專利名稱：通過控制下丘腦的長鏈脂肪酰基－輔酶A(LC－CoA)的水平來調控食物攝取和葡萄糖產生的制作方法
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背景技術：
(1)發明領域本發明一般涉及調控食物攝取和葡萄糖產生的方法。更具體地說，本發明涉及通過控制下丘腦的脂類代謝來調控食物攝取和葡萄糖產生。
(2)相關技術描述引用的文獻Ahima，R.S.，Prabakaran，D.，Mantzoros，C.，Qu，D.，Maratos-Flier，E.，& Flier，J.S.Role of Leptin in the Neuroendocrine Response to Fasting.Nature 382，250-252(1996).
Air，E.L.，et al.Small Molecule Insulin Mimetics Reduce Food Intake and BodyWeight and Prevent Development of Obesity.Nat.Med.8，179-83(2002).
Ausman，L.M.，Rasmussen，K.M.，and Gallina，D.L.Am.J.Physiol241，R316-R321(1981).
Barzilai，N.，Wang，J.，Massilon，D.，Vuguin，P.，Hawkins，M.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 100，3105-3110(1997).
Berthoud，H.R.and Jeanrenaud，B.Endocrinology 105，146-151(1979).
Birikh，K.R.，Heaton，P.A. & Eckstein，F.the Structure，Function and Application ofthe Hammerhead Ribozyme.Eur.J.Biochem.245，1-16(1997).
Blazquez，C.，Sanchez，C.，Daza，A.，Galve-Roperh，I. & Guzman，M.the Stimulationof Ketogenesis by Cannabinoids in Cultured Astrocytes Defines Carnitine PalmitoyltransferaseI as a New Ceramide-activated Enzyme.J.Neurochem.72，1759-1768(1999).
Boden，G.，Chen，X.，Ruiz，J.，White，J.V.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 93，2438-2446(1994).
Boussif，O.et al.A Versatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cellsin Culture and in VivoPolyethylenimine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，7297-7301(1995).
Brief，D.J.and Davis，J.D.Brain Res.Bull.12，571-575(1984).
Bruning，J.C.，et al.Role of Brain Insulin Receptor in Control of Body Weight andReproduction.Science 289，2122-25(2000).
Cinti，S.，Frederich，R.C.，Zingaretti，M.C.，De Matteis，R.，Flier，J.S.，and Lowell，B.B.Endocrinology 138，797-804(1997).
Clore，J.N.，Helm，S.T.，and Blackard，W.G.J.Clin.Invest 96，1967-1972(1995).
Combs，T.P.，Berg，A.H.，Obici，S.，Scherer，P.E.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 108，1875-1881(2001).
Coleman，D.L.Diabetologia 14，141-148(1978).
Coleman，D.L.Science 203，663-665(1979).
Di Marzo，V.，et al.Leptin-regulated Endocannabinoids Are Involved in MaintainingFood Intake.Nature 410，822-825(2001).
Esser，V.，Britton，C.H.，Weis，B.C.，Foster，D.W. & McGarry，J.D.Cloning，Sequencing，and Expression of a cDNA Encoding Rat Liver Camitine Palmitoyltransferase I.Direct Evidence That a Single Polypeptide Is Involved in Inhibitor Interaction and CatalyticFunction.J.Biol.Chem.268，5817-5822(1993).
Flegal，K.M.，Carroll，M.D.，Ogden，C.L.，and Johnson，C.L.JAMA 288，1723-1727(2002).
Frederich，R.C.，Hamann，A.，Anderson，S.，Lollmann，B.，Lowell，B.B.，and Flier，J.S.Nat.Med.1，1311-1314(1995).
Friedman，J.M..Obesity in the New Millennium.Nature 404，632-634(2000).
Friedman，J.M.Science 299，856-858(2003).
Giaccari，A.and Rossetti，L.J.Chromatogr.497，69-78(1989).
Giaccari，A.and Rossetti，L.J.Clin.Invest 89，36-45(1992).
Goto M.，Spitzer J.J.Fatty Acids Profiles of Various Lipids in the Cerebrospinal Fluid.Proc.Exp.Biol.Med.136，1294-1296(1971).
Goula，D.et al.Size，Diffusibility and Transfection Performance of Linear PEI/DNAComplexes in the Mouse Central Nervous System.Gene Ther.5，712-717(1998).
Halaas，J.L.，Boozer，C.，Blair-West，J.，Fidahusein，N.，Denton，D.A.，and Friedman，J.M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，8878-8883(1997).
Hall，J.E.，Brands，M.W.，Zappe，D.H.，Dixon，W.N.，Mizelle，H.L.，Reinhart，G.A.，and Hildebrandt，D.A.Hypertension 25，994-1002(1995).
Hawkins，M.，et al.Diabetes 51，2179-2189(2002).
Hill，J.O. & Peters，J.C.Environmental Contributions to Obesity.Science 280，1371(1998).
Kopelman，P.G. & Hitman，G.A.Diabetes.Exploding typeII.Lancet 352，SIV5(1998).
Kraegen，E.W.，Clark，P.W.，Jenkins，A.B.，Daley，E.A.，Chisholm，D.J.，andStorlien，L.H.Diabetes 40，1397-1403(1991).
Inoue，S.and Bray，G.A.Endocrinology 100，108-114(1977).
Kahn，B.B.and Flier，J.S.J.Clin.Invest 106，473-481(2000).
Kersten，S.EMBO Rep.2，282-286(2001).
Liu，et.al.Intraeerebroventricular(ICV)Leptin Regulates Hepatic but Not PeripheralGlucose Fluxes.J.Biol.Chem.273，31160(1998).
Loftus，T.M.，Jarkowsky，D.E.，Frehynot，G.L.，Towsend，C.A.，Ronnet，G.V.，LaneM.D.，Kuhajda，F.P.Reduced Food Intake and Body Weight in Mice Treated with Fatty AcidSynthase Inhibitors.Science 288，2379(2000).
Lunzer，M.A.，Manning，J.A.，& Ockner，R.K.Inhibition of Rat Liver Acetyl-CoACarboxylase by Long-chain Acyl CoA and Fatty Acid.J.Biol.Chem.252，5283(1977).
Makimura，H.，Mizuno，T.M.，Yang，X.J.，Silverstein，J.，Beasley，J.，& Mobbs，C.V.Cerulenin Mimics Effects of Leptin on Metabolic Rate，Food Intake，and Body WeightIndependent of the Melanocortin System，but Unlike Leptin，Cerulenin Fails to BlockNeuroendocrine Effects of Fasting.Diabetes 50，733-739(2001).
Massillon，D.，Chen，W.，Barzilai，N.，Prus-Wertheimer，D.，Hawkins，M.，Liu，R.，Taub，R.，and Miller，J.C.，Gnaedinger，J.M.，and Rapoport，S.I.J.Neurochem.49，1507-1514(1987).
Massillon，D.，Barzilai，N.，Chen，W.，Hu，M.，and Rossetti，L.J.Biol.Chem.271，9871-9874(1996).
Massillon，D.，Barzilai，N.，Hawkins，M.，Prus-Wertheimer，D.，and Rossetti，L.Diabetes 46，153-157(1997).
McGarry，G.D.，Mannaert，G.P.，Foster，D.W.A Possible Role for Malonyl-CoA in theRegulation of Hepatic Fatty Acid Oxidation and Ketogenesis.J.Clin.Invest.60，265-270(1977).
Miller，J.C.，Gnaedinger，J.M.，Rapaport，S.I.Utilization of Plasma Fatty Acid in RatBrainDistribution of[14C]Palmitate Between Oxidative and Synthetic Pathways.J.Neurochem.49，1507-1514(1987).
Morgan，K.，Obici，S.，Feng，Z.，& Rossetti，L.Central Effects of Oleic Acid onGlucose Production Are Nutritionally Regulated.Keystone Symposia Abstract Book，Keystone，Colorado，January 10-16，2002(2002).
Neel，J.V.Nutr.Rev.57，S2-S9(1999).
NHLBI(National Heart，Lung，and Blood Institute)Obesity Education Initiative.ThePractical Guide-Identification，Evaluation and Treatment of Overweight and Obesity inAdults.NIH Publication No.00-4084(2000).Obtainable athttp://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/obesity/prctgd_b.pdf.
Obici，S.，Feng，Z.，Tan，J.，Liu，L.，Karkanias，G.& Rossetti，L.Central MelanocortinReceptors Regulate Insulin Action.J.Clin.Invest.108，1079-1085(2001).
Obici，S.，Feng，Z.，Morgan，K.，Stein，D.，Karkanias，G.& Rossetti，L.CentralAdministration of Oleic Acid Inhibits Glucose Production and Food Intake.Diabetes 51，271-275(2002a).
Obici，S.，Feng，Z.，Karkanias，G.，Baskin，D.G.，and Rossetti，L.DecreasingHypothalamic Insulin Receptors Causes Hyperphagia and Insulin Resistance in Rats.Nat.Neurosci.5，566-572(2002b).
Obici，S.，Feng，Z.，Morgan，K.，Conti，R.，Arduini，A.，& Rossetti，L.Inhibition ofHypothalamic Carnitine Palmitoyltransferase I(CPT-1)Inhibits Glucose Production and FoodIntake.Keystone Symposia Abstract Book，Keystone，Colorado，January 10-16，2002(2002c).
Obici，S.，Wang，J.，Chowdury，R.，Feng，Z.，Siddhanta，U.，Morgan，K.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 109，1599-1605(2002d).
Obici，S.，Zhang，B.B.，Karkanias，G.，and Rossetti，L.Nat.Med.8，1376-1382(2002e).
Obici，S.，Feng，Z.，Karkanias，G.，Baskin，D.G.，and Rossetti，L.Nat.Neurosci.5，566-572(2002f).
Obici，S.，Feng，Z.，Arduini，A.，Conti，R.，and Rossetti，L.Nat.Med.9，756-761(2003).
Ogden，C.L.，Flegal，K.M.，Carroll，M.D.，and Johnson，C.L.JAMA 288，1728-1732(2002).
Pagliassotti，M.J.，Gayles，E.C.，and Hill，J.O.Ann.N.Y.Acad.Sci.827，431-448(1997).
Palkovits M.Isolated Removal of Hypothalamic or Other Brain Nuclei of the Rat.Brain Research.59，449-450(1973).
Paxinos，G.，and Watson，C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.3rd Edition，Academic Press，CA，USA(1997).
Pitha，J.，Gerloczy，A.，and Olivi，A.J.Pharm.Sci.83，833-837(1994).
Porte，D.，Jr.，Seeley，R.J.，Woods，S.C.，Baskin，D.G.，Figlewicz，D.P.，andSchwartz，M.W.Diabetologia 41，863-881(1998).
Qi，K.，Hall，M.，and Deckelbaum，R.J.Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab Care 5，133-138(2002).
Rajala，M.W.，Obici，S.，Scherer，P.E.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 111，225-230(2003).
Rapoport，S.I.Lipids 31 Suppl，S97-101(1996).
Rapoport，S.I.J.Mol.Neurosci.16，243-261(2001).
Ravussin，E.and Gautier，J.F.Int.J.Obes.Relat Metab Disord.23 Suppl 1，37-41(1999).
Rebrin，K.，Steil，G.M.，Getty，L.，and Bergman，R.N.Diabetes 44，1038-1045(1995).
Roden，M.，Price，T.B.，Perseghin，G.，Petersen，K.F.，Rothman，D.L.，Cline，G.W.，and Romsos，D.R.，Miller，E.R.，and Leveille，G.A.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.157，528-530(1978).
Rossetti，L.，Giaccari，A.，Barzilai，N.，Howard，K.，Sebel，G.，and Hu，M.J.Clin.Invest 92，1126-1134(1993).
Rossetti，L.，Barzilai，N.，Chen，W.，Harris，T.，Yang，D.，and Rogler，C.E.J.Biol.Chem.271，203-208(1996).
Rossetti，L.J.Biol.Chem.273，228-234(1998).
Schemmel， R.，Mickelsen，O.，and Gill，J.L.J.Nutr.100，1041-1048(1970).
Schwartz，M.W.，Seeley，R.J.，Campfield，L.A.，Burn，P.，and Baskin，D.G.J.Clin.Invest 98，1101-1106(1996a).
Schwartz，M.W.，Baskin，D.G.，Bukowski，T.R.，Kuijper，J.L.，Foster，D.，Lasser，G.，Prunkard，D.E.，Porte，D.，Jr.，Woods，S.C.，Seeley，R. J.，and Weigle，D.S.Diabetes 45，531-535(1996b).
Schwartz，M.W.，Woods，S.C.，Porte，D.Jr.，Seeley，R.J.，Baskin，D.G.CentralNervous System Control of Food Intake.Nature 404，661-671(2000).
Sclafani，A.and Springer，D.Physiol Behav.17，461-471(1976).
Shimazu，T.，Matsushita，H.，and Ishikawa，K Brain Res.144，343-352(1978).
Shimazu，T.Nutrition 12，65-66(1996).
Shimokawa，T.，Kumar，M.V.，& Lane，M.D.Effect of a Fatty Acid Synthase Inhibitoron Food Intake and Expression of Hypothalamic Neuropeptides.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，66-71(2002).
Shimomura，I.，Hammer，R.E.，Ikemoto，S.，Brown，M.S.，and Goldstein，J.L.Nature401，73-76(1999).
Shulman，G.I.J.Clin.Invest 97，2859-2865(1996).
Spiegelman，B.M.and Flier，J.S.Cell 104，531-543(2001).
Thupari，J.N.，Landree，L.E.，Ronnett，G.V.，and Kuhajda，F.P.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99，9498-9502(2002).
Wang，Q.，Bing，C.，Al Barazanji，K.，Mossakowaska，D.E.，Wang，X.M.，McBay，D.L.，Neville，W.A.，Taddayon，M.，Pickavance，L.，Dryden，S.，Thomas，M.E.，McHale，M.T.，Gloyer，I.S.，Wilson，S.，Buckingham，R.，Arch，J.R.，Trayhurn，P.，and Williams，G.Diabetes46，335-341(1997).
Wang，J.，Liu，R.，Hawkins，M.，Barzilai，N.，Rossetti，L.A Nutrient-sensing PathwayRegulates Leptin Gene Expression in Muscle and Fat.Nature 393，684-688(1998).
Wang，J.，Obici，S.，Morgan，K.，Barzilai，N.，Feng，Z.，and Rossetti，L.Diabetes 50，2786-2791(2001).
West，D.B.，Boozer，C.N.，Moody，D.L.，and Atkinson，R.L.Am.J.Physiol 262，R1025-R1032(1992).
West，D.B.，Waguespack，J.，and McCollister，S.Am.J.Physiol 268，R658-R665(1995).
Widdowson，P.S.，Upton，R.，Buckingham，R.，Arch，J.，and Williams，G.Diabetes 46，1782-1785(1997).
Woods，S.C.，Lotter，E.C.，McKay，D.L.，&Porte，D.Jr..ChronicIntracerebroventricular Infusion of Insulin Reduces Food Intake and Body Weight of Baboons.Nature.282，503-5(1979).
Woods，S.C.，Seeley，R.J.，Porte，D.，Jr.，and Schwartz，M.W.Science 280，1378-1383(1998).
Yaksh，T.L.，Jang，J.D.，Nishiuchi，Y.，Braun，K.P.，Ro，S.G.，and Goodman，M.LifeSci.48，623-633(1991).
Zammit，V.A.Regulation of Ketone Body Metabolism.A Cellular Perspective.Diabetes Rev.2，132-155(1994).
Zhang，Y.，Proenca，R.，Maffei，M.，Barone，M.，Leopold，L.，and Friedman，J.M.Nature 372，425-432(1994).
