含有低劑量hib偶聯物的組合疫苗的制作方法

專利名稱：含有低劑量hib偶聯物的組合疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及組合疫苗領域，具體說是保護性抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(H.influenzae b型，′Hib′)的組合疫苗領域。
背景技術：
已知包含用于免疫以抵御白喉、破傷風、百日咳和Hib的抗原的組合疫苗(′DTP-Hib′疫苗)。可購得三種這樣的疫苗，其商品名是TETRAMUNETM和QUATTVAXEMTM(它們采用細胞百日咳抗原′DTwP-Hib′)和INFANRIX-HibTM(它采用非細胞百日咳抗原′DTaP-Hib′)。
DTaP-Hib疫苗中包含Hib偶聯組分與抗Hib應答的降低相關[1，2]。而且，Hib偶聯物在水性介質中不穩定，不能以這種形式存活很長的貯存時間[3]。因此，在包含Hib偶聯抗原的組合疫苗中，通常將Hib組分制成在遞送時用其它抗原的液體制劑重建的凍干粉末。
Hib-偶聯抗原的生產并不便宜，有擔心其成本將會抑制在發展中國家的廣泛應用，因此開發了使用Hib偶聯物的替代方案[4-6]。擴展其應用的一種方法是給予兩次劑量(如3和5月齡時[5]或4和6月齡時[6])，而非通常的三次劑量(2、4和6月齡時[7])。然而，在不同的方法中，Hib偶聯物一般給予10μg/劑量，采用了較低劑量(一般為分數，如1/2、1/3、1/4等)[4，6]。在參考文獻6中，例如，以5μg/劑量或3.33μg/劑量給予Hib偶聯物。
相同方法已經延伸到DTP-Hib疫苗中的Hib偶聯物。例如，參考文獻8比較了全劑量、半劑量和1/3劑量Hib偶聯物與DTwP疫苗聯用，雖然與分別給予DTP和Hib相比，接受組合型DTP-Hib疫苗的患者體內抗-PRP抗體的幾何平均濃度降低，但在所有病例中都能觀察到可接受的保護性抗Hib免疫應答。參考文獻9通過用10劑量的DTwP藥瓶重建1劑量的Hib，使用10倍稀釋的Hib偶聯物劑量。參考文獻10公開了用TRITANRIXTMDTwP-HBsAg疫苗將凍干Hib偶聯物重建為全劑量、半劑量或1/4劑量。
然而，在這些情況下，Hib-偶聯物是凍干形式，不得不在給藥之前用水性DTP抗原重建。因此，必須用兩個分開的容器提供這些疫苗(水性DTP裝在一個容器中，凍干的Hib裝在另一個容器中)，這種對兩個容器的需求增加了額外成本，也增加了包裝階段、運輸階段、儲存階段和給藥階段的物流需求。由于劑量降低的疫苗旨在降低成本和鼓勵在發展中世界銷售，所以這些額外需求顯然不利。需要重建步驟也意味著存在終端使用者出錯的風險、非標準化給藥的可能性、混合產物污染的風險和需要訓練重建步驟的操作人員。所有這些問題都阻礙其進入預計目標市場，即發展中世界。
因此，仍然需要包含低劑量Hib偶聯抗原而不需要分別包裝該Hib抗原的組合疫苗。

發明內容
本發明提供了包含用于保護對象以至少抵御白喉(′D′)、破傷風(′T′)、百日咳(P′)和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原的組合疫苗，其中(a)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；(b)疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml；和(c)該Hib偶聯物從未被凍干過。已發現與參考文獻6、8和9中觀察到的免疫應答相比，本發明疫苗是安全的，并具有高免疫原性。
本發明也提供了包含用于保護對象以至少抵御白喉(′D′)、破傷風(′T′)、百日咳(P′)和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原的組合疫苗，其中(a)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；(b)疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml；和(c)該疫苗(i)不含氫氧化鋁佐劑和/或(ii)不含硫酸鋁鉀佐劑。相信氫氧化鋁參與了糖偶聯物的降解，因此作為佐劑，該疫苗優選包含磷酸鋁佐劑。當存在鋁佐劑(如磷酸鋁佐劑)時，優選Hib偶聯物不吸附于該佐劑。
本發明也提供裝有可刺穿密封物并含有組合疫苗的藥瓶，所述組合疫苗包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原，其中所述保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物，其中(a)所述疫苗中Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml，(b)藥瓶的可刺穿密封物未被刺穿過。
本發明也提供含有組合疫苗的密封容器，所述組合疫苗包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原，其中所述保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物，所述疫苗中Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml。
