗性培養基中存活.在慢病毒感 染的hASCs培養基中加入Puromycin(lg/ml)4-5天后，可篩選出陽性克隆，獲得穩定整合 OCpro-Luc-Puro 的細胞株。
[0029] 4. OCpro-Luc-Puro-hASC 的成骨向分化誘導：
[0030] OCpro-Luc-Puro-hASC接種于6孔板，慢病毒感染細胞。使用增殖培養 基（DMEM+10 % FBS+抗生素）或成骨誘導培養基（DMEM+10 % FBS+100nmol/L地塞米 松+0. 2mmol/L抗壞血酸+10mmol/L β -甘油磷酸+抗生素）分別培養7-14天，觀察 0Cpr〇-Luc-Pur〇-hASC在成骨誘導環境下分化的情況。
[0031] 5. OCpro-Luc-Puro-hASC 成骨向分化的檢測：
[0032] 通過檢測成骨向分化后螢光素酶的活性，與茜素紅染色和ALP的強度比較，驗證 熒光素酶報告系統用于成骨評價的可行性。
[0033] 5. 1茜素紅礦化結節染色實驗：
[0034] 成骨誘導分化第7、14天，檢測兩個敲低組及對照組hASC茜素紅鈣化結節染色的 差異。70%乙醇室溫下固定30min ;蒸饋水沖洗兩次后，1 %茜素紅（1 % Κ0Η調節pH值至 4. 2) 500 μ 1/孔固定，室溫孵育30min ;蒸餾水沖洗3次，棄去沖洗蒸餾水。
[0035] 如圖3所示，在hASC成骨誘導的第7、14天，茜素紅鈣化結節染色結果均為陽性， 且第14天的染色結果明顯強于第7天。
[0036] 5. 2 突光素酶報告基因分析（Luciferase reporter assay):
[0037] 成骨誘導分化第7、14天，用冷PBS清洗2次細胞，將1 X細胞裂解液（PLB) 100 μ 1 加入每個細胞培養孔。室溫孵育15分鐘，使細胞充分裂解。所得到的細胞裂解液可直接用 于熒光測量。將螢火蟲熒光素酶底物冷凍干粉溶于l〇ml熒光素酶分析緩沖液中，所得溶液 為LARII，分裝，-70°C保存。測量時將20 μ 1細胞裂解液放入96孔熒光測量板，加入50 μ 1 LARII，測量螢火蟲熒光素酶，測量條件為：延遲2秒，測量10秒。
[0038] 如圖4所示，在hASC成骨誘導的第7、14天，熒光素酶被激活，且熒光素酶的表達 在14天明顯強于第7天。熒光素酶表達的趨勢與茜素紅染色一致，驗證了該系統的良好效 能。
[0039] 本發明的有益效果：
[0040] 本發明構建的檢測成骨向分化的螢光素酶報告系統，可以通過螢光素活性的高低 定量，快捷且特異的評價hASCs成骨向分化的能力，并且該系統可以作為高通量篩選影響 hASCs成骨分化重要因子的平臺。高通量篩選技術是近年來應用廣泛的一門技術，并隨著 組合化學、微芯片技術和基因組學的發展而不斷發展；在本發明構建系統的基礎上，通過 RNAi篩選或小分子藥物的篩選，就可以全面系統而快速的篩選出與成骨向分化相關的重要 因子，為本發明研究干細胞的成骨向分化打下基礎。該系統基于慢病毒載體構建和藥物壓 力篩選穩定克隆，除了用于評價hASCs的成骨分化，還可以用于研究骨髓基質細胞以及其 它多潛能干細胞的成骨分化機制。
[0041] 在體外實驗時堿性磷酸酶和茜素紅染色等方法都可以用來檢測細胞成骨向的分 化，但是當需要觀察細胞在體內的成骨向分化情況時以上方法就都不再適用了。目前常用 的方法是取材后進行X射線照射，HE染色和免疫組織化學等方法，若是需要觀察細胞隨時 間的成骨向分化情況，則需要在不同的時間點取材，這樣實驗的時間和成本都是很高的。目 前尚無報道可以不用體外取材，在體連續觀察細胞的成骨向分化情況。
[0042] 生物發光成像技術是近年發展起來的一項可在活體動物中直接測定生物發光信 號的新技術。突光素酶（luciferase)在底物突光素（luciferin)存在的情況下催化底物 產生生物發光，可被成像系統檢測。熒光素酶只在活細胞內產生發光現象，光的強度與標記 細胞的數目成正比，為實驗研究提供了很好的定量指標。生物發光和熒光成像作為近年來 新興的活體動物體內光學成像技術，以其操作簡便及直觀性成為研究小動物活體成像的一 種理想方法，在生命科學研究中得以不斷發展。利用這種成像技術，可以實時觀察標記的基 因及細胞在活體動物體內的變化及運動。該方法已用于腫瘤生長及治療效果的研究，但在 骨組織工程領域還沒有應用。本發明構建了 pLVX-OCpro-Luc-Puro載體，并篩選到可以進 行正常成骨分化的OCpro-Luc-Puro-hASCs細胞，在將來的工作中，本發明將致力于通過該 系統將活體動物體內光學成像技術引入骨組織工程學，使在體觀察細胞的成骨向分化成為 可能。
[0043] 本發明成功建立了可評價干細胞成骨向分化的螢光素酶報告基因系統，并通過傳 統的成骨向分化檢測方法對該系統的有效性進行了驗證。該系統的建立，為骨組織工程學 中成骨檢測提供了一種新的方法，對于成骨相關因子的篩選，以及干細胞在體內外成骨向 分化的檢測都具有非常重要的意義。
[0044] 應用本發明，將其他成骨相關啟動子克隆到螢光素酶Luciferase報告基因的上 游，當細胞向成骨細胞分化時，啟動子轉錄活性增強，也可以激活螢光素酶表達，構建類似 的系統。
[0045] 以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換， 都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求書的保護范 圍為準。
【權利要求】
1. 一種可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶報告系統，其特征在于， 將成骨相關的啟動子克隆到螢光素酶報告基因的上游，當有成骨向分化潛能細胞向成骨細 胞分化時，成骨相關的啟動子轉錄活性增強，能激活螢光素酶表達。
2. 根據權利要求1所述的可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶報告 系統，其特征在于，所述成骨相關的啟動子包括小鼠骨鈣素的啟動子。
3. 根據權利要求2所述的可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶報告 系統，其特征在于，將所述成骨相關的啟動子克隆到螢光素酶報告基因的上游后，進行慢病 毒的包裝并篩選出陽性克隆后，感染需評價的有成骨向分化潛能細胞。
4. 根據權利要求1、2或3所述的可評價有成骨向分化潛能細胞成骨向分化的螢光素酶 報告系統，其特征在于，所述有成骨向分化潛能細胞包括脂肪基質細胞。
【文檔編號】C12Q1/66GK104152536SQ201410403946
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】葛雯姝, 石磊 申請人:北京大學口腔醫學院