復雜的代謝性疾病例如肥胖和2型糖尿病是基因和環境之間的多種交互作用的結果(Hill和Peters，1998；Kopelman和Hitman，1998)。下丘腦的中心感覺外周營養的存在，部分是通過多余的營養引起的外周信號例如瘦素(Leptin)和胰島素(Woods等人，2000；Bruning等人，2000；Friedman，2000；Air等人，2002；S；chwartz等人，2000；Ahima等人，1996；Wang等人，1998)以及通過直接的代謝信號，例如，通過添加油酸到下丘腦(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；Makimura等人，2001；Shimokawa等人，2002)。在這點上，在選擇性的下丘腦神經元中的脂類代謝已經被假定為營養存在的中樞生物傳感器，其反過來對食物攝取(Loftus等人，2000；Makimura等人，2001；Obici等人，2002a；Obici等人，2002c；Shimokawa等人，2002)以及體內葡萄糖產生(GP)(Obici等人，2002a)施加一種負反饋。到目前為止這一理論還沒有被確定，以及現在有一些證據表明這種負反饋對于過量進食的動物是無效的(Morgan等人，2002)。
因此，這里需要進一步說明下丘腦代謝信號的中樞機制。本發明滿足了這種需求。
發明概述因此，發明人發現了哺乳動物中食物攝取和葡萄糖產生可以通過調控哺乳動物下丘腦長鏈脂肪酰基-輔酶-A(LC-CoA)的水平來進行調整。
因此，本發明涉及減少哺乳動物中食物攝取和葡萄糖產生的方法。該方法包括增加下丘腦LC-CoA的水平。在這些方法中，哺乳動物優選具有至少一種選自以下的病癥肥胖、2型糖尿病、瘦素抗性、胰島素抗性、促性腺激素缺乏癥、無月經和多囊卵巢綜合癥。
在另外的實施方式中，本申請涉及提高哺乳動物中食物攝取和葡萄糖產生的方法。這種方法包括減少哺乳動物下丘腦LC-CoA的水平。在這些方法中這種哺乳動物優選處于一種特征在于食物攝取和葡萄糖產生缺乏的狀態下。
本發明另外涉及在肝臟自我調整功能不全的哺乳動物體內修復肝臟的自我調整功能的方法。這種方法包括增加哺乳動物下丘腦中長鏈脂肪酰基-輔酶-A(LC-CoA)的水平。
在另外的實施方式中，本發明涉及減少哺乳動物中食物攝取和葡萄糖產生的方法。這種方法包括刺激肝細胞迷走神經傳出纖維。
本申請還涉及在肝臟自我調控功能不全的哺乳動物中修復肝臟自我調整功能的方法。這種方法包括刺激一種肝細胞迷走神經傳出纖維。
附圖簡述
圖1所示的圖表，northern印跡，和圖形描述了與下丘腦肉堿棕櫚酰基轉移酶1(CPT1)的抑制有關的脂類代謝和實驗的特點。圖A顯示了一種被提議的CPT1在下丘腦中調控食物攝取作用的模型。有效的節食藥物例如脂肪酸合酶(FAS)抑制劑提高了丙二酰-輔酶A的水平，其得自于乙酰基-輔酶A羧化酶(ACC)對乙酰基-輔酶A所進行的羧化反應。丙二酰-輔酶A的高水平反過來抑制依賴CPT1的長鏈脂肪酰基-輔酶-A(LC-CoA)的氧化反應。類似的，外源脂肪酸(LCFA)的ICV施用直接提高了LC-CoA的細胞水平。在任一種情況下提高細胞內LC-CoA濃度的結果導致了對進食行為的抑制。圖B顯示了在整個大鼠下丘腦中CPT1表達的northern印跡分析。左邊CPT1的肝臟同種型(isoform)的特異探針(CPT1L)在肝臟中(L)和下丘腦(H)檢測到～4.3Kb的條帶，但是在后肢肌肉中沒有檢測到(M)。右邊與肌肉特異CPT1探針雜交后(CPT1M)在肝臟(L)和肌肉(M)中檢測到約3Kb的片段，但是下丘腦中沒有。每一泳道(lame)含有1.5μg的mRNA。圖C顯示為CPT1L mRNA選擇的核酶設計。CPT1L-Ribo轉錄子(更低的序列)包含一段中心序列其具有特征為錘頭狀核酶的基環結構，兩側的序列可以與目標CPT1L mRNA(上面的序列)進行雜交。箭頭標記了預測的切割位點。圖D顯示了CPT1L-Ribo質粒的構建。將CPT1L-Ribo片段克隆到在CMV啟動子控制下的哺乳動物表達載體中(pTarget)內含子盒的下游以及SV40聚腺苷酸化信號(An)的上游。圖E顯示表達CPT1L-Ribo的AtT20細胞減少了CPT1L mRNA的水平。通過新霉素抗性選擇了大約200個穩定的克隆選擇用于northern印跡的分析。每一條泳道含有1.0μg的來自僅僅利用載體(泳道A)進行轉染，CPT1L-Ribo質粒(泳道B)轉染，或者沒有轉染的(泳道C)的AtT20的多聚腺苷酸化的mRNA。印跡點與CPT1L探針(上面的電泳圖)或者與β-肌動蛋白(下面的電泳圖)進行雜交。圖F顯示了AtT20northern印跡的量化分析。表達CPT1L-Ribo的細胞(■)與單獨用載體轉染對照細胞(□)相比含有少于～50％的CPT1L mRNA。數據在利用β-肌動蛋白表達標準化后用對照的％進行表達。圖G顯示了CPT1抑制劑的系統施用增加了細胞內LC-CoA的水平。利用HPLC測試到靜脈滴注對照(■)或CPT1抑制劑(□)的大鼠的肝臟和骨骼肌組織的LC-CoAs水平。
圖2所示的實驗結果總結得到的圖表確定了遺傳學和藥理學上的CPT1抑制作用在弓狀核中降低了CPT1活性并提高了LC-CoAs水平。圖A顯示了一個試驗步驟的示意圖。在第一天實現手術植入ICV套管(在進行體內研究前三周)。在第7天實現了體重和食物攝取的完全恢復。在第17天進行隨機化核酶處理的大鼠接受CPT1L-Ribo，CPT抑制劑或對照的ICV注射。在第21天，在收獲大腦前6小時進行TDGA處理的實驗組接受抑制劑的ICV注射。圖B.和C.顯示了經過實時PCR的CPT1L(B)和CPT1M(C)mRNA數量。RNA從個體的下丘腦核中(PVN，LHA，和弓狀核)進行純化，其是在pTarget對照(■；N＝4)或CPT1L-Ribo(□；N＝5)ICV注射后3天利用微孔技術得到的。CPT1 mRNA的拷貝數利用β-肌動蛋白拷貝數×106進行標準化。圖D.和E.顯示了在個體的弓狀核(D)或整個下丘腦(E)中的CPT1活性。分別在TDGA或CPT1L-Ribo的ICV注射前6小時和3天進行大腦的收獲，以及弓狀核被利用微孔技術取出。在從經過ICV對照注射(■；N＝6，接受aCSF+2％DMSO或對照的Ribo)，TDGA( N＝6)或CPT1L-Ribo(□；N＝5)處理過的動物提取的蛋白質微部分中檢測CPT1活性。圖F和G確認了CPT1抑制劑的ICV施用增加了弓狀核中的LC-CoAs水平。在利用對照化合物(■；ST134O)或ST1326(□)ICV注射的大鼠弓狀核中分別測定得到硬脂酰-CoA(F)和油酰-CoA(G)的水平。
圖3所示的實驗數據總結得到的圖表通過遺傳學或藥理學方法確認了下丘腦CPT1L的抑制作用減少了食物攝取。圖A Sprague-Dawley大鼠在第0天接受單一的CPT1L-Ribo質粒(□)或對照載體(■)的ICV注射。在ICV注射CPT1L-Ribo后1～3天每日的食物攝取明顯被抑制。圖B顯示了由ICV CPT1L-Ribo(□)相比較于載體注射(■)引起的食物攝取的改變。與基值和載體相比檢測到了顯著的區別。圖C顯示了與載體對照(■)或核酶( )對照的ICV注射相比CPT1L-Ribo的ICV注射(□)對24小時食物攝取的影響。圖D顯示了在第0天進行ST1326(分別為5pmoles， 和25pmoles，-●-)或者無活性的立體異構體sT1340(-○-)的單次ICV注射后的每日食物攝取。ST1326的兩種劑量在第1天和第2天都產生了對食物攝取的具有統計學重要性的抑制作用。在第3天，與對照組相比只有高劑量的ST1326顯著降低了食物攝取。圖E顯示了由ICV ST1326(分別為5pmoles， 和25pmoles，□)，或對照ST1340(■)引起的食物攝取的改變。與基值和ST1340相比利用ICV ST1326檢測到顯著的區別。與對照組和基值進行對比*P＜0.001。僅僅對于高劑量ST1326與賦形劑相比#P＜0.01。圖F顯示了利用ICV CPT1L-Ribo對CPT1L的下調增加了在ARC中NPY和AgRP的表達。利用實時PCR對經過載體對照(■)或CPT1L-Ribo(□)處理的大鼠ARC中NPY和AgRP(上面的圖)和POMC(下面的圖)進行定量分析。神經肽mRNA水平利用每個β-肌動蛋白拷貝數×103的形式來表達其拷貝數。
圖4所示的實驗數據總結得到的圖表確認了下丘腦CPT1L的抑制作用改善了肝細胞胰島素作用但是沒有影響外周系統的胰島素作用。圖A顯示了實驗步驟的示意圖。在第一天實現手術的植入ICV套管(在進行體內研究前-三周)。在完全的修復后，在第14天放入靜脈導管以及在第17天進行CPT1L-Ribo或對照載體的ICV注射。最后，在第21天進行鉗夾研究。圖B顯示了胰腺的-胰島素鉗夾步驟的示意流程。滴注研究持續總共360min的時間。在鉗夾研究(如圖11所示)前3天以團(bolus)注方式使大鼠得到CPT1L-Ribo或對照載體。所有其他的組在t＝0時接受對照或CPT1抑制劑的預處理的-連續ICV注入，并在實驗的剩余時間進行保持。在t＝120時開始注入標記的葡萄糖(HPLC-純化的[3H-3]-葡萄糖；New England Nuclear，Boston，MA)并維持到實驗的最后4小時。最后，胰腺-胰島素鉗夾試驗在t＝120時進行并保持2小時。這個過程包括注入生長激素抑制素(3μg/kg/min)，胰島素(1mU/kg/min)，和葡萄糖來防止低血糖癥的步驟。胰島素注入的速率被設計成替代吸收后大鼠中的正常的基礎水平。圖B，D和F顯示了與它們的適當的對照進行對比在用ICV TDGA，ST1326和CPT1L-Ribo處理過的大鼠中進行胰腺-胰島素鉗夾試驗之前(■)和過程中(□)的葡萄糖的處理速率(Rd)。Rd不是顯著的受到ICV處理的影響。圖C，E和G顯示了與它們的適當的對照進行對比在用ICV TDGA，ST1326和CPT1L-Ribo處理過的大鼠中進行胰腺-胰島素鉗夾試驗之前(■)和過程中(□)的葡萄糖的生產速率(GP)。在開始胰腺-胰島素鉗夾試驗(■)之前GP在所有的處理組中都是相似的。在進行胰腺的鉗夾試驗過程中，在提供了～基礎的胰島素濃度時(□)，TDGA，ST1326和CPT1L-Ribo的ICV施用與單獨的ICV載體對照進行對比顯著抑制了GP(p＜0.01)。圖H顯示了相應于～基礎胰島素濃度時與它們各自的對照(aCSF+2％ DMSO，ST1340，對照載體)相比TDGA，ST1326和CPT1L-Ribo的施用可以顯著提高GP的抑制(％從吸收后水平所減少的)。
圖5是實驗結果的流程和圖的一個示意性的表述，其顯示在標準飼喂，高脂肪飲食，或高蔗糖飼喂的動物的每日食物攝取方面ICV油酸(OA)的作用。圖a顯示了飼喂試驗的試驗設計的示意性表述。隨著從ICV植入手術中恢復，所有的大鼠允許自由進食它們的標準正常飲食。在ICV注射前3天(-3天)，一組動物被轉為喂養更美味的飼料(高脂肪或高蔗糖)同時另一組繼續保持標準的飲食。所有的組都可以自由進食并且紀錄它們的每日食物攝取作為基值。在第0天，OA(30nmol)或者對照(HPB)都被作為ICV團注射。在注射后對所有的組持續3天監控其每日食物攝取。圖b顯示，在進行標準飲食的組中，ICV OA(●)迅速導致食欲減退的開始，并持續48小時。而ICV對照(▲)沒有顯著改變飲食行為。圖c顯示，在飼喂高脂肪飼料的動物中，ICY OA(●)或者ICV對照(▲)都沒有顯著改變每日的食物攝取。圖d顯示，在飼喂高蔗糖飼料的動物中，與ICV對照(▲)比較ICV OA(●)沒有顯著改變食物攝取。圖e顯示了在標準飼喂(■)，高蔗糖( )，或高脂肪飼喂(□)的動物中ICV注射后的1，2和3天的每日食物攝取的改變，顯示的是從基值(-2，-1和0天的平均值)下降的百分比。ICV Office Action在標準飼喂的大鼠中連續兩天顯著地降低了食物攝取(以～50％)；但是，ICV OA對于接受高蔗糖或高脂肪飼喂的大鼠沒能顯著改變其進食行為。數值是平均值±SEM的形式。對于對照*P＜0.001，對于對照**P＜0.0O01，對于標準進食組#P≤0.05。
圖6是試驗方案，試驗結果的照片和圖形的示意性描述，其顯示了ICV OA對于下丘腦NPY表達的影響被營養調控。圖a是對下丘腦NPY表達確定的實驗設計的示意性表述。在進行手術性ICV導管植入后10天并緊接著使所有的實驗動物完全的恢復，對大鼠飼喂高脂肪食物以55 kcal/d(55)或自由進食(140)持續3天。在第13天，將OA(+在圖b；n=6/組)或者對照(-；n=6/組)以ICV團注射的形式在暗循環開始前1小時注射進去。ICV注射后，將食物撤回并在注射后16小時收集下丘腦。圖b顯示了下丘腦NPY mRNA的northern分析的代表性印跡的照片。這項分析證明了與ICV對照相比在向大鼠以55kcal/d的量飼喂ICV OA后下丘腦NPY mRNA的減少。但是，ICV OA沒有顯著改變自由進食的大鼠的NPY mRNA。圖c顯示了利用密度計量學進行的northern印跡分析的定量，其證明在以55 kcal/d的量進行飼喂的動物中與ICV對照(■)相比ICV油酸(□)顯著的降低了下丘腦的NPY表達。ICV OA沒能顯著改變自由進食的動物的NPY表達。圖d顯示的數據表示了在以55 kcal/d的量進行飼喂或自由進食的動物中ICV賦形劑(左邊的柱)或自由進食(右邊的柱)的動物中與ICV對照相比ICV OA所引發的下丘腦NPY mRNA減少的百分數。所有的數據用β-肌動蛋白進行標準化。對于55 kcal/d #P＜O.05。
圖7顯示了實驗結果的圖表和方案，其說明了ICV OA對于全身胰島素活性的影響是受每日熱量攝取調控的。圖a是胰腺-胰島素鉗夾試驗的實驗設計方案的示意性描述。在對飲食進行干涉前至少2周進行手術性ICV導管的植入從而提供充足的時間進行恢復。相同地，血管內導管的植入在干涉飲食前4天完成。在第0天，大鼠分別以55kcal/d，80 kcal/d或者自由進食(～140 kcal/d)高脂肪飲食并持續3天。在鉗夾步驟進行前的晚上，所有的大鼠進行一次確定成分的進食(55 kcal)以確保它們在開始代謝實驗前處在一種可比較的吸收后狀態。圖b顯示了胰腺-胰島素鉗夾實驗步驟的示意圖。ICV OA或對照的滴注在實驗的開始進行(t＝-120)并且持續貫穿整個鉗夾實驗的全過程。在t＝0時注入標記的葡萄糖并且一直持續到實驗結束前的最后4小時。最后，在t＝120時開始生長激素抑制劑和胰島素的注入并且持續2小時。注入25％的葡萄糖溶液以防止血漿中葡萄糖濃度出現任何的降低。圖c顯示了在胰腺-胰島素鉗夾實驗中葡萄糖的注入速率(GIR)。在提供HPB(■)的ICV注射和～基礎胰島素濃度時，GIR對于所有的組是可以忽略的。但是，在進行OA的ICV注射時(□)，在接受55和80 kcal/d的組中需要以～4.5和9mg/kg/min的速率注入外部葡萄糖以防止出現低血糖癥。在進行自由進食的組中(140)，在提供對照注射，低劑量(30nmol，□)和高劑量(300nmol， )OA注射時GIR小于2mg/kg/min。圖d顯示了在胰腺-胰島素鉗夾實驗期間的葡萄糖消失速率(Rd)。在任意的實驗組中Rd都沒有被ICV OA明顯影響。**P＝0.0001對于對照注射，*P＜0.03對于賦形劑注射。