本發明也提供包含用于保護對象以至少抵御白喉(′D′)、破傷風(′T′)、百日咳(P′)和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原的組合疫苗的制備方法，其中用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物，疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml，其中(a)該方法包括混合用于保護性抵御D、T、P和Hib的所述抗原的步驟，和(b)該方法(i)不包括凍干Hib偶聯物抗原的步驟，和/或(ii)不包括將白喉、破傷風和百日咳抗原包裝到與Hib偶聯物抗原分開的混合形式中的步驟。
本發明也提供將組合疫苗注入容器的方法，其中(a)該疫苗包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原；(b)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；和(c)疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml。
本發明也提供將標記貼在容器上的方法，其中(a)該容器含有包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原的組合疫苗；(b)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；和(c)疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml。該標記可說明該容器含有疫苗。
本發明也提供將組合疫苗注入容器然后從容器中取出該疫苗的方法，其中(a)該疫苗包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原；(b)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；和(c)疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml。
DTP組分白喉抗原優選為白喉類毒素。已經詳細記載了白喉類毒素的制備[如參考文獻11的第13章]。可采用任何合適的白喉類毒素。白喉類毒素的濃度通常為5-100Lf/ml。優選濃度為10-50Lf/ml。更優選的濃度為20-40Lf/ml。最優選的濃度約為30Lf/ml。或者，優選濃度為5-25Lf/ml，更優選的濃度為10-20Lf/ml，最優選的濃度約為15Lf/ml。然而，當采用無細胞百日咳抗原時，白喉類毒素的優選濃度約為50Lf/ml。
破傷風抗原優選為破傷風類毒素。已經良好地描述了破傷風類毒素的制備[如參考文獻11的第27章]。可采用任何合適的破傷風類毒素。破傷風類毒素的濃度通常為1-50Lf/ml。優選濃度為2-9Lf/ml。更優選的濃度為5-8Lf/ml。最優選的濃度約為6.5Lf/ml。然而，當采用無細胞百日咳抗原時，白喉類毒素的優選濃度約為20Lf/ml。
用于本發明的百日咳抗原可以是細胞(如全細胞)或無細胞的。已經詳細記載了兩種抗原類型的制備[如參見參考文獻11的第21章；也參見參考文獻12]。對于細胞百日咳抗原，百日咳抗原的濃度通常為5-50OU/ml。優選濃度為10-40OU/ml。更優選的濃度為25-35OU/ml。最優選的濃度約為30OU/ml。當采用無細胞抗原時，優選采用百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，更優選與百日咳桿菌黏附素(pertactin)(也稱為PRN或69kDa抗原)混合，任選地與凝集原(也稱為菌毛)2和3混合[13]。每個疫苗劑量(如每0.5ml)的百日咳抗原水平一般為10μg PT、5μg FHA、3μg或5μg PRN，5μg混合的菌毛。PT是有毒蛋白，當存在于百日咳抗原中時，優選脫毒。可通過化學和/或遺傳方法脫毒。優選的脫毒突變體是9K/129G雙突變體[14]。
Hib偶聯物用于本發明疫苗的B型流感嗜血桿菌抗原包含Hib莢膜糖抗原。B型流感嗜血桿菌的糖抗原是熟知的[如參考文獻11的第14章]。將Hib糖偶聯于運載體蛋白以增強其免疫原性，尤其是在兒童中的免疫原性。已經詳細記載了Hib莢膜糖的制備[如參考文獻15-24]。本發明可采用任何合適的Hib偶聯物。上面描述了合適的運載體蛋白，Hib糖的優選運載體是CRM197(′HbOC′)、破傷風類毒素(′PRP-T′)與腦膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)的外膜復合物(′PRP-OMP′)。
該偶聯物的糖部分可以是多糖(如全長聚核糖基核糖醇磷酸(PRP))，但優選采用寡糖(如MW約為1-5kDa)。它們可通過片段化純化PRP(如通過水解)、然后通常純化所需大小的片段而方便地形成。當本發明組合物包含偶聯的寡糖時，寡糖制備應該在偶聯之前。
用于共價偶聯的優選運載體蛋白是細菌毒素或類毒素，如白喉類毒素或破傷風類毒素。尤其優選CRM197白喉毒素突變體[25-27]。其它合適的運載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[28]、合成肽[29，30]、熱激蛋白[31，32]、百日咳蛋白[33，34]、細胞因子[35]、淋巴因子[35]、激素[35]、生長因子[35]、包含來自各種病原體衍生抗原的多個人CD4+T細胞表位的人造蛋白[36]、流感嗜血桿菌的蛋白D[37，38]、肺炎球菌表面蛋白PspA[39]、攝鐵蛋白[40]、艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[41]等。優選運載體是白喉類毒素、破傷風類毒素和CRM197。
可采用糖∶蛋白比(w/w)為1∶5(即蛋白過量)-5∶1(即糖過量)，如1∶2-5∶1和1∶1.25-1∶2.5的偶聯物。
偶聯物可與游離的運載體蛋白聯用[42]。當本發明組合物中給定運載體蛋白既有游離形式又有偶聯形式時，全部組合物中未偶聯形式優選不多于運載體蛋白總量的5％，更優選小于2重量％。
可采用任何合適的偶聯反應，需要時采用任何合適接頭。
一般在偶聯之前將糖活化或官能化。活化可包括例如，氰化試劑如CDAP(如1-氰基-4-(二甲基氨基)-四氟硼酸吡啶[43，44等])。其它合適技術采用碳二亞胺、酰肼、活化酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU；也參見參考文獻22的引言)。
可用任何已知方法，例如參考文獻45和46所述方法通過接頭基團連接。一種連接類型包括多糖的還原性胺化，將得到的氨基與己二酸接頭基團的一端偶聯，然后將蛋白質偶聯于己二酸接頭基團的另一端[20、47、48]。其它接頭包括B-丙酰胺基[49]、硝基苯基-乙基胺[50]、鹵代酰基鹵化物[51]、糖苷鍵[52]、6-氨基己酸[53]、ADH[54]、C4-C12基團[55]等。作為采用接頭的替代方式，可采用直接連接。與蛋白質直接連接可包括氧化多糖，然后用蛋白質還原性胺化，例如參考文獻56和57所述。
一種方法包括將氨基引入糖(如通過用-NH2取代末端＝O基團)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯)衍生化，優選與運載體蛋白反應。另一優選反應采用CDAP活化和蛋白D運載體。
偶聯后，可分離游離糖和偶聯糖。有許多合適方法可用于此分離，包括疏水層析、切線式超濾，透析等。[也參見參考文獻58和59等]。如果疫苗包含游離形式和偶聯形式的給定糖，全部組合物中未偶聯形式優選不多于該糖總量的20重量％(如≤15％、≤10％、≤5％、≤2％、≤1％)。
優選偶聯物包含通過己二酸接頭共價偶聯于CRM197的Hib寡糖[60，61]。破傷風類毒素也是優選的運載體。
給予Hib抗原優選使抗-PRP抗體濃度≥0.15μg/ml，更優選≥1μg/ml。這些是標準的可接受應答閾值。
本發明疫苗中Hib偶聯物的濃度為＜15μg/ml，如≤14μg/ml、≤12μg/ml、≤10μg/ml、≤7.5μg/ml、≤5μg/ml、≤4μg/ml、≤3μg/ml、≤2μg/ml、≤1μg/ml等。當運載體蛋白不是OMPC時，可能采用稍高的劑量，如＜20μg/ml、≤19μg/ml、≤18μg/ml、≤17μg/ml、≤16μg/ml等。然而，本發明疫苗中Hib偶聯物的濃度通常為至少0.1μg/ml，如≥0.2μg/ml、≥0.3μg/ml、≥0.4μg/ml、≥0.5μg/ml、≥0.6μg/ml、≥0.7μg/ml、≥0.8μg/ml、≥0.9μg/ml、≥1.0μg/ml、≥1.25μg/ml、≥1.5μg/ml、≥2.0μg/ml、≥3.5μg/ml等。因此，所述疫苗中Hib偶聯物濃度的優選范圍是d1-d2μg/ml，其中(i)d1＜d2；(ii)d1選自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.5和4.0；和(iii)d2選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
在說明書和權利要求書中根據糖量定義Hib偶聯物的濃度(即作為整體的偶聯物(運載體+糖)劑量高于所述劑量)，以避免由于運載體的選擇而引起的變化。
本發明組合物中Hib偶聯物抗原不是凍干的并且從未被凍干過。
佐劑相信氫氧化鋁參與Hib糖偶聯物的降解[62]，因此疫苗優選包含磷酸鋁佐劑作為佐劑。
當存在磷酸鋁佐劑時，與參考文獻63相反，Hib偶聯物優選不吸附于該佐劑。可通過選擇生產期間的正確混合順序，通過選擇抗原/佐劑混合期間的合適pH，和/或通過選擇具有合適零電點(PZC)的佐劑[64]來實現不吸附(見下)。
當存在磷酸鋁時，白喉類毒素一般吸附在磷酸鋁上。吸附優選為部分吸附，如組合物中全部白喉類毒素的大約30-80重量％是吸附的(如約40％-70％、約50％-60％等)。當儲存于約37℃時，白喉類毒素的吸附隨時間增加。破傷風類毒素一般吸附在磷酸鋁上。吸附優選為部分吸附，如組合物中全部破傷風類毒素的不多于40重量％是吸附的(如不多于30％、不多于20％、不多于10％等)。破傷風類毒素吸附水平可以約為0％。Hib-偶聯物仍然不吸附于鋁佐劑。組合物中優選不多于15重量％的Hib-偶聯物應吸附于磷酸鋁(如至多10％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％)。
本文所用術語″磷酸鋁″包括磷酸鋁、羥基磷酸鋁和羥基磷酸硫酸鋁。用于本發明的磷酸鋁優選形式是羥基磷酸鹽。
磷酸鋁的PO4/Al3+摩爾比通常為0.3-1.2，優選0.8-1.2，更優選0.95±0.1。佐劑一般為無定形羥基磷酸鋁，其中PO4/Al摩爾比為0.84-0.92，包括0.6mgAl3+/ml。磷酸鋁通常是無定形的，尤其是羥基磷酸鹽。磷酸鋁通常是顆粒。抗原吸附后其顆粒的直徑一般為0.5-20μm(如約5-10μm)。
磷酸鋁的PZC與用磷酸根取代羥基的程度成反比，這種取代程度可隨著用于通過沉淀制備鹽的反應條件和反應物濃度而改變。也可通過改變溶液中游離磷酸根離子的濃度來改變PZC(更多磷酸根＝更酸性的PZC)，或通過加入緩沖液如組氨酸緩沖液(使PZC的堿性更強)。用于本發明的磷酸鋁的PZC通常為5.0-7.0，更優選5.5-6.0，如約5.7。
優選以加入抗原的水性溶液形式使用磷酸鋁(注一般將磷酸鋁水溶液稱為″溶液″，但是從嚴格的物理化學觀點來看，該鹽不可溶，形成的是懸液)。優選將磷酸鋁稀釋到所需濃度，以保證在加入抗原組分之前是均一溶液。