圖8是實驗結果的圖表，其顯示了ICV OA對肝的胰島素活性的影響是受每日熱量攝取控制的，其是體重增加和每日熱量攝取的函數。圖a顯示了葡萄糖產生速率(GP)。在提供基礎的胰島素濃度時，與相應的對照(■)相比在55和80 kcal/d的組中OA的ICV施用(□)顯著的抑制了GP的速率。相比較而言，與對照和高OA的組相比ICV OA的低劑量(30nmol，□)和高劑量(300nmol， )都沒有顯著改變過量進食大鼠的GP。圖b顯示了在ICV OA和賦形劑處理過程中GP的改變。GP的改變被表述為從基值的抑制％。在胰腺-胰島素鉗夾實驗中與相應的對照(■)相比在接受ICV OA注射后(□)接受55-或80kcal/d的大鼠表現出GP的顯著降低。但是，在自由進食組中(140)，由30nmol(□)或300nmol( )的ICV OA所引起的GP改變與對照所導致的GP改變是相近的。**P＜0.001對于對照注射，*P＝0.05對于對照注射。圖c和d顯示了將由對照和OA引起的內源葡萄糖產生的變化百分比相對于ICV注射前的3天中體重和每日食物攝取的下降百分比繪制得到的圖形。圖c顯示，在提供ICV OA時，GP的抑制百分比與體重的下降百分比直接相關。圖d顯示，在提供ICV OA時，GP的抑制百分比與每日熱量攝取的下降百分比直接相關。
圖9是示意圖，照片和圖表顯示了ICV OA對肝的葡萄糖變化和葡萄糖-6-磷酸酶/PEPCK基因表達的作用。圖a是肝臟葡萄糖變化的示意圖。GP代表葡糖基單元對肝細胞葡萄糖-6-磷酸鹽(葡萄糖-6-P)池的凈貢獻，其中所述葡糖基單元來自葡糖異生(主要是通過磷酸烯醇丙酸鹽，PEP)和糖原骨架。但是，一部分葡萄糖借助葡糖激酶(GK)的磷酸化作用進入了肝臟同時也成為由葡萄糖-6-磷酸酶再次磷酸化的底物(G6Pase)。這個在葡糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶之間的耗能循環一般稱為葡萄糖消耗并且這也解釋了總葡萄糖產出(由葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化)和GP之間的差異的原因。圖b顯示了與對照(■)相比ICV OA(□)對于接受55或者140 kcal/d的大鼠的總葡萄糖產出(體內由葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化)的作用。在熱量受限時ICV OA明顯抑制了總葡萄糖產出但是對于過量進食的大鼠無效。圖c顯示了ICV OA對于接受55或者140 kcal/d的大鼠的總葡萄糖循環的作用。與對照(■)相比ICV OA(□)適當的并同樣的減少了熱量受限和過量進食的大鼠的葡萄糖循環。圖d顯示了在進行ICV OA(+)或者對照(-)輸注前已經以55或140kcal/d飼喂3天的動物體內葡糖異生酶葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK的northern分析的印跡照片。圖e顯示了通過密度計量學得到的葡萄糖-6-磷酸酶的northern印跡的量化分析。與ICV對照(■)相比在55kcal/d的動物中ICV OA(□)顯著的降低了肝內葡萄糖-6-磷酸酶的表達(以73％)但是不能顯著降低進食140kcal/d組的酶的表達。圖f顯示了通過密度計量學得到的PEPCK的northern印跡的量化分析。與ICV對照(■)相比ICV OA(□)不能顯著降低以55kcal/d或140kcal/d進食的動物中PEPCK的表達。對于對照*P＜0.05。
發明的詳細描述本發明部分的基于發現了哺乳動物的食物攝取和葡萄糖產生可以通過調控哺乳動物下丘腦的長鏈脂肪酰基-輔酶-A(LC-CoA)的水平來進行調節。參見實施例1和2。
因此，在一些實施方式中，本發明涉及減少哺乳動物中食物攝取和葡萄糖產生的方法。該方法包括增加哺乳動物下丘腦的LC-CoA的水平。
如這里所使用的，LC-CoA是輔酶A的飽和或不飽和C14-C22酯。在優選的實施方式中，這種LC-CoA是C16或C18并且是單不飽和的。
本領域的技術人員應該理解這些方法可以有效地處理例如肥胖，2型糖尿病和胰島素抗性等病癥。因此，CPT1對于弓狀核中NPY和刺豚鼠-相關蛋白(AgRP)水平的抑制效果證明這些方法可以有效地處理瘦素抗性以及胰島素和瘦素抗性的效果，例如控制LH排放，無月經和其它與促性腺激素缺乏有關的生殖功能紊亂，包括多囊卵巢綜合癥。
在這些方法的一些方面，這種LC-CoA通過減少下丘腦的一種LC-CoA-減少分子的活性而得到了增加。如這里所使用的，這種LC-CoA-減少分子是一種影響脂類代謝作用的分子，其可以抑制LC-CoA的產生或促進LC-CoA的代謝。所包括的是酶和載體蛋白，現在已知的或之后發現的，其促使脂類代謝作用偏離LC-CoA的產生，或者指向LC-CoA的代謝。所述酶包括，但是不限于，直接代謝LC-CoA的酶。在這些實施例中包括的非限定性的酶的例子是肉堿棕櫚酰基轉移酶1(CPT1)，丙二酰-輔酶A脫羧酶，肉堿酰基肉堿移位酶，酰基-輔酶A脫氫酶，2-烯酰基-輔酶A水合酶，3-羥酰-輔酶A脫氫酶，3-氧酰-輔酶A硫解酶，和酰基-輔酶A水解酶。
如這里所使用的，對分子“減少活性”是指可以減少與LC-CoA的生產或代謝有關的預先存在的分子的活力(例如，酶活性或與配體例如LC-CoA的結合)，或者減少這種分子的數量，或者它們的結合。應該可以理解這種分子的數量的減少可以通過提高這種分子的降解和除去速率和/或減少這種分子的生物合成來實現。相反的，“增加活性”的方法為增加這種與LC-CoA的生產或代謝有關的預先存在的分子的活力，或者增加這種分子的數量，或者它們的結合。這種分子的數量的增加可以通過減少這種分子的降解和除去速率和/或增加這種分子的生物合成和/或添加這種分子來實現。
還包括的LC-CoA-減少分子是小干擾RNAs(siRNAs)或者其它(例如，細胞因子和抑制劑)可以直接或間接抑制那些促進LC-CoA生產或形成的酶的分子。眾所周知，siRNAs，細胞因子，抑制劑和其它分子可以在調節酶或載體蛋白生產或活性方面具有強大的作用。
在一些優選的實施方式中，這種LC-CoA-減少分子是CPT1，考慮到這種酶是LC-CoA的β-氧化過程中的重要限速步驟。另外，已知這種CPT1在下丘腦和肝臟中的形式—肉堿棕櫚酰基轉移酶-1，肝臟同種型(CPT1L)與在肌肉中的CPT1(CPT1M)的形式不同，這使得可以使用CPT1L的抑制劑而對CPT1M并不起作用，因此限制了由這種方法所引起的副作用。發明人還已經證明了降低下丘腦CPT1L活性在本發明方法中的應用。參見，例如，實施例1和2。無論如何，對于靶目標CPT1L的效力強有力的證明了任意其它LC-CoA-減少分子的抑制作用同樣也可以預期在減少食物攝取和葡萄糖產生中的作用。
在更優選的實施方式中，這種CPT1是CPT1L，以及處理選擇性地或特異地減少那種變體而非CPT1M的活性，從而將對CPT1M的抑制作用這一副作用最小化。
在一些實施方式中，這種LC-CoA-減少分子的活性可以通過向哺乳動物大腦施用藥物組合物來降低。如這里所使用的，這種藥物組合物是一種組合物，其包括至少一種能降低LC-CoA-減少分子活性的小分子，以及藥物學可接受的賦形劑。如這里所使用的，“小分子”是小于大約2000MW的非低聚肽或低聚核苷酸的分子。低聚肽和低聚核苷酸分別是至少兩個肽或核苷酸的不分支的鏈。在這些實施方式中有用的小分子是任意LC-CoA-減少分子的抑制劑，包括ST1326和2-十四烷縮水甘油酸(TDGA)，CPT1的已知抑制劑。
在這些實施方式中，這種藥物組合物直接施用大腦以便小分子進入下丘腦(例如，供藥到在第三腦室(ICV)中)，或者通過組合物的施用，其中小分子可以通過血腦屏障。這里，這種小分子可以自己通過血腦屏障，和/或依靠這種藥物組合物所提供的至少一種賦形劑的幫助來通過血腦屏障。
在其它的實施方式中，可以通過向哺乳動物大腦(例如，ICV)施用抗體或包含抗體結合位點的抗體片段。在這些實施方式中，這種抗體或者抗體片段可以結合LC-CoA-減少分子來抑制這種分子的活性。這里，這種抗體或者抗體片段不限于任何特定的形式(例如，多克隆，單克隆，Fab片段，等)或者由任何特定的方法制備(例如，從動物或者動物的雜交瘤細胞刺激和收獲抗體，或者通過例如噬菌體或重組酵母或細菌的重組方法來進行生產)。
也可以通過向哺乳動物大腦中施用抑制作用的核酸或模擬體來降低這種LC-CoA-減少分子的活性。如這里所使用的，模擬體是人工化合物，就如現在已知的或隨后發現的，其表現近似于核酸具有和配對的核酸形成堿基對的能力。已知的模擬體的非限定性實施例包括肽核酸和硫代磷酸酯模擬體。
抑制作用的核酸或模擬體的例子包括核酶，反義化合物和siRNA，其可以結合目標mRNA(反義)或者直接內部代謝以降解這種mRNA(siRNA)，或者裂解mRNA(核酶)，防止翻譯成目標蛋白。另一種抑制性核酸或模擬體的例子是適配子(aptamer)，其以與抗體或小分子抑制劑相似的方式結合和抑制目標分子。
在一些優選的實施方式中，抑制作用的核酸或模擬體是核酶(參見實施例1，提供了一種大鼠CPT1L-特異核酶)。這里LC-CoA-減少分子是人CPT1L，在這些方法中所使用的核酶的一個例子包括序列5′-ACAGCACGCCGCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCACGUUCUUCGUC-3′(SEQ ID NO1)，其中粗體的序列是錘頭狀核酶的催化核心。
這種抑制作用的核酸優選施用到哺乳動物的大腦，最優選施用到第三腦室。可選擇的，可以施用編碼抑制作用的核酸的載體，其中這種載體編碼的抑制作用的核酸可操作的連接于控制元件例如啟動子，增強子或者終止子，以便這種抑制作用的核酸被合成并出現在下丘腦中。生產這種載體的方法是本領域所公知的。已知病毒載體(例如，慢病毒或腺病毒載體)特別適合用到這些實施方式中。
在這些方法的其它方面，可以通過提高下丘腦LC-CoA-增加分子的活性來增加LC-CoA。如這里所使用的，LC-CoA-增加分子是一種可以影響脂類代謝的分子，其具有提高LC-CoA產生或減少LC-CoA代謝的作用。包括酶或者載體蛋白，如已知的或隨后被發現的，其促使脂類代謝指向LC-CoA的合成，或者偏離LC-CoA的代謝。這種酶包括，但是不限于，直接產生LC-CoA的酶。在這些實施方式中非限定性的這種酶的實施例是乙酰-輔酶A羧化酶，脂肪酸轉運分子，酰基-輔酶A合成酶，肉堿棕櫚酰基轉移酶II，和酰基-輔酶A硫酯酶。
在這些方法的一些實施方式中，可以通過向哺乳動物大腦施用藥物組合物來增加這種LC-CoA-增加分子的活性，這種藥物組合物包括一種可以刺激LC-CoA-增加分子生產或提高其活性的小分子。
如在先前的實施方式中，這種藥物組合物可以直接施用到大腦以便這種小分子進入下丘腦(例如，供藥到第三腦室(ICV)中)，或者施用一種組合物，其中的小分子可以通過血腦屏障。
在這些方法中也可以通過與一種藥物可接受的賦形劑配合使用向哺乳動物施用這種分子從而使這種分子可以進入下丘腦從而提高這種LC-CoA-增加分子的活性。在優選的實施方式中，這種分子直接施用到哺乳動物大腦下丘腦的附近(例如，進入第三腦室)。
可以選擇的，在這些方法中可以通過與一種藥物可接受的載體一起將編碼這種分子的載體施用哺乳動物從而使這種載體可以進入下丘腦并且在那里進行這種分子的生產來提高LC-CoA-增加分子的活性。如前面的實施方式，編碼分子的載體的一部分優選可操作性的連接到控制元件上從而可以在下丘腦中直接從載體進行這種分子的生產。
在這些方法的另外方面，這種LC-CoA的增加可以通過直接向哺乳動物大腦施用LC-CoA來實現，優選第3腦室。
上述方法可以有效地減少任意哺乳動物的食物攝取和葡萄糖產生，包括嚙齒類和人類。
這些方法特別可以用于處理2型糖尿病和肥胖癥。推想其可以處理任何程度的肥胖癥。優選，這種哺乳動物超過標準體重至少5％。在另一個實施方式中，這種哺乳動物超過標準體重至少20％。如這里所使用的，人類標準體重被定義為BMI指數18.5-24.9Kg/米2(NHLBI，2000)。在這里BMI指數超過24.9Kg/米2被認為是肥胖的。
這些方法預期可以減少食物攝取至少5％，雖然減少食物攝取至少10％，20％，30％，或40％也同樣不是不可以預期的。
本發明另外涉及對那些處在食物攝取或葡萄糖產生不足狀態下的哺乳動物增加其食物攝取和葡萄糖產生的方法。該方法包括減少哺乳動物下丘腦長鏈脂肪酰基-輔酶A(LC-CoA)水平。
這些方法可以應用于任意需要使哺乳動物增加其食物攝取或葡萄糖產生的情形。這種情形的例子是當這種哺乳動物進行一種導致食物攝取和葡萄糖產生不足的處理時，例如癌癥化學療法，或者當這種哺乳動物被感染時，例如病毒感染(例如，HIV-1感染)，其導致食物攝取或葡萄糖產生的不足。這種方法對于血糖低的哺乳動物也是有效的。
在這些實施方式的一些方面，可以通過減少下丘腦中LC-CoA-增加分子(例如，乙酰-輔酶A羧化酶，脂肪酸轉運分子，酰基-輔酶A合成酶，肉堿棕櫚酰基轉移酶II，和酰基-輔酶A硫酯酶)活性來降低LC-CoA水平。如前面所討論的，這種分子活性可以被降低的方法的例子是(a)向哺乳動物大腦施用藥物組合物，其中這種藥物組合物包括可以抑制LC-CoA-減少分子活性的小分子；(b)向哺乳動物的大腦施用抗體或包含抗體結合位點的抗體片段，其中這種抗體或者抗體片段可以結合LC-CoA-增加分子從而抑制這種分子的活性；和/或(c)向哺乳動物施用抑制作用的核酸或模擬體(例如，核酶，反義化合物，適配子或者iRNA)。
在這些實施方式的其它方面，可以通過提高下丘腦中LC-CoA-減少分子(例如，肉堿棕櫚酰基轉移酶1(CPT1)，丙二酰-輔酶A脫羧酶，肉堿酰基肉堿移位酶，酰基-輔酶A脫氫酶，2-烯酰基-輔酶A水合酶，3-羥酰-輔酶A脫氫酶，3-氧酰-輔酶A硫解酶，和酰基-輔酶A水解酶)活性來減少LC-CoA的水平。如前面所討論，可以增加分子活性的方法的例子是(a)通過對哺乳動物施用一種藥物組合物，該藥物組合物包括一種可以增加LC-輔酶A-增加分子活性的小分子；(b)向下丘腦施用該分子，和(c)向下丘腦施用編碼該分子的載體。
這些方法可用于增加任意哺乳動物的食物攝入和葡萄糖產生，尤其是嚙齒類或者人類。在一些具體實施方式
中，這種哺乳動物至少低于正常體重10％或者20％。
這些方法期望可以提高哺乳動物食物攝入量至少5％，10％，20％，30％，或者40％。
發明者還成功的發現肝臟的自我調節可以通過下丘腦LC-CoA水平來進行調節。參見實例4。因而，在一些具體實施方式
，本發明涉及對肝自我調節不全的哺乳動物恢復肝臟自我調節功能的方法。該方法包括提高哺乳動物下丘腦LC-CoA水平。
如這里所使用的，“肝臟自我調節”描述了一種現象，在提供基礎胰島素水平時，通過脂類注射刺激葡糖異生來增加游離脂肪酸的循環水平但是由于肝臟肝糖分解的代償性降低使內生的葡萄糖產生并沒有改變。在糖尿病中，由于高血糖這種現象可以功能障礙(參見，例如，Hawkins等人，2002)。
在這些實施方式中，可以通過前面的實施方式所描述的方法來增加下丘腦的LC-CoA水平，例如，通過減少下丘腦LC-CoA-減少分子的活性，例如，這里LC-CoA-減少分子是CPT1，特別是CPT1L，例如通過向哺乳動物大腦施用一種藥物組合物，這種藥物組合物包含一種能夠減少LC-CoA-減少分子活性的小分子，通過向哺乳動物大腦施用抗體或包含抗體結合位點的抗體片段，其中這種抗體或者抗體片段可以結合到LC-CoA-減少分子從而抑制這種分子的活性；通過向哺乳動物的大腦施用抑制性核酸或者模擬體(例如，核酶)。在這些實施方式中也可以通過增加下丘腦LC-Co-A-減少分子的活性來增加LC-CoA水平，如上面所描述的，或者通過直接向大腦施用LC-CoA。同樣類似于前面的具體實施方式
，這些方法可以用于任意的哺乳動物，例如嚙齒類或人類，特別是患有糖尿病的哺乳動物。
另外，發明人發現下丘腦LC-CoA的增加通過刺激肝臟迷走神經傳出纖維引起食物攝取和葡萄糖產生的減少。參見實施例4。本領域的技術人員可以理解通過刺激肝臟迷走神經傳出纖維可以減少食物攝取和葡萄糖產生。
因此，本發明還涉及在哺乳動物中減少食物攝取和葡萄糖產生的方法。這種方法包括刺激哺乳動物中的肝臟迷走神經傳出纖維。在這些實施方式中，這種哺乳動物具有至少一種選自以下的病癥肥胖，2型糖尿病，瘦素抗性，胰島素抗性，促性腺激素缺乏癥，無月經，和多囊卵巢綜合癥。