在加入抗原之前Al3+的濃度通常為0-10mg/ml。優選濃度為2-6mg/ml。更優選的濃度為4-5mg/ml，如4.4mg/ml(對應的磷酸鋁濃度是20mg/ml)。本發明疫苗中Al3+的最終濃度通常為0.1-2.0mg/ml。優選濃度為0.2-1.5mg/ml。更優選的濃度為0.3-1.0mg/ml。最優選的濃度約為0.6mg/ml。
用于制備本發明疫苗的磷酸鋁溶液可(但不必須)含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸緩沖液)。磷酸鋁溶液優選無菌和無熱原。磷酸鋁溶液可包含游離的水性磷酸根離子，如濃度為1.0-20mM，優選為5-15mM，更優選約為10mM。磷酸鋁溶液也可包含氯化鈉。氯化鈉濃度優選為0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml，1-20mg/ml，2-10mg/ml)，更優選約為3±1mg/ml。存在NaCl有助于在吸附于抗原之前正確測定pH。
雖然通常可以采用鋁鹽作為單獨的佐劑，但本發明疫苗可包含的其它佐劑包括但不限于A.含礦物質的組合物含礦物質的組合物適合用作本發明佐劑，包括無機鹽，如鋁鹽和鈣鹽。發明包括無機鹽如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如羥磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如參見參考文獻65的第8和9章]或不同無機化合物的混合物，化合物采用任何合適的形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優選吸收。含礦物質的組合物可制成金屬鹽的顆粒[66]。
本發明疫苗組合物優選基本上不含氫氧化鋁(如羥基氧化鋁)。組合物中氫氧化鋁的濃度通常小于100μg/ml，優選小于50μg/ml，更優選小于10μg/ml，最優選小于1μg/ml。具體說，Hib-偶聯物抗原優選不吸附在氫氧化鋁上。
可采用磷酸鈣佐劑。
B.油乳劑適合用作本發明佐劑的油乳劑組合物包括鯊烯-水乳劑，如MF59[參考文獻65的第10章；也參見參考文獻67](5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％Span 85，用微流化機制成亞微米顆粒)。也可使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。
C.皂苷制劑[參考文獻65的第22章]皂苷制劑也能用作發明的佐劑。皂苷是甾醇糖苷和三萜糖苷的異種組，在廣范圍的植物種類的樹皮、葉、莖干、根和甚至花中發現。來自皂樹(Quillaiasaponaria)Molina樹皮的皂苷作為佐劑已廣泛研究。皂苷也能商業獲得自麗花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質制劑如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
皂苷組合物用HPLC和RP-HPLC純化。已鑒定出使用這些技術特別純化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優選是QS21。生成QS21的方法示于參考文獻42。皂苷制劑也可包括甾醇，如膽固醇[69]。
皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復合體(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻65的第23章]。ISCOM通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用于ISCOM。ISCOM優選包括1種或多種QuilA、QHA和QHC。ISCOM進一步描述于參考文獻69-71。ISCOM任選可不含另外的去垢劑[72]。
開發以皂苷為基礎的佐劑的綜述可見參考文獻73和74。
D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作發明的佐劑。這些結構一般包含1種或多種來自病毒的蛋白，病毒任選結合磷脂或用磷脂配制。它們通常不致病、不復制且一般不包含任何天然病毒基因組。病毒蛋白可重組生成或從全病毒中分離。這些適用于病毒體或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(如HA或NA)、乙肝病毒(如核心或衣殼蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉錄病毒、諾沃克病毒、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Qβ-噬菌體(如外被蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(如反轉錄轉座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP進一步討論于參考文獻75-80。病毒體進一步討論于例如參考文獻81。
E.細菌或微生物衍生物適合用于發明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，如腸細菌脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂質A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括單磷酰脂質A(MPL)和3-O-脫酰MPL(3d MPL)。3d MPL是3-O-脫酰單磷酰脂質A與4、5或6條酰化鏈的混合物。3-O-脫酰單磷酰脂質A的優選“小顆粒”形式示于參考文獻82。這種“小顆粒”3d MPL小到足以經0.22μm膜無菌過濾[82]。其它非毒性LPS衍生物包括單磷酰脂質A模擬物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529[83，84]。
脂質A衍生物包括來自大腸桿菌的脂質A衍生物，如OM-174。OM-174描述于例如參考文獻85和86。
適合用作發明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(二核苷酸序列，含通過磷酸鍵連接鳥苷的未甲基化胞嘧啶)的核苷酸序列。含回文或聚(dG)序列的雙鏈RNAs和寡核苷酸也顯示是免疫刺激性的。
CpG可包括核苷酸修飾/類似物如硫代磷酸修飾且可以是雙鏈或單鏈。參考文獻87、88和89揭示可能的類似物取代，如用2’-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。CpG寡核苷酸的佐劑效果進一步討論于參考文獻90-95。
CpG序列可指向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[96]。CpG序列可對誘導Th1免疫反應特異，如CpG-A ODN，或它可對誘導B細胞反應更特異，如CpG-BODN。CpG-A和CpG-B ODN討論于參考文獻97-99。CpG優選是CpG-A ODN。
優選構建CpG寡核苷酸，使5’末端易接受受體識別。2種CpG寡核苷酸序列可任選在其3’末端附著以形成“免疫聚體”(immunomers)。參見例如參考文獻96和100-102。
細菌ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物可用作發明的佐劑。蛋白優選獲得自大腸桿菌(大腸桿菌熱不穩定性腸毒素“LT”)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。使用去毒ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑描述于參考文獻103且用作腸胃外佐劑描述于參考文獻104。毒素或類毒素優選以全毒素形式，包括A和B亞基。A亞基優選包含去毒突變；B亞基優選不突變。佐劑優選是去毒LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。使用ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72作為佐劑可見參考文獻105-112。關于氨基酸取代的數字參考優選基于參考文獻113所列ADP-核糖基化毒素的A和B亞基排列，參考文獻113特別全部納入本文供參考。
F.人免疫調節劑適合用作發明佐劑的人免疫調節劑包括細胞因子如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[114]等)[115]、干擾素(例如干擾素-γ)、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。
G.生物粘合劑和粘膜粘合劑生物粘合劑和粘膜粘合劑也可用作發明的佐劑。合適的生物粘合劑包括酯化透明質酸微球體[116]或粘膜粘合劑如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯衍生物。殼聚糖和其衍生物也可用作發明的佐劑[117]。
H.微粒微粒也可用作發明的佐劑。優選從可生物降解和無毒性物質(如聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚已酸內酯等)材料形成的顆粒(即～100nm到～150nm直徑的顆粒，更優選～200nm到～30μm直徑，最優選～500nm到～10μm直徑)，優選具有聚交酯聚乙交酯共聚物，任選處理的以具有帶負電的表面(例如用SDS)或帶正電的表面(例如用陽離子去垢劑，如CTAB)。
I.脂質體(參考文獻65的第13和14章)適合用作佐劑的脂質體制劑的例子描述于參考文獻118-120。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適用于發明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[121]。這種制劑進一步包括組合辛苯昔醇的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑[122]以及組合至少1種另外非離子表面活性劑如辛苯昔醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑[123]。優選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑描述于例如參考文獻124和125。
L.胞壁酰肽適合用作發明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
M.咪唑喹諾酮(imidazoquinolone)化合物適合用作發明佐劑的咪唑酮化合物的例子包括咪喹莫特和其同源物(例如“瑞喹莫德3M”)，它們進一步描述于參考文獻126和127。