在本領域中迷走神經也被稱為副交感神經系統以及其分支，和膽堿能神經。肝臟迷走神經傳出纖維可以利用本領域所公知的任何方法進行刺激。非限定性實施例包括機械方法例如針刺，超聲波，或振動；任何電磁放射例如紅外，可見或紫外光；加熱，或任何其它能量源。在優選的實施方式中，迷走神經是進行電刺激的，使用例如一種商業的迷走神經刺激器比如Cyberonics NCP，或者電探針。對傳出的迷走神經進行刺激可以通過刺激整個的迷走神經(也就是，傳入的以及傳出的神經)，或者直接單獨的刺激傳出的迷走神經。下面的方法的實施需要在兩種神經都存在的地方把傳入的迷走神經從傳出的迷走神經中分離出來。可選擇的，肝臟傳出神經纖維在沒有傳入神經纖維的地方進行刺激，例如在接近肝臟的地方。這種傳出神經纖維的刺激也可以通過直接刺激肝臟來實現，例如，利用電，從而實現對為肝臟服務的傳出神經纖維的刺激。這種迷走神經也可以被切斷從而對末梢進行刺激，因此僅僅刺激傳出神經纖維。
抑制食物攝取和葡萄糖產生的這種刺激的數量對于本領域技術人員無需復雜的試驗就可以確定。一種被認為是迷走神經刺激方法的電刺激的例子是1至5V的恒壓刺激，在2ms和1Hz，持續10分鐘。
在相關的實施方式中，本發明涉及在肝臟自我調節功能不全的哺乳動物中進行肝臟自我調節功能的恢復。方法包括刺激迷走神經傳出纖維。這些刺激肝臟迷走神經傳出纖維的方法就像上面剛剛介紹的有關減少食物攝取和葡萄糖產生的實施方式一樣。
在下面的實施例中對本發明的優選實施方式進行描述。對于本領域的一名技術人員在考慮到本發明說明書或這里所描述的本發明實踐后很明顯的可以得到這里權利要求范圍所包括的其它實施方式。這意味著說明書，以及這些實施例，僅僅應該被看作是示例性的，在下面的實施例后面的權利要求顯示了本發明的范圍和精神。
實施例1.抑制下丘腦肉堿棕櫚酰基轉移酶-1以減少食物攝取和葡萄糖產生實施例概要肉堿棕櫚酰基轉移酶-1這種酶控制長鏈脂肪酸進入線粒體，這些長鏈脂肪酸將在線粒體中進行β-氧化。為了檢驗脂類中心代謝可以調控能量平衡的新的機理，我們目的在于選擇性的降低下丘腦的脂類氧化。為了這個目的，通過向第三腦室施用包含核酶的設計用來特異性降低肉堿棕櫚酰基轉移酶-1表達的質粒或者向第三腦室注射這種酶活性的藥理學抑制劑來減少這種肉堿棕櫚酰基轉移酶-1的活性。對下丘腦肉堿棕櫚酰基轉移酶-1活性的基因學和生化學的抑制方法都可以充分的顯著減少食物攝取和內部的葡萄糖產生。這些結果顯示在所選擇的下丘腦神經元改變脂類氧化速率將向下丘腦發送營養可用的信號，其反過來調整循環中內源和外源的營養輸入。
引言該實施例通過檢驗下丘腦脂類氧化的作用描述了涉及負責脂類依賴信號的機制的試驗結果。這種酶，肉堿棕櫚酰基轉移酶-1(CPT1)，調控長鏈脂肪酸進入線粒體，它們將在線粒體進行β-氧化(McGarry等人，1977；Zammit，1994)。兩個觀察結果驅使我們注意下丘腦CPT1的可能作用a)脂肪酸合酶(FAS)抑制劑對于食物攝取的抑制效果要求丙二酰-CoA-CPT-1活性的有效抑制劑的水平增加(Loftus等人，2000)(圖1a)；以及b)運送到第三腦室的長鏈脂肪酸(LCFA)油酸對于食物攝取和GP的抑制效果并沒有被與之等摩爾的施用量的辛酸(一種短鏈脂肪酸，無需CPT1就可以進入線粒體)所重復(Obici等人，2002a)。基于這些早前的發現我們推測在神經元中LC-CoA水平的增加是一個下丘腦的有關營養存在的信號。可以通過LCFAs(例如油酸)的ICV施用(Id.)或者通過增加丙二酰-CoA的水平來抑制LC-CoA進入線粒體(Loftus等人，2000)來實現這種LC-CoA水平的增加。為了驗證這個假設我們需要知道是否下丘腦的CPT-1活性的顯著降低足以抑制進食行為和GP。
結果CPT1抑制的分子學和藥理學方法。為了抑制Lc-CoAs進入線粒體，我們繼續進行藥理學和分子學的研究。我們首先通過northern印跡分析證明了下丘腦CPT1的普遍形式是肝臟的同種型(CPT1L)而不是肌肉的同種型(CPT1M)(圖1b)。因此我們設計了一種特異性裂解CPT1L mRNA的核酶(CPT1L-Ribo；圖1c)并且將其引入到一種哺乳動物表達載體中(圖1d)。然后我們在穩定的轉染AtT20細胞中檢測這種構建體減少CPT1L表達的能力(圖1e和1f)。我們還證明系統輸注CPT1抑制劑可以顯著增加肝臟和骨骼肌中LC-CoAs的濃度(圖1g)。因此，我們確定了CPT1L-Ribo減少哺乳動物細胞CPT1表達的作用并且提供了證據證明從本質上抑制CPT1活性足以增加LC-CoAs的組織濃度。
基于這些結果，CPT1活性的兩個特異抑制劑，ST1326和2-十四烷縮水甘油酸(TDGA)，或者CPT1L-Ribo被ICV輸注到有知覺的大鼠中以在其下丘腦減少CPT1活性和增加LC-CoAs。與適當的對照相比(表1)在每個實驗組中大鼠的基礎anthropometrical和生化學特性都是相似的。很顯然，在培養3天后與配對培養的對照組相比利用CPT1L-Ribo進行ICV處理的大鼠出現了低禁食血漿胰島素和瘦素水平的趨勢(表1)。
表1
通過在試驗過程中測試至少4組血漿樣品得到鉗夾實驗中代表穩定水平的數值。在這個實驗中，載體組的食物攝取和CPT1L-Ribo組是相當的。在急性ICV輸注測試樣品前進行在剩下其它實驗組的食物攝取的測定。
通過立體定向外科手術將ICV導管植入雄性Sprague-Dawley大鼠中(Obici等人，2002a；Obici等人，2001；Liu等人，1998)。從手術完全恢復后3周(圖2a)，進行生物學或分子分析，代謝或飼喂試驗。在試驗前3天進行CPT1L-Ribo的ICV運送(圖2a)。將CPT1抑制劑或賦形劑(CON)通過快速的注射或緩慢的6小時的ICV輸注運送到插入導管的Sprague Dawley大鼠中(Obici等人，2002a；Obici等人，2001)(圖2a)。我們首先測試CPT1L-Ribo對于通過微穿孔技術選擇的下丘腦核樣品中CPT1L(圖2b)和CPT1M(圖2c)mRNA水平的影響。利用定量的實時PCR(調整為β-肌動蛋白的拷貝數)我們證明了在弓狀核(ARC)中CPT1L mRNA顯著降低，但是并沒有出現在下丘腦的更多的側區，例如室旁核(PVN)或者下丘腦側核(LHA)。相反的，CPT1M mRNA表現出更低的水平特別是在ARC中并且CPT1L-Ribo對其表達沒有任何改變。如果這種CPT1L mRNA的顯著降低具有重要的生物學作用，它也應該導致ARC中CPT1活性的降低。因此，接下來我們測試了在ARC中和在整個下丘腦的CPT1活性。ICV施用CPT1L-Ribo后在ARC中而不是整個下丘腦發現了CPT1活性的顯著降低(圖2e)，與從CPT1L mRNA觀察到的選擇性效果是相同的(圖2b)。我們也驗證了不可逆的CPT1抑制劑TDGA對于ARC(圖2d)和整個下丘腦(圖2e)中CPT1活性的影響。最后，我們目的在于驗證這種假設即CPT1活性抑制劑的ICV施用可以增加ARC中的LC-CoAs。為了這個目的我們使用了可逆的CPT1L抑制劑ST1326并以其無活性立體異構體ST1340作為對照。ST1326的ICV施用導致了ARC中硬脂酰-CoA(圖2f)和油酰-CoA(圖2g)水平的顯著增加但是在PVN和LHA中沒有出現。通過ST1326的ICV施用其它的LA-CoAs(沒有顯示)也明顯增加了。因此，ICV運送CPT1的分子學的和藥物學的抑制劑有效地降低了ARC中的CPT1活性并且CPT1L活性的抑制顯著的增加了特定的LC-CoAs的濃度。基于以上這些發現，設計了兩套試驗來檢測下丘腦中CPT1活性的抑制作用對于進食行為和胰島素作用的效果。
對下丘腦CPT1的抑制減少了食物攝取。首先我們試驗是否中樞施用CPT1的分子學或藥物學上的抑制劑可以調控有知覺大鼠的進食行為(圖3)。為了這個目的，在暗循環開始前3小時對成對的大鼠組通過內置的ICV導管接受對照載體或CPT1L-Ribo，或者ST1340-ST1326的一種無活性立體異構體，或者CPT1L抑制劑(ST1326)的團注。在代謝籠中監控ICV注射前直到注射后72小時大鼠的食物攝取情況(Obici等人，2002a)。通過CPT1L-Ribo的ICV注射產生的ARC中CPT1L表達和活性的這種選擇性的降低(圖2b和2d)迅速導致了厭食的開始(圖3a-c)在ICV施用開始后的第一個晚上(平均食物攝取13.0±1.9對23.0±3.2gr./天；p＜0.01)。當與對照載體或者不相關的核酶進行比較時發現CPT1L-Ribo的ICV施用對于食物攝取的顯著作用是非常明顯的(圖3c)。相似的，一種CPT1L的有效的和特異的抑制劑(ST1326)的快速ICV注射顯著的抑制了大鼠的食物攝取而無活性的立體異構體(ST1340)則不能改變進食行為(圖3d，e)。這種由中樞CPT1抑制作用引起的厭食行為在單一的ICV施用后持續了至少48小時。這些食物攝取的降低與基值和賦形劑/載體相比是非常明顯的(圖3a-e)。這種由CPT1抑制作用引起的從基值的改變在分別中樞ICV注射CP1L-Ribo和高劑量ST1326后的24小時(-17.6±2.0g和-12.4±3.9g)和48小時(-13.4±1.8g和-7.8±3.8g)進行統計分析(圖3b和e)。其顯示每日食物攝取減少了～50％，經過72小時返回到基值。
為了開始研究ARC中CPT1抑制的厭食特性的相關機制，我們接下來分析了CPT1L-Ribo對于主要ARC肽基因表達的影響。經過實時PCR的定量分析顯示與對照-Ribo相比經過ICV CPT1L-Ribo處理的大鼠的ARC中AgRP和NPY mRNA顯著降低(圖3f)。相反的，ARC中POMC的表達沒有被CPT1L-Ribo的施用所顯著影響(圖3f)。總的來說，這些厭食行為支持了這樣一個觀點即在神經元中LC-CoAs水平的改變通過它們對離散的下丘腦中心的作用可以直接控制食物攝取。此外，在選擇的下丘腦神經元中LC-CoAs水平的增加可能可以說明油酸和FAS抑制劑對食物攝取的有效作用(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；Makimura等人，2001；Shimokawa等人，2002)。
對下丘腦CPT1的抑制減少了葡萄糖產生。試驗也被設計成檢測CPT-1的中樞抑制作用對于整體胰島素作用的影響(圖4a，b)。胰島素作用是通過ICV輸注和系統的胰腺-胰島素鉗夾試驗結合來進行測定的(圖4b)。在這些實驗中，比較接受了ICV載體和ICV PT1L-Ribo的大鼠的每日食物攝取(表1)。所有的大鼠都在ICV注射最后4小時接受了主動脈[3-3H]-葡萄糖的注射(Obici等人，2002a；Obici等人，2001)和在每項研究的最后2小時進行胰腺/胰島素鉗夾(胰島素1mU/kg.min；生長激素抑制素3μg/kg/min)試驗。如所期望的在提供～基礎循環胰島素水平(鉗夾步驟；表1)時，需要保持正常血糖的葡萄糖的注射速率(GIR)在ICV對比試驗的邊緣(marginal)(載體-ST1340-或者賦形劑-注射的動物；～0.8mg/kg/min)。通過對比，經過CPT-1表達和活性的抑制劑的ICV注射后以～5mg/kg/min的速率進行葡萄糖的注射以防止出現低血糖癥。因此，在提供確定的和基礎的胰島素濃度時CPT-1的中樞抑制作用刺激胰島素維持葡萄糖平衡的作用。
我們接下來測試潛在的有關ICV施用CPT-1拮抗劑可以提高整體胰島素作用的機理。我們采用痕量稀釋方法學測定葡萄糖動力學(Obici等人，2002a；Obici等人，2001)從而確定由CPT1的中樞拮抗劑引起的GIR的增加是否是由于葡萄糖攝取的刺激或內部葡萄糖產生(GP)的抑制。葡萄糖的吸收速率沒有被ICV處理所顯著的影響(圖4c，e，g)。相反的，在提供基礎的和相等的胰島素水平時(～20μU/ml)，通過ICV注射CPT1L-Ribo(以30±3％；n＝5)，ST1326(以44±7％；n＝8)，和TDGA(以47±6％；n＝7)GP被顯著的和明顯的降低(圖4d，f，人)。這些葡萄糖輸出的降低完全說明了CPT-1的中樞抑制作用對整體葡萄糖代謝的影響。
討論在這些結果的基礎上，我們總結得出對CPT1活性的中樞抑制足以顯著的抑制食物攝取和內源葡萄糖產生。此外，我們認為CPT1活性的中樞抑制導致在選擇的下丘腦神經元中LC-CoA水平的增加。這種增加代表一個重要的信號“營養充足”，其反過來激活一系列的神經傳導用來促進從碳水化合物到脂類的能量源轉換從而限制進一步的外在的和內生的營養進入循環中。
再與中樞運送長鏈脂肪酸油酸和FAS抑制劑的有效作用結合在一起(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；Makimura等人，2001；Shimokawa等人，2002)，目前的發現證明這樣一個觀點即在下丘腦神經元中細胞內LC-CoAs水平的增加是可用營養增加的一個重要傳感器(圖1a)。其反過來刺激涉及調整能量動態平衡和肝臟內胰島素作用的中樞神經元途徑。既然肝臟的葡萄糖產生是內源能量的主要來源，中樞神經元回路伴隨著調控外源的和內源的能量來源(Obici等人，2002a；Obici等人，2001)。這與設計用于控制和調整循環中營養的輸入以應付它們可利用度的改變的負反饋系統是一致的。
既然循環的游離脂肪酸可以迅速接近中樞神經系統(Miller等人，1987；Goto和Spitzer，1971)，下丘腦中脂肪酸氧化的改變可以通過神經元中LC-CoA水平的改變來控制能量平衡和胰島素作用的調節。在生理學條件下，當神經元中丙二酰-CoA水平提高時可以出現對下丘腦CPT1活性的抑制。細胞內丙二酰-CoA水平的提高一般是由碳水化合物代謝的增加引起的。因此，當存在LCFA并同時出現碳水化合物的增加時(丙二酰-CoA的增加)這種假設的“中樞脂類信號”就將被產生。由于下丘腦中CPT1活性的抑制本身再現了ICV施用LCFA油酸(Obici等人，2002a)對于食物攝取和葡萄糖產生的作用，所以可能LC-CoAs的積聚而不是進入線粒體是下丘腦脂類傳感的主要組分。這也與觀察到的短鏈脂肪酸辛酸(Id.)存在的顯著增加不能再現油酸對于葡萄糖產生(Id.)的有效作用這一結論相一致。應該指出，盡管丙二酰-CoA可能在下丘腦CPT1活性的生理學調整中發揮重要作用，但是當存在對CPT1活性有遺傳性或藥物學抑制作用的情況下這里不可能出現丙二酰-CoA水平的增加。實際上，CPT1活性的抑制導致LC-CoAs水平的增加，其通過ACC抑制反過來導致丙二酰-CoA水平的減少(Lunzer等人，1977)。
最后，大麻素的有效增食(食欲刺激)效果和CB1受體(Blazquez等人，1999)拮抗性的有效厭食效果可能也可以部分的通過調控下丘腦CPT-1活性和LC-CoA水平來進行調節。實際上，內部的大麻素可以不依靠丙二酰-CoA單獨刺激培養的星形膠質細胞中的CPT1活性和脂肪酸氧化并通過和CB1受體相互作用來發揮作用(Di Marzo等人，2001)。因此脂肪酸氧化的中樞抑制作用可能代表一種新的對肥胖和2型糖尿病的預防和治療方法。
方法CPT1L核酶的設計和克隆。兩個互補的51-堿基長的寡聚核苷酸(ODN)，5′-CTGTACCAAAGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGCCGCTCACAATGA-3′(SEQ ID NO2)，和5′-CATTGTGAGCGGCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCTCTTTGGTACAGA-3′(SEQ ID NO3)被合成(Operon Technologies，Inc.，Alameda，CA)，其中包含錘頭狀核酶序列的催化核心(如上面粗體字母所示，也可以參見圖1c)，側接來自肝臟的肉堿棕櫚酰基轉移酶1的同種型(CPT1L)的13-核苷酸長度的序列(Esser等人，1993；Birikh等人，1997)。兩條ODNs通過退火得到雙鏈片段并將其插入到哺乳動物表達載體中(來自Stratagene的pTargeT)。這種CPT1L-Ribo盒包括細胞巨化病毒(CMV)增強子/啟動子，CPT1L-Ribo上游的內含子元件，以及下游的猿病毒40晚期多聚腺苷酸化位點(圖1d)。得到的CPT1L-Ribo構建體可以指導這種對CPT1L mRNA特異的錘頭狀催化RNA的轉錄(圖1e)。對照實驗如所示使用pTarget載體自身，或者核酶對照質粒(RiboC)，其中CPT-特異序列被隨機序列5′-GGAGCCTCGAGATCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGTGAGCGTTTGG-3′(SEQID NO4)代替。
CPT1L-核酶的表達。如前面所述的將CPT1L-Ribo質粒或者載體自身轉染到如前述含有polyethilenimine(PEI-Sigma-Aldrich，MW25,000)的AtT20細胞中(Boussif等人，1995)。對含有～200個獨立克隆的池進行Northern分析。對于體內表達，將CPT1L-Ribo質粒與PEI復合并如前面所述的進行ICV注射(Goula等人，1998)。簡要的，將5μl含有5μg質粒的D5W(5％葡萄糖溶液)與5μl含有18mMPEI的D5W進行混合。在室溫下孵育10分鐘后，將這10μl混合物以1μl/min的速率進行ICV輸注。
大腦立體定向微穿孔。如前面所述的制備大腦微穿孔個體的下丘腦核(Palkovits，1973；Obici等人，2002b)。
通過Northern和實時PCR進行CPT1和神經肽的定量。特異探針利用大鼠下丘腦RNA作為模板通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增針對肝臟和肌肉同種型的(分別是CPT1L和M)CPT1并克隆到pTarget中。CPT1L探針跨越CPT1L cDNA位置10到765的755個核苷酸(GeneBamk登錄號L07736)；CPT1M探針跨越CPT1M cDNA位置688到1233的545個核苷酸(GeneBank登錄號NM_013200)。
總核酸是利用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，California)從個體的下丘腦核(例如，弓狀核，PVN等)中分離出來的。單鏈cDNA合成和實時PCR反應如前面所述的方法進行(Obici等人，2002b)。CPT1L和CPT1M mRNA特異探針包含下面的序列CPT1前引物(F)5′-CTCCGAGCTCAGTGAGGACCTAAAG-3′(SEQ ID NO5)和反向引物(R)5′-CAAATACCACTGCAATTTGTG-3′(SEQ ID NO6)；CPT1M F5′-CCAGACTGCAGAAATACCTGGTGCTC-3′(SEQ ID NO7)和R5′-GTTCTGACGTGCTTCTGCCCACTCTAC-3′(SEQ ID NO8)。下丘腦神經肽表達是通過使用下面的引物進行實時PCR技術得到的NPY-F5′-GCCATGATGCTAGGTAACAAACG-3′(SEQ ID NO9)，R5′-GTTTCATTTCCCATCACCACATG-3′(SEQ ID NO10)，POMC-F5′-CCAGGCAACGGAGATGAAC-3′(SEQ ID NO11)，R5′-TCACTGGCCCTTCTTGTGC-3′(SEQ ID NO12)，AgRP-F5′-GCCATGCTGACTGCAATGTT-3′(SEQ ID NO13)，R5′-TGGCTAGGTGCGACTACAGA-3′(SEQ ID NO14)，和β-肌動蛋白-F5′-TGAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′(SEQ ID NO15)，R5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3′(SEQ ID NO16)。轉錄水平被表述成每個基因利用β-肌動蛋白的拷貝數進行標準化后得到的拷貝數。每個轉錄的拷貝數針對一條標準曲線進行評價，標準曲線是通過對與進行連續稀釋的含有目標模板序列的質粒結合的每個引物對進行PCR反應得到的。
體內試驗的動物準備。我們研究了93個10-周齡雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Wilmington，MA)。這些大鼠在單獨的籠子中和正常的晝-夜循環下進行飼養。在進行體內試驗前3周，我們通過立體定向外科手術在第三腦室插入一根長期的導管(Obici等人，2002a；Obici等人，2001；Liu等人，1998)。在胰腺-胰島素鉗夾步驟前一星期，我們再在右側頸靜脈和左側頸動脈中插入另外的導管(Obici等人，2001；Liu等人，1998)。所有的ICV溶液都溶解到人造腦脊髓液中(aCSF)。監控每天的食物攝取。
CPT1的中樞抑制和食物攝取的效果。我們試驗了ICV CPT1L-Ribo和ST1326對于食物攝取的效果。在暗循環開始前3小時，將CPT1L-Ribo或載體對照，ST1326或ST1340通過內置的導管團注到第三腦室。在飼喂試驗中，大鼠接受25 pmoles ST1340的單一團注或者兩種不同劑量(5和25 pmoles)ST1326的團注。在進行ICV注射前至少經過3天以保證大鼠已經適應代謝籠的生活并且它們的食物攝取已經保持穩定。在接下來的72小時連續監控其食物攝取。
體內葡萄糖動力學和胰腺-胰島素鉗夾步驟的測定。這種輸注研究持續總共360min(圖3a)。簡要的，在t＝0min時開始CPT1抑制劑或者對照溶液的致敏-連續ICV輸注并在剩余的時間內保持這一狀態。2-十四烷縮水甘油酸(TDGA，獲贈于Dr.Manuel Guzman)溶解到DSMO中，稀釋到aCSF(Harvard Apparatus)中并以50 pmoles/hr每小時的速率進行ICV輸注。將ST1326[(R)-N-(十四烷氨基甲酰基)-氨基肉堿]和ST1340(ST1326的非活性立體異構體)[(S)-N-(十四烷氨基甲酰基)-氨基肉堿]溶解到aCSF中并以50pmoles/hr每小時的速率進行輸注。在進行胰腺-胰島素鉗夾試驗前，將鉗夾步驟前3天接受CPT1L-Ribo或載體對照ICV注射的大鼠隨機的分成兩個對照進食試驗組。在t＝120min時開始致敏-連續注射HPLC-純化的[3-3H]葡萄糖(New England Nuclear，Boston，MA；40μCi bolus，0.4μCi/min)并在實驗中持續進行(Obici等人，2002a；Obici等人，2001；Liu等人，1998)。最后，在t＝240時開始胰腺-胰島素鉗夾試驗(Obici等人，2002a；Obici等人，2001；Liu等人，1998)并持續2小時。這一步驟包括生長激素抑制素的輸注(3μg/kg/min)，胰島素的輸注(1mU/kg/min)，以及為了防止血糖過低而必需的葡萄糖的輸注，或者C肽(Linco)和2型黑皮質素受體(Chemicon)的抗體的輸注。胰島素的輸注速率要求替換吸收后大鼠中的正常基礎水平。
在所有的鉗夾步驟的最后60min得到穩定的血糖和胰島素的濃度和葡萄糖特異活性的穩定狀態。在蒸發干燥除去氚水(Somogyipellet)后通過測量Ba(OH)2和ZnSO4沉淀的上清液得到[3H]葡萄糖的放射活性。在血漿中氚水(Somogyi pellet)的特異活性通過測量蒸發干燥前后無蛋白上清液的總量得到。在血糖濃度的恒定狀態下，葡萄糖的消失速率(Rd)等同于葡萄糖的產生速率(Ra)。在恒定狀態下Ra是由[3H]葡萄糖注射速率(每分鐘分解量)和血[3H]葡萄糖特異活性(每分鐘每mmol葡萄糖分解量)決定的。在基礎狀態下葡萄糖的生產速率(GP)等于Ra而在胰腺的鉗夾步驟中葡萄糖產生速率得自于Ra和葡萄糖注射速率的差值。
所有的數值以平均值±SE的形式給出。不同組之間的對比是利用適當的方差檢驗或不配對資料t檢驗進行分析的。試驗方案是得到動物關懷機構以及Albert Einstein藥學院使用委員會的視察和認可的。
實施例2.調控下丘腦長鏈CoA(LC-CoAs)水平以調控食物攝取和葡萄糖產生該實施例描述的試驗使用了實施例1中所述的方法。
飲食-引起的肥胖導致下丘腦中的LC-CoAs顯著降低。為了測試下丘腦“脂類信號”的下降是否可以對飲食引起的肥胖發揮作用，我們測試了經過3天高營養食物飼喂的大鼠弓狀核(ARC)中的LC-CoAs水平(Obici等人，2002a)。由于它不是基于單一的基因缺陷所以后者是研究人類肥胖和飲食-引起的胰島素抗性的很好的模型。盡管接受了富含飽和脂肪酸的飲食，與正常飲食的大鼠或與正常飲食大鼠成對飼喂的高脂肪攝取大鼠相比過量飼喂的大鼠的ARC LC-CoAs水平下降了60％。這些驚奇的結果說明當動物體內缺乏一種循環營養和下丘腦能量中心之間的負反饋時傾向于增加體重。
下丘腦CPT-1的抑制顯著改善了具有飲食引起的肥胖和胰島素抗性的大鼠肝臟的胰島素活性。這里，我們假定下丘腦CPT-1的抑制可以降低過量進食大鼠中的葡萄糖產生(GP)。因此，我們試驗了是否下丘腦LC氧化的降低可以強烈的抑制進食高脂肪食物(33％的熱量來源于脂肪)的大鼠中的GP。為了抑制LC進入線粒體，我們向有知覺的大鼠ICV注射一種CPT-1活性的選擇抑制劑(CPTI)或者它的非活性立體異構體(CON)。CPTI或CON被快速的持續6小時的ICV注射到帶有長期導管的大鼠中。當提供基礎胰島素水平時，在CPTI(4.2±0.4mg/kg/min)組中需要進行葡萄糖注射以防止出現低血糖癥，但是在CON((0.5±0.2mg/kg/min)組中不必。GP被CPTI顯著的和明顯的降低了(-37±5％，p＜0.01；n＝4)但是CON沒有相同作用(+3±7％；n＝5)。我們推測過量進食大鼠中對LC中樞施用的代謝應答的缺乏是由于神經元CPT-1活性的增加。
CPT1活性的中樞抑制作用應該是由飲食引起的胰島素抗性的一個有效的處理手段。總而言之，上面提供的數據證明了這樣的觀點即任何增加ARC中LC-CoAs濃度的藥理學方法都是一種預防和處理肥胖和2型糖尿病的有效的和新穎的方法。除了CPT-1活性或表達的選擇性抑制劑外，也可以使用其它可以降低LC-CoA代謝的酶。例如，ARC LC-CoA水解酶或硫酯酶的抑制也可以增加LC-CoAs以及預期可以降低GP和食物攝取。相同地，增加下丘腦的丙二酰-CoA水平通過抑制丙二酰-CoA脫羧酶或者通過刺激乙酰-CoA羧化酶也可以抑制食物攝取和葡萄糖輸出。最后，增加神經元中脂肪酸轉運蛋白或LC-CoA合成酶活性也可以增加下丘腦的LC-CoAs水平因此可以抑制葡萄糖產生和食物攝取。
總而言之，該實施例證明了下丘腦LC-CoAs水平的增加可以降低食物攝取和葡萄糖產生。
實施例3.下丘腦對于長鏈脂肪酸的響應是營養控制的。
實施例概要長鏈脂肪酸油酸的中樞施用抑制了大鼠的食物攝取和葡萄糖產生。這里我們測試營養可利用度的短期改變是否可以控制油酸的這些代謝和行為效果。大鼠被分成三組接受一種高營養的能量密集食物并逐漸增加每日熱量水平(分別為飼喂標準食物的平均以下，相同水平或在其之上)。在進行指定食物攝取三天后，檢測大鼠對于第三腦室中輸注油酸的急性生物學反應。三天的過量喂食實際上消除了由中樞的油酸施用引起的代謝和食欲不振效果。此外，在短期的過量飲食后向第三腦室中輸注油酸沒能減少下丘腦神經肽Y和肝臟中葡萄糖-6-磷酸酶的表達。短期過量飲食后下丘腦對油酸反應的缺乏可能歸功于這種動物模型中體重增加和肝臟胰島素抗性的迅速開始。
引言肥胖和2型糖尿病(DM2)共同具有一些代謝特點，其中包括胰島素抗性(Kahn and Flier，2000；Kopelman和Hitman，1998；Porteet al，1998)。肥胖和DM2在發達國家和發展中國家中的影響范圍顯著提高了。例如，最近十年僅僅在美國在兒童和成人中肥胖的程度就出現顯著的增加(Flegal等人，2002；Ogden等人，2002)。對高熱量飲食的消費和久坐的生活方式在這種趨勢中扮演了重要的作用(Kopelman和Hitmanl Flegal等人，2002；Friedman，2000)。相似地，暴露于具有高熱量密度(高脂肪)的美味食品引起了小鼠(West等人，1992；West等人，1995)，大鼠((Kraegen等人，1991；Schemmel等人，1970；Sclafani和Springer，1976)，豬(Romsos等人，1978)，狗(Hall等人，1995)，和猴子(Ausman等人，1981)中體重和胰島素抗性的變化。
進化壓力可能有利于基因的選擇，其在存在的食物很多時將能量儲存最大化(Coleman，1978；Coleman，1979；Neel，1999；Wang等人2001)。其它人和我們已經提出的即熱量攝取的快速增長開始了外周“合成代謝信號”(Kersten，2001)和下丘腦“分解代謝信號”(Woods等人，1998；Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；2002d；2002e；2002f；2003)之間的一個“戰爭拉鋸”。下丘腦中激素的影響，例如瘦素(Zhang等人，1994；Schwartz等人，1996a；1996b；Frederich等人，1995；Cinti等人，1997)和胰島素(Obici等人，2002e；2002f；Woods等人，1979；Brief和Davis，1984)，和營養，例如脂肪酸(Loftus等人，2002；Obici等人，2002a；Obici等人，2003)，啟動了一個負反饋，這包括食物攝取的抑制，能量支出的刺激，和來自內部能量源(主要來自肝臟)的營養輸出的降低。當這種負反饋中斷時動物和人類可能更易于增加體重和改變代謝調控。在過量飲食的嚙齒動物模型中瘦素抗性的迅速出現為這種理論提供了最初的支持(Halaas等人，1997；Widdowson等人，1997)。
這里，我們測試這種假設即熱量攝取的短期增長快速引發對長鏈脂肪酸，油酸(OA)中樞作用的抗性。因此，我們檢驗營養狀況的改變是否會導致油酸對進食行為和葡萄糖產生中樞作用的改變。
簡寫ICV，進入第三腦室；OA，油酸；NPY，神經肽Y；DM2，2型糖尿病；PEPCK，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；Glc-6-pase，葡萄糖-6-磷酸酶；HPB，羥丙基-β-環糊精；SC，標準飲食；HF，高脂肪飲食；LCFA，長鏈脂肪酸實驗步驟動物和試驗設計。將10周齡的雄性Sprague-Dawley(S-D)大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Inc.，Wilmington，MA)在獨立的籠子中進行飼養并暴露于標準的晝-夜循環(0600-1800/1800-0600)。在體內實驗前的第14天，如前面所述在所有的大鼠中通過立體定向外科手術植入ICV導管(36)。在所有的體內試驗開始前大鼠必須經過充足的恢復。分別對動物飼喂標準的飲食(SC，貓，編號5001，Purina Mills Ltd，其中碳水化合物提供59％的熱量，蛋白提供28％的熱量和脂肪提供12％的熱量，3.3kcal/g)，高蔗糖的飲食(HS；動物除標準飲食外可自由接觸20％蔗糖溶液)，或一種美味的高脂肪飲食(HF，貓，編號9389；Purina Mills Ltd.，其中碳水化合物提供45％的熱量，蛋白提供22％的熱量和脂肪提供33％的熱量，5.32kcal/g)其是通過向標準飲食中補充10％的豬油來實現的。這種豬油含有2％的肉豆蔻酸，24％的棕櫚酸，13％的硬脂酸，46％的油酸，和12％的亞油酸。HF飲食中脂肪的總組成是按照重量5.2％的飽和的，6.2％的單不飽和的，和2.7％的多不飽和的脂肪。SC飲食分別含有重量比為1％，1.5％，和1.6％的飽和的，單不飽和的，和多不飽和的脂肪。在進行下面所述食物攝取(表2)3天后的飲食和代謝實驗(下面所述)中包括五組的動物1)SC自由進食(SC，～80kcal/天)；2)HS自由進食(HS；～95kcal/天)；3)HP自由進食(HF140；～140kcal/天)；4)HF熱量限制(HF55；～55kcal/天)；和5)HF配合-喂食SC(HF80；～80kcal/天)。