發明也可包括1種或多種上面鑒定的佐劑的組合。例如，下列佐劑組合物能用于發明(1)皂苷和水包油乳劑[128]；(2)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)[129]；(3)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+甾醇)[130]；(5)3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑的組合[131]；(6)SAF，含10％鯊烯、0.4％吐溫80TM、5％普朗尼克(Pluronic)-嵌段共聚物L121和thr-MDP，微流化成亞微米乳劑或渦旋產生較大粒度乳劑；(7)RibiTM佐劑體系(RAS)(Ribi Immunochem)，含2％鯊烯、0.2％吐溫80和1種或多種來自單磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和細胞壁骨架(CWS)的細菌細胞壁成分，優選MPL+CWS(DetoxTM)；(8)1種或多種無機鹽(如鋁鹽)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)。
其它用作免疫刺激劑的物質示于參考文獻65的第7章。
其它抗原本發明組合物包含D、T、P和Hib抗原。它們也可包含其它抗原，如-腦膜炎奈瑟球菌血清組A、C、W135和/或Y的糖抗原，如參考文獻132中公開的血清組C的寡糖，或參考文獻133的寡糖。該疫苗優選含有血清組A、C、W135和Y的2、3或4的偶聯物。
-肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[如參考文獻134-136]。
-甲肝病毒抗原，如滅活病毒[如137，138]。
-乙肝病毒抗原，如表面抗原和/或核心抗原[如138，139]。
-從腦膜炎奈瑟球菌血清組B制備的外膜囊泡(OMV)或皰(bleb)，如參考文獻140、141、142、143等所述。
-腦膜炎奈瑟球菌血清組B的蛋白抗原，如參考文獻144-150所述，尤其優選蛋白′287′(見下)和衍生物(如′ΔG287′)。
-脊髓灰質炎抗原[如151，152]，如IPV。
組合物可包含這些其它抗原中的一種或多種。各抗原的濃度一般是至少1μg/ml。通常，任何給定抗原的濃度都足以引發對抗該抗原的免疫應答。優選通過組合并不去除單個糖抗原的保護效力，但實際上可能降低免疫原性(如ELISA滴度)。
當采用糖抗原時，優選將其偶聯于運載體蛋白以增強免疫原性。
作為在本發明組合物中采用蛋白質抗原的替代方式，可采用編碼該抗原的核酸[如參考文獻153-161]。因此，本發明組合物的蛋白組分可被編碼該蛋白的核酸取代(優選DNA如質粒形式的DNA)。類似地，本發明組合物可包含模擬糖抗原的蛋白如模擬表位[162]或抗-獨特型抗體。它們可取代單獨的糖組分，或可補充糖組分。例如，疫苗可包含MenC[163]或MenA[164]莢膜多糖的肽模擬物以取代糖本身。
當本發明疫苗包括乙肝表面抗原(′HBsAg′)時，可用兩種方式制備此抗原。第一種方法包括從慢性乙肝載體的血漿中純化顆粒形式的抗原，因為在HBV感染期間大量HbsAg在肝中合成并釋放到血流中。第二種方式是優選方式，它包括通過重組DNA方法表達蛋白。優選通過釀酒酵母表達來制備HBsAg。可將HbsAg基因注入質粒中，可用啟動子如′GAPDH′啟動子(來自甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)控制質粒中HbsAg基因的表達。可在合成培養基中培養該酵母。然后，可采用包括以下步驟的方法純化HbsAg例如沉淀、離子交換層析和超濾。純化后，可對HbsAg進行透析(如用半胱氨酸)。可使用顆粒形式的HBsAg。
當本發明疫苗包括脊髓灰質炎抗原時，優選采用三種脊髓灰質炎病毒抗原-1型脊髓灰質炎病毒(如Mahoney毒株)、2型脊髓灰質炎病毒(如MEF-1毒株)和3型脊髓灰質炎病毒(如Saukett毒株)。可在細胞培養物中培養脊髓灰質炎病毒。優選的培養物采用VERO細胞系，該細胞系是衍生自猴腎的連續細胞系。可方便地培養VERO細胞作為微運載體。在病毒感染前和感染期間VERO細胞培養物可包括采用來自牛的材料，如小牛血清，該材料應該獲自未患牛海綿狀腦炎(BSE)的來源。培養物也可包括諸如乳清蛋白水解產物等材料。培養后，可用諸如超濾、透析和層析等技術純化病毒粒子。在給予患者之前，必須滅活病毒，可通過甲醛處理達到這個目的。優選單獨地培養、純化和滅活病毒，然后混合它們以產生大量混合物，用于加入吸附的白喉和破傷風抗原中。
本發明疫苗中的抗原應該以“免疫有效量”存在，即以單劑量或一系列劑量的一部分給予個體該量能有效治療或預防疾病。該量依待治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類組(如人、靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需保護的程度、疫苗的制劑、主治醫生對醫學狀況的評價和其它相關因素而不同。預計該量屬于由常規試驗確定的相對寬的范圍。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括加強劑量)。
本發明疫苗的非免疫組分除了上述抗原和佐劑組分以外，本發明疫苗一般包含一種或多種′藥學上可接受的運載體′，包括本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何運載體。合適的運載體一般是大且代謝慢的大分子如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[165]、海藻糖[166]、乳糖和脂質聚集體(如油珠或脂質體)。本領域普通技術人員熟知這些運載體。疫苗也可含有稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外，也可存在輔助物質，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質等。無菌無熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水是典型的運載體。對藥學上可接受的賦形劑的充分討論參見參考文獻167。