OA的中樞運輸。OA與羥丙基-β-環糊精聚合物進行復合(HPB，CTDInc)。后者顯示出為脂肪酸的中樞運輸提供了很好的賦形劑(Obici等人，2002a；Yaksh等人，1991；Pitha等人，1994)。OA溶解到45％的HPB中形成17mM的終濃度。將這種HPB-OA溶液在人造腦脊髓液(aCSF)中稀釋到適當的濃度用于進行每一次ICV注射(30或300nmol/5μl)。在所有的賦形劑對照實驗中使單獨的HPB濃度與在OA實驗中保持一致。
進食行為試驗。這個試驗步驟用來檢驗ICV OA對喂食標準飲食(SC)，高蔗糖飲食(HS95)和高脂肪飲食(HF140)的三個試驗組中食物攝取的急性作用。SC和HF140的動物允許自由進食他們的飲食。HS的動物除其標準飲食3天外，可以自由進食20％蔗糖溶液。接下來所有的組進行3天的標準進食，在試驗的第0天(圖5a)，在暗循環開始前1小時使用一種氣推注射器(Hamilton Corp)以1μl/min的速率向大鼠團注5ml的OA或賦形劑。注射后3天每天同一時間測試食物攝取。
NPY表達試驗。為了分析NPY的表達，我們研究了兩組大鼠，HF55和HF140。在按照各自的飲食攝取3天后，在暗循環開始前1小時將ICV賦形劑(10％HPB在aCSF中)或ICV OA(30nmol)團注到第三腦室。撤去食物并在注射后16小時收集下丘腦。
胰島素作用試驗。這里該試驗步驟是設計用來檢驗營養狀態對下丘腦長鏈脂肪酸調控碳水化合物代謝能力的影響。利用前面所述的方法(Liu等人，1998)向大鼠(n＝43)中植入長期的導管。從導管插入術中完全恢復后，將動物隨機的分成3組HF55(n＝16)，HF80(n＝9)，或者HF140(n＝18)并允許進食分配給它們的食物3天。在對它們體內試驗前的晚上所有的大鼠接受55 kcal以確保在開始代謝試驗時它們具有相同的營養狀態。所有的研究是在清醒的，不受脅迫的，長期插入導管的大鼠中進行。在t＝-120時(圖7a)，開始一種ICV OA(總劑量為30-或300-nmol)或賦形劑(10％的HBP在aCSF中)的致敏-連續注射并在試驗的剩下時間中保持。在ICV注射的開始(t＝-120)和在試驗的整個持續過程中周期性地進行血糖的測定。在開始(t＝-120)和實驗中每間隔30min收集得到用于胰島素，瘦素，和非酯化脂肪酸濃度測定的血漿樣品。在t＝0時，開始HPLC-純化的[3-3H]-葡萄糖(New England Nuclear，Boston，MA；40μCi團注，0.4μCi/min在試驗過程中)的致敏-連續注射并保持到試驗的最后4小時。在注射中每間隔10min取一次樣品用于3H-葡萄糖特異活性的檢測。最后，在t＝120時，開始胰腺-胰島素鉗夾試驗并保持2小時。在這一過程中，施用常規量的胰島素的致敏-連續注射，在t＝120時開始25％葡萄糖溶液的可變注射并周期性的調整從而保持血糖濃度為～7mM。胰島素的注射速率被設計用來替換吸收后大鼠中處于平均基礎水平的血漿胰島素濃度。為了控制ICV注射對內分泌胰腺的可能作用，生長激素抑制素與胰島素共同輸注以抑制內生的胰島素分泌。在體內試驗的最后，將大鼠麻醉(戊巴比妥55mg/kg體重，靜脈內)并利用在液氮中預冷的鋁鉗對組織樣品進行原位冷凍-鉗夾。所有的組織樣品在-80℃下儲存以供進一步分析。
分析步驟和計算。血糖濃度通過葡萄糖氧化酶方法進行測定(葡萄糖分析器II，Beckman Instruments，Inc. Fullerton，California，USA)。血漿中胰島素和瘦素水平通過RIA進行測定(大鼠瘦素RIA工具包，Linco Research Inc.，St.Charles，MO)。血清脂肪連接素(adiponectin)通過RIA進行測定(Linco Research，Inc.，St.Charles，MO)。血漿非酯化脂肪酸濃度按照廠商的說明書利用一個自動工具包(Waco Pure Chemical Industries.Osaka，Japan)進行酶學方法測定。在對其進行了蒸發以干燥除去氚水后，血漿中[3-3H]葡萄糖放射性從Ba(OH)2和ZnSO4沉淀的上清液(Somogyi步驟)進行測定。肝臟中尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)的濃度和特異的活性通過兩步連續的色譜分離獲得，如前面所述(Giaccari和Rossetti，1989；1992；Rossetti等人，1993；1996)。算法利用描述的方法進行(Barzilai等人，1997)。
Northern印跡分析。利用Trizol(Invitrogen Corp.，California，USA)從下丘腦和肝臟分離得到總RNA。利用Northern印跡分析NPY，葡萄糖-6-磷酸酶或者PEPCK的表達。利用prepro-NPY和β-肌動蛋白的探針分析下丘腦的RNA。為了評價ICV OA對于肝臟的酶的表達的作用，從經過胰島素鉗夾試驗的大鼠取得的冷凍-鉗夾肝臟組織中分離得到總RNA。如前面所述的方法(Combs等人，2001；Massillon等人，1996；1998)得到葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK cDNA。使用隨機的引物試劑盒(Stratagene)，對探針進行[α-32P]dCTP標記。利用掃描密度計量學進行量化，標準化成β-肌動蛋白信號和18S核糖體RNA以校正加樣變化。
通過方差檢驗對各組進行對比并且所有的數據都是以平均值±S.E.的形式給出。特別是，對于圖5中賦形劑和油酸的兩條曲線所列出的飼喂數據首先利用方差分析的方法對于反復測定的數據進行對比。如果顯示出統計學差異(曲線間)，則對每一個時間點的差異利用學生t檢驗進行評價。
這一實驗步驟是經過動物關懷機構和Albert Einstein藥學院使用委員會視察和認可的。
結果為了引發自動的攝食過量，對雄性的S-D大鼠自由施用高美味飲食，持續3天(表2)。每天檢測它們的食物攝取和對食物熱量水平增加的適應。不論高瘦素血癥和高胰島素血癥，這組的動物都不能適應飲食中提高的熱量水平并且以～70％到140％kcal/天的量增加了它們的每日能量攝取。因為當喂食標準飲食的時候同窩出生的小崽在進行同樣試驗時消費～80kcal/天，我們還將自由喂養的大鼠與一組接受80-kcal每天的成對喂養的大鼠以及一組使用同樣的高美味飲食的接受55-kcal/天的熱量限制大鼠進行比較。這種方法讓我們可以在反映適度熱量限制，成對喂養(pairfeeding)，和過量喂養三個每日熱量攝取水平上對中樞系統OA的作用進行研究。應該指出下面給出的關于成對喂養組的數據與標準飲食喂養的大鼠的數據非常相似(Obici等人，2002a)。因此，這一實驗方法讓我們可以驗證油酸(OA)對于食物攝取和胰島素作用的重要作用是否可以被短期的熱量攝取變化所調整。
表2.實驗組的一般特征。數據為平均值±SE.。鉗夾步驟中的數值表示通過對實驗中至少五個樣品取平均值得到的穩定狀態水平。對HF55或HF80*P＜0.01。
自動的過量飲食迅速地減弱了中樞的OA對進食行為和下丘腦NPY表達的作用。我們檢測了ICV OA是否可以調控經過三天自由過量進食的動物的進食行為。在ICV注射前3天每日檢測自由進食可引發攝食過量的高美味飲食(HF140)或標準飲食(SC；熱量攝取78±3kcal/天)的動物體內的食物吸收。為了檢測飲食中大量養料成分(例如高脂肪對高碳水化合物)對于OA靈敏度的影響，我們還測試了另外一組動物其除允許自由進食標準飲食外，還可以自由進食20％蔗糖(HS；熱量攝取93±4kcal/天，反映出與SC動物相比其熱量攝取增加了～20％)。在按它們制定的攝取量進行三天后，在暗循環開始前1小時所有的動物通過內置的ICV導管接受OA(30nmol)或賦形劑(HPB)的團注。在ICV注射后總共3天的時間內監控食物攝取(圖5a)并且在每個實驗組中將OA的效果與單獨使用賦形劑得到的數據進行比較。當向SC動物(圖5b，e)進行施用ICV OA時，在ICV注射后的第1天和第2天發現與注射前的基礎水平相比食物攝取分別減少了48％和52％。但是，在中度過量進食(HS95)3天后ICV OA減少的每日食物攝取第一天減少了21％以及第二天減少了17％(圖5d，e)。最后，在經過3天顯著的自由過量攝食后(HF140)，ICV OA對每日食物攝取的減少量第一天為11％以及第二天為-2％(圖5c，e)。在HS95和HF140組中發現的中度降低與單一ICV注射賦形劑的數據不具有統計學差異(圖5c，d)。所有的組在OA注射3天后返回到了基值的食物攝取(圖5b-e)。
我們接下來測試了一種潛在的機制，通過這種機制可以發展對下丘腦OA的抑制。我們先前報道了在對經過延長的(16h)禁食(Obici等人，2002a)后喂食標準食物的大鼠中與ICV賦形劑相比ICV OA后下丘腦的NPY mRNA降低了(以～50％)。這里我們懷疑是否營養情況的改變調整了ICV OA抑制下丘腦中NPY表達的能力。為了這個目的，在以高美味食物(～140kcal/d)或以55kcal/d的相同食物的標準進食3天后，我們利用northern印跡分析方法測試了下丘腦NPY mRNA的豐度。兩個實驗組在進行了一個晚上的禁食后都進行單次30nmol OA或賦形劑(HPB)的團注。在第二天早上收集下丘腦組織并且進行northern印跡分析方法(圖6a)。通過密度計量學的定量，使用β-肌動蛋白作為參考轉錄子，證明了NPY mRNA的平均水平在HF55和HF140中相似(圖6c)。ICV OA以～60％的量抑制了55-kcal/d組的NPY mRNA的表達(圖6d)。這種降低與先前報道的延長禁食(Obici等人，2002a)后以～70kcal/d進食標準飲食的大鼠的數據相同。但是，對于過量進食3天后實行禁食的動物中ICV OA僅僅以28％的水平降低了下丘腦NPY mRNA(圖6c，d)。這些數據提供證據證明對于提供了高美味飲食的動物表現出的過量飲食是部分地由于下丘腦NPY表達調控的缺陷。
自由的過量進食迅速地鈍化了中樞系統OA對于胰島素作用和肝臟葡萄糖產生的作用。我們接下來測試了營養狀況的短期改變是否足以改變OA對于體內胰島素作用的效果(圖7a)。通過ICV注射和胰腺-胰島素鉗夾試驗的結合我們評價了ICV OA在有知覺的大鼠中對于胰島素作用的效果(圖7b)。3個實驗組(HF55，HF80，和HF140)隨機的接受ICV OA或者賦形劑(HPB)處理(表2和圖7b)。基礎的血漿FFA和葡萄糖濃度在所有的組中都是相似的(表2)。在進行胰腺的-血糖正常鉗夾試驗前一天，所有的大鼠接受相同量的熱量(55kcal)以確保代謝測試前相同的吸收后狀態(圖7a)。當提供ICV賦形劑和接近循環胰島素的基礎水平時，需要提供葡萄糖注射的邊緣速率(GIR)以保持3個實驗組(HF55-2.4，HF80-1.2，和HF140-1.4mg/kg/min)中的正常血糖(圖3c)。相反，在HF55和HF80組中，在OA的ICV注射后(30nmol)為了維持正常血糖的GIR顯著增加了(分別是9.55和4.64mg/kg/min)。但是，相同劑量OA的ICV注射沒能增加自由進食組中的GIR。實際上，即使10倍計量OA(300nmol)的注射也沒有顯著增加這組的GIR(圖7c)。由于HF55組中ICV OA對于GIR的刺激作用顯然高于(約2倍)在HF80組中的水平，因此，這一增加的出現更多的依靠前面所述的動物營養狀態，即使是在通常至低水平的熱量攝取范圍內。在鉗夾實驗中(表2)血漿FFA濃度沒有改變說明由ICV OA引起的代謝作用是由在中樞神經系統(CNS)中它的作用啟動的。
在基礎胰島素水平的情況下由OA的ICV施用引起的外源葡萄糖需求的增長可能是由于葡萄糖攝取的刺激和/或內源葡萄糖產生(GP)的抑制。但是，在三個組中葡萄糖的消逝速率(在圖7d中的Rd)是相似的以及最重要的是ICV OA沒有顯著的改變它們。因此，在HF55和HF80組中由ICV OA引起的整個體內胰島素作用的增加不能表現出外周葡萄糖攝取的增加(圖7d)。在另一方面，ICV OA(以30nmol)在HF55和HF80組中顯著地抑制了GP，但是在自由進食的大鼠中沒有(HF140)。實際上，即使10倍的OA中樞施用也沒有顯著降低自由進食組中的GP(圖8a)。與從GIR所觀察到的作用相同，由于ICV OA引起的GP的抑制在HF55組中(從基值下降了71％)比在HF80組中(從基值下降了-45％)更顯著(圖8b)。最后，由于ICV OA引起的GP的抑制完全解釋了ICV OA對GIR的刺激。為了進一步驗證營養狀況在代謝變化中調控ICV OA效果方面的作用，我們將由ICV OA或者賦形劑引起的GP的改變作為體重下降百分比(圖8c)和每日食物攝取(圖8d)的函數繪制了圖。ICV OA的抑制作用直接正比于每日食物攝取和體重增加的減少。重要的是，在接受ICV對照的組中發現GP和GIR的改變與食物攝取/體重的改變之間沒有顯著的相關性(數據沒有顯示)。通過設計的僅僅正常進食不同熱量攝取水平的標準飲食的實驗發現在OA和GP的抑制之間具有相似的相關性(數據沒有顯示)。因此，OA的中樞施用引起的GP抑制程度呈現出高度依賴于熱量攝取和/或體重的短期改變。
ICV OA顯著地降低了由葡萄糖-6-磷酸酶引起的體內變化。GP表示由糖異生和肝糖元分解得到的葡糖基單元的凈貢獻。但是，通過葡糖激酶的磷酸化作用進入肝臟的一部分葡萄糖也是葡萄糖-6-磷酸酶去磷酸化作用的底物。這個葡糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶之間的循環一般被稱為葡萄糖循環并用解釋了總葡萄糖輸出(葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化)和GP之間的差異(圖9a)。
為了進一步描繪ICV OA注射對于肝臟葡萄糖產生的作用我們評價了由葡萄糖-6-磷酸酶引起的體內變化和葡萄糖循環對葡萄糖輸出的相關貢獻(表3；圖9b，c)。圖9b，c顯示了在胰腺-胰島素鉗夾試驗中ICV OA和ICV賦形劑對于肝臟葡萄糖變化的作用。在提供相似的血漿胰島素濃度時，在HF55和HF80組中通過ICV Office Action葡萄糖產率(如圖8a所示的)降低了但是沒有出現在自由進食的大鼠中(HF140)。表3顯示了用于計算血糖對肝臟葡萄糖-6-磷酸池貢獻(％直接在表3中)的[3H]-UDP-葡萄糖，和[3H]-UDP-葡萄糖特異活性。這些數據允許我們在所有的組中測試由葡萄糖-6-磷酸酶(在圖9b中的總葡萄糖輸出)和葡萄糖循環的速率(圖9c)引起的體內變化。如圖9b中所示，與HF55組的動物對于GP的效果相同ICV OA顯著地降低了由葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化。與接受ICV賦形劑相比較在接受ICV OA的大鼠中與這種整體的葡萄糖輸出的顯著降低相一致葡萄糖循環的速率也降低了(圖9c)。但是，這種葡萄糖循環速率的降低遠不如葡萄糖-6-磷酸酶變化明顯并且實際上它沒有取得統計學意義。下面的發現結合在直接途徑中中度增加的％(表3)與中樞的OA對于肝臟的葡萄糖磷酸化的刺激作用相一致。因此，短期的OA中樞注射顯著地導致了由葡萄糖-6-磷酸到葡萄糖的凈去磷酸化作用的降低，這主要歸因于與通過葡糖激酶引起的體內變化的中度刺激相結合的通過葡萄糖-6-磷酸酶得到的體內變化的降低。這些ICV OA的效果通過3天的自動過量進食就可以鈍化。