本發明組合物是水性形式即溶液或懸液。這種類型的液體制劑可以使組合物直接以其包裝形式給藥而無需用水性介質重建，因此這種液體制劑是理想的注射劑。可將組合物裝在藥瓶中，或者可裝在預先充滿的注射器中。注射器可裝有或不裝針頭。注射器將包含單劑量的組合物，而藥瓶可包含單劑量或多劑量。
本發明液體疫苗也適合用于重建凍干形式的其它疫苗。當準備以此種臨用前重建的形式應用疫苗時，本發明提供了一種藥盒，該藥盒可包括兩個藥瓶，或可包括一個預先充滿的注射器和一個藥瓶，在注射前用注射器內容物活化藥瓶內容物。
可將本發明疫苗包裝成單劑形式或多劑形式。對于多劑形式，藥瓶比預先充滿的注射器更優選。可常規地建立有效劑量體積，但注射組合物的人用劑量的體積一般為0.5ml。
本發明疫苗的pH通常為6.0-8.0，更優選6.3-6.9如6.6±0.2。優選在此pH下緩沖疫苗。可用緩沖液維持穩定的pH。如果組合物包含氫氧化鋁鹽，優選采用組氨酸緩沖液[168]。該組合物可以是無菌和/或無熱原的。磷酸鋁和全細胞百日咳抗原不適合過濾除菌，因此當本發明組合物包含這些成分之一時，優選用高壓蒸氣法對本發明組合物滅菌和/或采用生產中無菌的組分。
本發明組合物可與人體等滲。
本發明疫苗可包含抗微生物劑，特別是包裝在多劑形式中時。許多抗微生物劑是基于汞的(如硫柳汞)，但優選避免采用含汞防腐劑，如可采用2-苯氧基乙醇。防腐劑優選以低水平(如0.01體積％)存在。防腐劑可以是外源性加入的和/或可以是混合形成該組合物的大量抗原的組分(如存在的百日咳抗原作為防腐劑)。
本發明疫苗可包含去污劑如吐溫(聚山梨酸酯)，如吐溫80。去污劑通常以低水平存在，如＜0.01％。
本發明疫苗可包含鈉鹽(如氯化鈉)，以產生張力。該組合物可包含氯化鈉。該組合物中氯化鈉的濃度優選0.1-100mg/ml(如1-50mg/ml、2-20mg/ml、5-15mg/ml)，更優選10±2mg/ml NaCl如約9mg/ml。
本發明疫苗通常包含緩沖液。一般是磷酸鹽或組氨酸緩沖液。
本發明疫苗的溶液中可包含游離的磷酸根離子(如通過采用磷酸鹽緩沖液)，以幫助抗原不吸附。本發明組合物中游離磷酸根離子的濃度通常為0.1-10.0mM，優選為1-5mM，更優選約2.5mM。
包裝本發明疫苗本發明疫苗可包裝到多種類型的容器中，如藥瓶、注射器等。
對于需要重建凍干Hib組分的現有DTP-Hib疫苗，將DTP抗原水溶液從第一個密封藥瓶中吸入注射器，然后注入含有凍干物質的第二個密封藥瓶中。然后將重建的疫苗吸入同一注射器中，給予患者。相反，本發明疫苗中的Hib偶聯物在水溶液中穩定，不需要凍干。因此，本發明能夠提供裝有可刺穿密封物并含有DTP-Hib疫苗的藥瓶，其中可刺穿封口未被刺穿過。類似地，本發明能夠提供含有本發明疫苗的密封容器。需要重建凍干Hib組分的現有DTP-Hib疫苗必須包裝到兩個獨立容器中。相反，本發明可以提供將已經包含DTP-Hib抗原的形式的本發明疫苗注入容器的方法。注入優選不通過容器中的密封物。
類似地，在制造過程中對疫苗包裝進行標記，然后當它們是分開的DTP和Hib形式時標記現有疫苗DTP-Hib，而本發明可標記最終DTP-Hib形式的疫苗。
而且，將現有重建的DTP-Hib疫苗以DTP-Hib形式從其容器中抽出，但它們不是以這種形式注入容器的。然而，根據本發明，這種DTP-Hib疫苗可以混合的DTP-Hib形式注入和抽出。注入和抽出之間的時間可以至少為n周，其中n選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多。抽出通常要通過針頭(如無菌遞送裝置如注射器的針頭)，但注入容器中通常是在生產線上而非遞送裝置中進行。
制備本發明疫苗本發明疫苗含有至少DTP-Hib抗原，因此，它們的制備包括混合這四種抗原。不像現有重建的DTP-Hib疫苗的制備那樣，本發明可提供不包括凍干Hib偶聯物的步驟的制備方法。類似地，本發明能夠提供不包括將混合的DTP抗原與Hib抗原分開包裝的步驟的制備方法。
在制備期間，加入的抗原通常未吸附在鋁鹽上(即它們不是‘預吸附的’)。因此，對于加入的各個抗原來說，優選不多于5重量％(優選為0)已經吸附于鋁鹽(如至多4％、至多3％或至多2％)。然而，在一些情況下，可加入預吸附的抗原。
制備大量本發明疫苗的方法一般是將Hib組分加入D、T和P組分的混合物中即在加入Hib組分之前混合DTP組分。此混合順序可在使得加入Hib組分之前調節組合物的離子強度和/或pH(如pH＜7)，以防止吸附于可能存在的任何鋁佐劑。
優選在15℃-30℃(如19℃-27℃，或23±4℃)制備本發明疫苗。
給予本發明疫苗本發明提供了在哺乳動物中產生抗體應答的方法，該方法包括將本發明疫苗給予該哺乳動物。給予疫苗可以是預防性目的(即預防感染)或治療性目的(即治療感染后的疾病)。本發明提供了在哺乳動物中產生免疫應答的方法，該方法包括給予有效量的本發明疫苗的步驟。該免疫應答優選為保護性，優選涉及抗體。該方法可產生加強應答。
該哺乳動物優選為人。當該疫苗用于預防性目的時，人優選為兒童(如幼兒或嬰兒)或青少年；當該疫苗用于治療性目的時，人優選為成人。用于兒童的疫苗也可給予成人，(例如)以評價安全性、劑量、免疫原性等。
本發明也提供用作藥物的本發明組合物。該藥物優選能夠在哺乳動物中產生免疫應答(即它是免疫原性組合物)，更優選為疫苗。