表3.ICV OA對于肝臟UDP葡萄糖形成“直接”途徑的影響。血糖和肝臟UDP葡萄糖(UDPG1c)的特異活性用于計算在胰腺/胰島素鉗夾試驗完成[3H-3]-葡萄糖注射后的大鼠中血糖對于肝臟UDP葡萄糖的貢獻。
ICV OA對于肝臟葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK表達的影響。OA的中樞施用對于肝臟葡萄糖變化的潛在作用提示我們去測試肝臟內主要代謝酶的mRNA水平的變化是否可以部分地解釋這些效果。因此，我們接下來對熱量限制或過量飼喂的大鼠中進行OA或賦形劑的ICV注射后的組織樣品檢測了作為18S核糖體RNA(圖9d)或β-肌動蛋白mRNA(沒有顯示)函數的葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK在肝臟中的豐度。ICV OA顯著地減少了熱量限制的大鼠中葡萄糖-6-磷酸酶基因的表達。利用密度計量學對多印跡進行量化分析(圖9e，f)，利用β-肌動蛋白作為一個參考轉錄子，證明了ICV OA在HF55組中以～73％的量抑制了葡萄糖-6-磷酸酶mRNA的表達，但是在HF140組中沒有檢測到任何改變。相反地，ICV OA在兩個組中都沒有顯著地改變肝臟的PEPCK表達。ICVOA對于葡萄糖-6-磷酸酶的顯著抑制作用可能是由于它對熱量限制大鼠中葡萄糖-6-磷酸酶引起的體內變化的潛在限制作用。
討論肥胖和DM2的發展是受環境和基因因素的復雜相互關系所影響的(Friedman，2003；Hill和Peters，1998；Ravussin和Gautier，1999)。其它人和我們已經提出這種觀點即通常的中樞路徑能夠引發對營養可利用度的應答，其包括飲食行為和代謝過程的改變(Woods等分，1998；Obici等人，2002e；2002f；Barzilai等人，1997；Shimomura等人，1999；Spiegelman和Flier，2001；Wang等人，1997；Schwartz等人，2000)。在這方面，營養-依賴信號(例如，瘦素和胰島素)將生物體的營養狀況傳達給下丘腦，在這里信息得到整合并且被轉換成輸出信號從而限制外源的或內源的營養輸入到循環中。此外，最近已經提出了在選擇的下丘腦神經元中的脂類代謝是營養可利用度的一個主要的生物傳感器，其反過來表現對食物攝取(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；2003)和內源葡萄糖產生(GP)(Obici等人，2002a；2003)的負反饋。實際上，脂肪酸合酶(FAS)抑制劑(Loftus等人，2000)，和肉堿棕櫚酰基轉移酶-1(CPT-1)拮抗劑(Obici等人，2003)，或者LCFA油酸(Obici et等人，2002a)的中樞施用導致了食物攝取的降低(Obici等人，2002d；2002e；Zhang等人，1994)和內生葡萄糖產生的抑制(Obici等人，2002d；2002e；Zhang等人，1994)。基于以上發現，我們推測這些中樞厭食劑的通常作用是增加下丘腦弓狀核中LCFA-CoAs的細胞濃度(Obici et等人，2003)。后者的增加可能可以反過來參加一種負反饋系統從而用于調整在循環中的營養量以應對營養可利用度的改變(Obici等人，2003)。
這里，我們報道了長鏈脂肪酸油酸的中樞施用抑制食物攝取和下丘腦NPY表達的能力被隨后在大鼠中進行的為期3天的自由過量進食所鈍化。類似地，暴露于可以導致食欲抗進的美味飲食導致了對于易感動物模型下丘腦瘦素和胰島素的厭食和代謝作用的抗性(Friedman，2000；Coleman，1979；Neel，1999；Wang等人，2001)。神經肽Y(NPY)，一種有效的外生神經肽，是下丘腦瘦素和胰島素的下游靶而它們沒能抑制NPY可能部分地解釋了為什么肥胖的一般特征表現為正常的或升高的食物攝取而不是血漿中瘦素和胰島素水平的提高。有意思的是，NPY也是LCFA-CoAs的下游靶，因為當進行油酸，FAS或CPT-1抑制劑的中樞施用時防止了由節食引起的下丘腦NPYmRNA的提高(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；2003)。這種在過量進食的大鼠中觀察到的由脂肪酸引起的對下丘腦NPY表達抑制的削弱可能對確定禁食后的食欲抗進水平起到了非常重要的作用，此時循環脂肪酸升高并且血漿瘦素和胰島素水平降低。但是，還應該被記住的是下丘腦中脂肪酸的細胞代謝可能在調控營養信號方面扮演重要角色(Zhang等人，1994)。在這方面，已經很好地-確定的細胞碳水化合物和脂類代謝之間的生化聯系可能起到了非常重要的作用。實際上，我們推測LCFA CoAs的細胞水平可能代表應答脂肪酸的增長的利用度而產生的主要信號。相同地，簡單的碳水化合物(例如蔗糖)的利用度的增長可以通過增加可抑制脂肪酸氧化的(糖分解得到的)丙二酰-CoA的水平來顯著地增加LCFA-CoAs的細胞水平。因此，可能這種中樞營養-傳感機制可能可以對脂類或碳水化合物的的利用度的增加做出反應。反過來細胞內LCFA-CoAs的持續增長可能導致相應的細胞內脂類代謝的適應性改變(例如，ACC的抑制導致丙二酰-CoA形成的下降)。與這一假設相符，我們發現通過高脂肪或高蔗糖飲食達到的每日熱量攝取的增加同樣地鈍化了ICV OA對于食物攝取的作用，表明與飲食中大量營養組分的改變相比每日熱量攝取的改變可能更能解釋這種效果。在這點上，有意義的是FAS抑制劑C75的厭食效果在小鼠由于飲食引起的和基因原因的肥胖中得到了保留(Thupari等人，2002)。作為對比，在過量禁食的大鼠中ICV OA的弱響應可能繼發于由酰基-CoA合成酶活性的降低或者酰基-硫酯酶活性的升高引起的LCFA酯化的減少和/或由于CPT1活性提高或丙二酰-CoA的耗竭而引起的LCFA-CoAs代謝的加速。如其它由于飲食引起的肥胖的模型中(Friedman，2000；Coleman，1979；Neel，1999；Wang等人，2001)，對于厭食劑應答的缺乏可能預示了(油酸)對飲食行為的削弱的作用和/或無法抵消高脂肪和高蔗糖飲食的高美味效果。
為什么食物攝取的短期增長導致下丘腦響應的削弱？可能，這是一種企圖為了促進有效能量的儲存以作為對食物利用度增加的“適應性”響應。根據Neel的節約基因型假設(Neel，1999)這一機制可能已經發展成為一種進化壓力的結果。有趣的是已經證明外周的營養-傳感途徑存在對過量進食的簡單反常適應性，所述傳感途徑的刺激應答于營養可利用度的增加而減少了線粒體功能和能量支出(Obici等人，2002d)。
最近的關于胰島素(Obici等人，2002e)，瘦素(Liu等人，1998)，黑皮質素(Obici等人，2001)，和游離脂肪酸的中樞施用的代謝作用的研究支持了這個觀點，即這些中樞下丘腦路徑也包括在肝臟葡萄糖輸出和胰島素作用的調控中。由于肝臟的葡萄糖產生是主要的內生能量來源，我們已經提出中樞神經回路伴隨地調整外生和內生的能量源，與設計用來監控和調節循環中營養輸入的負反饋系統相協調(Obici等人，2002a)。循環中的脂肪酸通常以及主要通過自由形式的簡單擴散來通過血腦屏障(BBB)。未結合的脂肪酸也可以通過血液中或大腦毛細血管床處脂蛋白脂肪酶對脂蛋白的水解作用來獲得。因此，乳糜微粒可能是飯后狀態的大腦脂肪酸的主要循環來源而在禁食狀態中未結合的脂肪酸和局部的水解脂肪酸結合在一起構成大腦脂肪酸池。一小部分進入大腦的脂肪酸也可能是通過位于腦血管內皮內腔表面上的脂蛋白受體的媒介作用而直接吸收的脂蛋白顆粒(Rapoport，2001；Qi等人，2002)。全面的，循環的游離脂肪酸進入中樞神經系統通常正比于它們的血漿濃度(Miller等人，1987；Rapoport，1996)以及在禁食麻痹狗中它們在腦脊髓液中的濃度是血漿濃度的～6％(Goto和Spitzer，1971)。因此，盡管不能簡單地推斷出ICV油酸對生理學狀況的影響，我們的發現提出了這種可能性，即在下丘腦中營養引起的有效行為和脂肪酸代謝效果的改變可能有助于能量平衡和胰島素作用的調整。在另一方面，已經很早就被公認的熱量攝取的改變對于與葡萄糖代謝有關的胰島素作用具有一個很大的影響(Pagliassotti等人，1997)。在這點上，在動物和人類過量飲食后的幾天和/或幾周內肝臟的胰島素抗性得以發展(Clore等人，1995)。
這里我們報道了在由于ICV OA引起的GP抑制和動物的營養狀態(例如，體重/熱量吸收)之間的很強的相關性。在提供基礎的胰島素水平時，下丘腦胰島素信號的刺激(Obici等人，2002e)或OA的中樞施用(Obici等人，2002a)導致了內源葡萄糖產生的抑制。這種LCFAs的“胰島素樣”中樞效果呈現出與它們已經很好的建立的在外周組織中的活性不同(Boden等人，1994；Roden等人，1996；Rebrin等人，1995)。例如，循環中和肝臟中FFA水平的提高減少了胰島素對于內源葡萄糖產生的抑制作用(也就是說，減少了肝臟胰島素抗性)，然而中樞脂肪酸水平的提高增強了對內生葡萄糖產生的抑制作用，即使在提供基礎胰島素的情況下。相同地，脂肪酸可利用度的增加誘導了了葡萄糖-6-磷酸酶在肝臟中的表達(Massillon等人，1997)而OA的中樞施用減少了肝臟中同一種酶的表達。可以想象得到脂肪酸的中樞效果對于它們在肝臟葡萄糖變化方面的作用提供了重要的抑制。既然OA的中樞施用不能抑制過量進食大鼠的GP，我們假設這種OA對于抑制肝臟葡萄糖產生和葡萄糖-6-磷酸酶表達水平方面的無能剩下了那些不被它們的中樞作用所反對的脂肪酸的外周作用。因此可能是對下丘腦LCFA響應的缺乏導致了葡萄糖輸出速率的增加并有助于在這個模型中所觀察到的肝臟胰島素抗性。
這種下丘腦營養傳感可能在能量劃分上也具有作用。在一般的情況下，下丘腦脂肪酸可利用度的增加導致肝臟中葡萄糖輸出的減少(Obici等人，2002a；2003)從而促進了肌肉和其它外周組織的脂肪的優先利用。但是，當這種脂肪酸的可利用度持續增加時，它就觸發了“節約”代謝機制的活性，該機制用來促進脂類有效地進入能量儲存(甘油三酸酯)位點的變化。在過量進食的大鼠中肝臟葡萄糖產生的增加可能通過提供另一種氧化能量來達到這個目標。
這種OA調控肝臟葡萄糖變化的下游機制尚待進行描繪。但是，這種體內葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化和由ICV OA引起的肝臟內葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基的表達的顯著減少可能起到了關鍵作用。下丘腦的脂類傳感是如何調控肝臟葡萄糖變化和基因表達的呢？可能自主神經系統傳出的快速改變起到了一個最主要的作用。瘦素的ICV施用增加了不同區域位點的自主傳出(Liu等人，1998)。眾所周知交感神經和副交感神經系統都直接的提供了對于肝臟，胰腺，和脂肪組織(分別通過內臟神經和迷走神經)的神經支配。實際上，下丘腦腹側正中的損傷導致了急性的和慢性的高胰島素血癥并且其可以通過進行膈下迷走神經切割術來逆轉(Berthoud和Jeanrenaud，1979；Inoue andBray，1977)。在另一方面，對于下丘腦側的電刺激沒能增加胰島素分泌或改變血胰高血糖素濃度(Berthoud和Jeanrenaud，，1979；Inoue和Bray，1977；Shimazu等人，1978)。但是，應當指出在進行胰腺鉗夾實驗中所有的研究都已經進行了。因此，這些胰腺激素水平的改變不可能用來解釋ICV OA對于肝臟葡萄糖變化的影響。如所指出的，對于下丘腦腹側正中的電刺激導致了對于大鼠肝臟中主要葡糖異生酶PEPCK和葡萄糖-6-磷酸酶活性的增加，以及對于丙酮酸激酶-主要的糖酵解酶的顯著抑制(Inoue和Bray，1977；Shimazu，1996)。在另一方面，對于下丘腦側的刺激導致了PEPCK活性的降低。最后，不同的脂肪庫接受來自自主神經系統的輸入。后者已經顯示可以反過來調控基因表達和脂肪來源的激素和細胞因子的分泌(在Kahn和Flier發表的評論中，2000)，其對于胰島素作用具有有效的作用(Combs等人，2001；Rajala等人，2003)。為此，ICV OA對于葡萄糖-6-磷酸酶表達和肝臟葡萄糖變化的作用使人想起那些由于向小鼠中注射了重組脂肪連接素所產生的變化(Combs等人，2001)。但是，在任意試驗組的ICV注射過程中我們都無法檢測到血漿瘦素和血漿脂肪連接素水平的改變(表2)。
總之，我們已經證明了長鏈脂肪酸對于食物攝取和GP的中樞影響是營養調控的。在正常情況下生物學反應(例如，食物攝取和葡萄糖輸出的改變)在一個嚴謹的范圍內保持體內脂肪和葡萄糖的動態平衡。但是，營養可利用度的持續增長誘導下丘腦營養傳感系統的迅速癱瘓(當短期熱量限制提高時)。我們推測下丘腦對于例如瘦素，胰島素和脂肪酸等多種營養信號抗性的迅速開始有助于易感的人體和動物體對于肥胖病和對于胰島素抗性的易感性。
實施例4.依靠ATP的鉀通道和迷走神經在下丘腦調控葡萄糖產生方面的作用下丘腦脂氧化的減少通過刺激鉀通道(KATP)和迷走神經來抑制內源葡萄糖產生(GP)。向第三腦室(ICV)中施用長鏈脂肪酸(LCFA)油酸(OA)或者CPT-1活性抑制劑(CPTi)來抑制GP。這里，我們假設CPTi的下丘腦脂類氧化抑制作用減少GP，這一點是通過依靠ATP的鉀通道(KATP)的中樞活化作用導致迷走神經到肝臟的輸入的增加實現的。為了抑制LCFA進入線粒體，我們劇烈地(持續6小時)輸注帶有(CPTi-GLY和CON-GLY)或者不帶有(CPTi和CON)ICV格列苯脲(GLY，KATP“阻滯劑”)的ICV CPTi或者它的無活性立體異構體(CON)到長期帶有導管的S-D大鼠中。所有的大鼠還在ICV注射中的最后4小時接受了[3-3H]葡萄糖的靜脈輸注和在每項研究的最后兩小時進行胰腺/胰島素鉗夾(胰島素1mU/kg.min；生長激素抑制素3mg/kg/min)試驗。在提供基礎胰島素水平時，在CPTi(4.9±1.0mg/kg/min)組中需要進行葡萄糖注射(GIR)以防止低血糖癥，但是在CON(2.1±0.4mg/kg/min)組中和CPTi-GLY(1.4±0.5mg/kg/min)組中不用注射。在CPTi組中GP顯著地和明顯地降低了(-47±5％對應于基礎值；p＜0.01；n＝7)，但是在CON(-15±6％；n＝6)或CPTi-GLY(-11±8％；n＝6)組中沒有。ICV GLY沒有改變CON-注射大鼠中的GIR和GP(沒有顯示)。為了研究這種神經路徑是否通過迷走神經肝臟支路來發揮作用，還對接受肝臟選擇性迷走神經切斷術(LV)或者假手術(SH)的大鼠進行了ICV CPTi或CON注射。與CON-SH(1.3±0.4mg/kg/min)和CPTi-LV(0.8±0.5mg/kg/min)相比，在CPTi-SH(4.7±1.3mg/kg/min)組中GIR明顯更高。這些GIR的不同完全可以用在CPTi-SH組中出現而在CON-SH(-5±3％；n＝6)組中或在CPTi-LV(-11±4％；n＝7)組中沒有出現的GP的顯著降低(-48±2％；P＜0.01；n＝5)來解釋。LV本身(CON-LV)不影響GIR和GP。因此，下丘腦脂類傳感通過需要KATP活性和迷走神經對肝臟的輸入的神經環路來有效的調控GP。
應答脂類注射的肝臟“自我調控”需要K-通道(KATP)的中樞刺激和肝臟的迷走神經分布。在提供基礎的胰島素水平時，通過脂類注射增加的血漿中長鏈脂肪酸(LCFA)水平刺激了糖異生(GNG)但是因為補償性的肝臟內肝糖分解的下降(GLG)所以并不改變內源葡萄糖產生(GP)(肝臟的“自我調控”)。由于向第三腦室施用LCFA油酸通過對KATP的刺激而抑制了GP，所以在這里我們推測1)在脂類注射過程中通過LCFA對KATP的中樞激活作用抑制GP，和2)這種作用需要肝臟內迷走神經的輸入。為了這個目的，經過5小時禁食的S-D大鼠被隨機的接受以下物質進行6小時IV Intra lipid+肝素(IL)(增加了3倍的LCFA水平)或者鹽(S)結合ICV格列苯脲(G)[KATP阻斷劑]或者賦形劑(C)。所有的大鼠還在ICV注射的最后4小時接受[3-3H]-葡萄糖的靜脈注射并在最后10分鐘進行[U-14C]-乳酸鹽的注射以及在每項研究的最后兩小時進行胰腺/胰島素鉗夾試驗。在鉗夾過程中，當提供接近的基礎胰島素水平時(～27μU/ml)，在S+ICVC，S+ICVG或IL+ICVC中GP(～6mg/kg.min)都沒有改變。帶有ICVC或ICYG的脂類注射增加了GNG但是只有IL+ICVG沒有抑制GLG，導致GP的增加(達到9.8±0.3；P＜0.001)。為了驗證LCFA對GP的中樞作用是否通過迷走神經的刺激所介導，我們接下來在進行了選擇性肝臟迷走神經切斷術(HV)的大鼠中重復了脂類注射試驗。在胰腺鉗夾實驗中，S-處理HV和S或IL處理的假手術大鼠中GP(～6mg/kg/min)是相似的。重要的是，IL在HV組中將GP增加到了9.7±0.5(P＜0.001)，概述了ICVG的作用。在所有的組中葡萄糖利用都是相同的。
總而言之，外周LCFA引起的肝臟葡萄糖“自我調控”需要下丘腦KATP和肝臟迷走神經。因此，我們推測系統性高血脂激活了中樞脂類傳感途徑，其通過需要中樞KATP激活和迷走神經傳出纖維向肝臟的輸入降低的神經回路來有效地控制GP。
回顧上面的描述，可以看出本發明的一些優點已經獲得而其它優點也達到了。
由于對于上述方法和組成進行的不同的改變并不超出本發明的范圍，這意味著在上述說明書中和附圖中顯示的所有內容都應該解釋為描述性的而不是一種限定意義。
所有在說明書中所引用的參考文件在這里作為參考完整的引入本發明中。這里對于參考文件的討論僅僅是為了總結作者所提出的理論并且沒有承認這里所有的參考文件都看作現有技術。申請人保留挑戰這些參考文件精確性和相關性的權利。
附錄-SEQ ID NOsSEQ ID NO1-核酶ACAGCACGCCGCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCACGUUCUUCGUCSEQ ID NO2-核酶CTGTACCAAAGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGCCGCTCACAATGASEQ ID NO3-核酶CATTGTGAGCGGCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCTCTTTGGTACAGASEQ ID NO4-隨機序列GGAGCCTCGAGATCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGTGAGCGTTTGGSEQ ID NO5-CPT1L前引物CTCCGAGCTCAGTGAGGACCTAAAG-3′SEQ ID NO6-CPT1L反向引物CAAATACCACTGCAATTTGTGSEQ ID NO7-CPT1M前引物CCAGACTGCAGAAATACCTGGTGCTCSEQ ID NO8-CPT1M反向引物GTTCTGACGTGCTTCTGCCCACTCTACSEQ ID NO9-NPY前引物GCCATGATGCTAGGTAACAAACGSEQ ID NO10-NPY反向引物GTTTCATTTCCCATCACCACATG
SEQ ID NO11-POMC前引物CCAGGCAACGGAGATGAACSEQ ID NO12-POMC反向引物TCACTGGCCCTTCTTGTGCSEQ ID NO13-AgRP前引物GCCATGCTGACTGCAATGTTSEQ ID NO14-AgRP反向引物TGGCTAGGTGCGACTACAGASEQ ID NO15-β-肌動蛋白 前引物TGAGACCTTCAACACCCCAGCCSEQ ID NO16-β-肌動蛋白 反向引物GAGTACTTGCGCTCAGGAGGAG
權利要求
1.一種在哺乳動物中減少食物攝取和葡萄糖產生的方法，該方法包括增加哺乳動物下丘腦的長鏈脂肪酰基-輔酶-A(LC-CoA)水平，其中所述哺乳動物具有至少一種選自以下的病癥肥胖、2型糖尿病、瘦素抗性、胰島素抗性、促性腺激素缺乏癥、無月經和多囊卵巢綜合癥。
2.根據權利要求1的方法，其中LC-CoA是通過減少下丘腦LC-CoA-減少分子的活性來增加的。
3.根據權利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子選自肉堿棕櫚酰基轉移酶1(CPT1)，丙二酰-輔酶A脫羧酶，肉堿酰基肉堿移位酶，酰基-輔酶A脫氫酶，2-烯酰基-輔酶A水合酶，3-羥酰-輔酶A脫氫酶，3-氧酰-輔酶A硫解酶，和酰基-輔酶A水解酶。
4.根據權利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子是CPT1。
5.根據權利要求4的方法，其中CPT1是肉堿棕櫚酰基轉移酶-1的肝臟同種型(CPT1L)。
6.根據權利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用藥物組合物來減少的，所述藥物組合物包括可以減少LC-CoA-減少分子活性的小分子。
7.根據權利要求6的方法，其中藥物組合物是通過組合物向大腦的直接施用方式來施用給哺乳動物大腦的。
8.根據權利要求6的方法，其中小分子當出現在藥物組合物中時是可以通過血-腦屏障的。
9.根據權利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用抗體或包含抗體結合位點的抗體片段來減少的，其中抗體或者抗體片段可以與LC-CoA-減少分子結合從而抑制這種分子的活性。
10.根據權利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用抑制性的核酸或模擬體來減少的。
11.根據權利要求10的方法，其中抑制性的核酸或者模擬體選自核酶，反義化合物，適配子和iRNA。
12.根據權利要求10的方法，其中抑制性的核酸或者模擬體是核酶。
13.根據權利要求12的方法，其中LC-CoA-減少分子是CPT1L并且核酶包括序列5′-ACAGCACGCCGCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCACGUUCUUCGUC-3′。
14.根據權利要求1的方法，其中LC-CoA水平是通過增加下丘腦LC-CoA-增加分子的活性來增加的。
15.根據權利要求14的方法，其中LC-CoA-增加分子選自乙酰-輔酶A羧化酶，脂肪酸轉運分子，酰基-輔酶A合成酶，肉堿棕櫚酰基轉移酶II，和酰基-輔酶A硫酯酶。
16.根據權利要求14的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用藥物組合物來增加的，所述藥物組合物包括能夠刺激LC-CoA-增加分子生產或活性的小分子。
17.根據權利要求16的方法，其中藥物組合物是通過直接施用給大腦的方式來施用給哺乳動物大腦的。
18.根據權利要求16的方法，其中藥物組合物可以通過血-腦屏障。
19.根據權利要求14的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向下丘腦施用這種分子或者編碼這種分子的載體來增加的。
20.根據權利要求19的方法，其中這種分子是包含在藥物可接受載體中施用給下丘腦的。
21.根據權利要求19的方法，其中將編碼這種分子的載體施用給下丘腦。
22.根據權利要求21的方法，其中載體是病毒載體。
23.根據權利要求1的方法，其中LC-CoA是通過直接向大腦施用LC-CoA來增加的。
24.根據權利要求1的方法，其中哺乳動物是嚙齒類動物。
25.根據權利要求1的方法，其中哺乳動物是人類。
26.根據權利要求1的方法，其中哺乳動物是患有糖尿病的。
27.根據權利要求1的方法，其中哺乳動物超過正常體重至少5％。
28.根據權利要求1的方法，其中哺乳動物超過正常體重至少20％。
29.根據權利要求1的方法，其中食物攝取減少至少5％。
30.根據權利要求1的方法，其中食物攝取減少至少20％。
31.根據權利要求1的方法，其中食物攝取減少至少40％。
32.一種在患有食物攝取或葡萄糖產生不足的病癥的哺乳動物中增加食物攝取和葡萄糖產生的方法，該方法包括減少哺乳動物下丘腦長鏈脂肪酰基-輔酶-A(LC-CoA)的水平。
33.根據權利要求32的方法，其中LC-CoA的水平是通過減少下丘腦LC-CoA-增加分子的活性來減少的。
34.根據權利要求33的方法，其中LC-CoA-增加分子是選自乙酰-輔酶A羧化酶、脂肪酸轉運分子、酰基-輔酶A合成酶、肉堿棕櫚酰基轉移酶II和酰基-輔酶A硫酯酶。
35.根據權利要求33的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用藥物組合物來減少的，所述藥物組合物包括能夠抑制LC-CoA-減少分子活性的小分子。
36.根據權利要求35的方法，其中藥物組合物是通過直接向哺乳動物大腦施用的形式來施用給哺乳動物大腦的。
37.根據權利要求35的方法，其中小分子當出現在藥物組合物中時可以通過血-腦屏障。
38.根據權利要求33的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用抗體或包含抗體結合位點的抗體片段來減少的，其中抗體或者抗體片段能夠與LC-CoA-增加分子結合從而抑制這種分子的活性。
39.根據權利要求33的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用抑制性的核酸或模擬體來減少的。
40.根據權利要求39的方法，其中抑制性的核酸或模擬體選自核酶、反義化合物、適配子和iRNA。
41.根據權利要求39的方法，其中這種抑制性的核酸或模擬體是核酶。
42.根據權利要求32的方法，其中LC-CoA的水平是通過增加下丘腦LC-CoA-減少分子的活性來減少的。
43.根據權利要求42的方法，其中LC-CoA-減少分子選自肉堿棕櫚酰基轉移酶1(CPT1)，丙二酰-輔酶A脫羧酶，肉堿酰基肉堿移位酶，酰基-輔酶A脫氫酶，2-烯酰基-輔酶A水合酶，3-羥酰-輔酶A脫氫酶，3-氧酰-輔酶A硫解酶，和酰基-輔酶A水解酶。
44.根據權利要求42的方法，其中LC-CoA-減少分子是CPT1。
45.根據權利要求44的方法，其中CPT1是肉堿棕櫚酰基轉移酶-1的肝臟同種型(CPT1L)。
46.根據權利要求42的方法，其中LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用藥物組合物來增加的，所述藥物組合物包括能增加LC-CoA-增加分子活性的小分子。
47.根據權利要求46的方法，其中藥物組合物通過直接施用給大腦的方式施用到大腦。
48.根據權利要求46的方法，其中這種藥物組合物可以通過血-腦屏障。
49.根據權利要求42的方法，其中這種LC-CoA-增加分子的活性是通過向下丘腦施用這種分子或編碼這種分子的載體來增加的。
50.根據權利要求49的方法，其中這種分子是包含在藥物可接受載體中施用下丘腦的。
51.根據權利要求49的方法，其中將編碼這種分子的載體施用到下丘腦。
52.根據權利要求51的方法，其中這種載體是病毒載體。
53.根據權利要求32的方法，其中這種哺乳動物是嚙齒類動物。
54.根據權利要求32的方法，其中這種哺乳動物是人類。
55.根據權利要求32的方法，其中這種哺乳動物低于正常體重至少10％。
56.根據權利要求32的方法，其中這種哺乳動物低于正常體重至少20％。
57.根據權利要求32的方法，其中食物攝取提高至少5％。
58.根據權利要求32的方法，其中食物攝取增加至少20％。
59.根據權利要求32的方法，其中食物攝取增加至少40％。
60.根據權利要求32的方法，其中這種哺乳動物正在經受導致食物攝取或葡萄糖產生不足的治療。
61.根據權利要求60的方法，其中這種治療是進行癌癥化療。
62.根據權利要求32的方法，其中這種哺乳動物具有導致食物攝取或葡萄糖產生不足的病毒感染。
63.根據權利要求62的方法，其中這種哺乳動物是人類并且這種感染是HIV-1。
64.根據權利要求32的方法，其中這種哺乳動物是低血糖癥患者。
65.一種在具有肝臟自我調節功能不全的哺乳動物中恢復肝臟自我調節功能的方法，這種方法包括增加哺乳動物下丘腦長鏈脂肪酰基-輔酶-A的水平。
66.根據權利要求65的方法，其中LC-CoA是通過減少下丘腦LC-CoA-減少分子活性來增加的。
67.根據權利要求66的方法，其中這種LC-CoA-減少分子是CPT1。
68.根據權利要求67的方法，其中這種CPT1是肉堿棕櫚酰基轉移酶-1的肝臟同種型(CPT1L)。
69.根據權利要求66的方法，其中這種LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用藥物組合物來減少的，所述藥物組合物包括能夠減少這種LC-CoA-減少分子活性的小分子。
70.根據權利要求66的方法，其中這種LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用抗體或包含抗體結合位點的抗體片段來減少的，其中這種抗體或者抗體片段能夠與LC-CoA-減少分子結合從而抑制這種分子的活性。
71.根據權利要求66的方法，其中這種LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動物大腦施用抑制性的核酸或模擬體來減少的。
72.根據權利要求71的方法，其中這種抑制性的核酸或模擬體是核酶。
73.根據權利要求65的方法，其中LC-CoA水平是通過增加下丘腦LC-CoA-增加分子的活性來增加的。
74.根據權利要求65的方法，其中LC-CoA是通過直接向大腦施用LC-CoA來增加的。
75.根據權利要求65的方法，其中這種哺乳動物是嚙齒類動物。
76.根據權利要求65的方法，其中這種哺乳動物是人類。
77.根據權利要求65的方法，其中這種哺乳動物是糖尿病患者。
78.一種在哺乳動物中減少食物攝取和葡萄糖產生的方法，這種方法包括刺激肝臟的迷走神經傳出纖維，其中這種哺乳動物具有至少一種選自以下的病癥肥胖、2型糖尿病、瘦素抗性、胰島素抗性、促性腺激素缺乏癥、無月經和多囊卵巢綜合癥。
79.根據權利要求78的方法，其中這種肝臟的迷走神經傳出纖維是被電刺激的。
80.根據權利要求78的方法，其中肝臟的迷走神經傳入纖維沒有被刺激的。
81.根據權利要求78的方法，其中這種肝臟的迷走神經傳出纖維是通過直接刺激肝臟來進行刺激的。
82.一種在具有肝臟自我調節功能不全的哺乳動物中恢復肝臟自我調節功能的方法，該方法包括刺激肝臟的迷走神經傳出纖維。
全文摘要
本發明涉及減少哺乳動物食物攝取和葡萄糖產生的方法，或者恢復肝臟的自我調整功能的方法。該方法包括提高下丘腦的長鏈脂肪酰基－輔酶A(LC－CoA)的含量，或者刺激迷走神經肝臟分支的傳出纖維。本發明還提供了提高哺乳動物食物攝取和葡萄糖產生的方法。該方法包括減少哺乳動物中下丘腦的長鏈脂肪酰基－輔酶A(LC－CoA)的含量。
文檔編號A61K31/7105GK1964630SQ200480008673
公開日2007年5月16日 申請日期2004年2月12日 優先權日2003年2月13日
發明者L·羅塞蒂, S·奧比西 申請人:耶希瓦大學艾伯塔·愛恩斯坦醫學院