本發明也提供至少白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)抗原在生產用于免疫患者的組合疫苗中的應用，其中(a)保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；(b)疫苗中Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml；(c)生產不包括凍干Hib偶聯物。
這些應用和方法優選用于預防和/或治療白喉桿菌(C.diphtheriae)、破傷風桿菌(C.tetani)、百日咳桿菌(B.pertussis)和流感嗜血桿菌的感染和由這些感染引起的疾病，如預防白喉、破傷風、百日咳、細菌性腦膜炎等。
檢測治療性治療效果的一種方式包括在給予本發明組合物后監測細菌感染。檢測預防性治療效果的一種方式包括在給予該組合物后監測對抗原的免疫應答。可通過將本發明組合物給予受試對象(如12-16月齡的兒童，或動物模型[169])，然后測定標準免疫學參數來測定它們的免疫原性。通常在給予組合物約4周后測定這些免疫應答，并與給予組合物之前測定的值作比較。除了評價在患者、標準動物和體外模型中的實際保護效果，評價Hib和DTP疫苗效果的保護相關性也是熟知的。
通常將本發明組合物直接給予患者。可通過胃腸道外注射(如皮下、腹膜內、靜脈內、肌肉內或給予組織間隙)，或通過直腸、口腔、陰道、局部、透皮、鼻內、眼內、耳內、肺部或其它粘膜給藥完成直接遞送。優選肌肉內給予股或上肢。可通過針頭(如皮下注射器針頭)進行注射，但也可采用無針注射。肌肉內劑量一般是0.5ml。可用本發明引發全身性免疫和/或粘膜免疫。
劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初次免疫方案和/或加強免疫方案。初次劑量方案后，可進行加強劑量方案。可常規地測定初敏劑量之間的合適時間(如4-16周)以及初敏和加強免疫之間的合適時間。
細菌感染會影響身體的各個區域，因此本發明組合物可制備成各種形式。例如，該組合物可制備成液體溶液或懸液的可注射劑。可將該組合物制備成用于以細粉或噴霧肺部給藥的(如)吸入劑。可將該組合物制備成栓劑或陰道栓劑。可將該組合物制備成用于鼻內、耳內或眼內給藥的(如)噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉末劑[如參考文獻170和171]。已經報道了成功的Hib多糖[172]和DTP疫苗[173，174]的鼻內給藥。
概要術語“含有”包括“包含”以及“由...組成”，例如“含有”X的組合物可僅由X組成或可包含其它的物質，例如X+Y。
與數值x相關的術語“約”表示，例如x±10％。
術語“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的組合物可完全不含Y。“基本上”可視需要從本發明定義中省去。
附圖簡要說明

圖1顯示抗-PRP GMT和疫苗組A、B、C和D的95％置信區間。
實施本發明的方式制備了四種DTwP-Hib疫苗制劑，其不同之處僅在于Hib-CRM197偶聯物的劑量。疫苗制備成0.5ml劑量，其抗原組成如下

主要生產方法如下從wfi開始；加入磷酸鋁佐劑；加入D組分；加入T組分；加入wP組分；加入NaCl；檢測和調節pH；加入Hib組分。與參考文獻175所述相反，Hib組分不吸附于佐劑。
穩定性進行了兩項穩定性研究一項是在2-8℃的正常貯存條件下貯存2年，另一項是在37℃的加速條件下貯存14天。豎直或倒轉位置保貯存后測定疫苗。通過測定pH和游離糖評價穩定性。
第一項研究的結果如下

加速穩定性研究的結果如下

因此，該疫苗在延長時間內穩定。以相同的時間量程測定吸附性，Hib偶聯物在貯存期間保持不吸附。
臨床測試共征集了261名嬰兒，在雙盲試驗中隨機分組接受四種疫苗之一，以評價安全性和免疫原性(參考參考文獻6、8和9中的研究，它們是部分盲法或開放式試驗)。征集妊娠37周以上出生、出生體重至少2500g并適合局部EPI的三月齡嬰兒，以66∶65∶65∶65 A∶B∶C∶D比例隨機分組，在3、4和5月齡接受三次單獨的肌肉內給藥，給予以上疫苗之一。根據局部EPI，對象在2、4和6月齡平行接受口服脊髓灰質炎疫苗(OPV)。
征集時的平均年齡為94(范圍69-108)天，4個疫苗組在性別、種族、體重和身高分布上沒有差異。按月隨訪患者的注射后反應和副反應。安全性分析中共包括260名對象(四個疫苗組各自65名)，免疫原性分析中包括251名對象(組A 61名，組B和C各64名，組D 62名)。9名對象沒有完成該研究，因為他們的父母/法定監護人在研究完成之前收回了他們的同意(組A 5名對象，組B 1名對象，組D 3名對象)。
在基線和第三次給藥一個月后獲得血樣。測定抗-PRP、抗-百日咳、抗-白喉和抗-破傷風抗體。用由FDA ELISA法修飾而來的ELISA測定IgG抗-PRP抗體[176]。用ELISA定量IgG抗-白喉毒素抗體和IgG抗-破傷風毒素抗體。還用ELISA測定百日咳桿菌的血清學標記(抗-百日咳桿菌黏附素和抗-凝集原2-3)。
安全性和免疫原性在每次疫苗給藥30分鐘后，由研究人員監測對象。要求父母在每次注射后7天在日記上記錄每天的直腸溫度以及局部和全身反應。此外，研究人員在每次疫苗接種后第二天和第七天主動電話聯系父母/法定監護人，以獲得副作用的詳細情況。在整個研究期間嚴格檢查和記錄副作用的出現，或嚴重副作用和需要醫生訪問的情況和/或任何醫學情況。安全性分析中包括接受至少一次疫苗接種的對象。
大部分局部和全身反應是輕微和暫時的。最常見的是局部反應引起的壓痛、紅斑和硬結，以及全身反應引起的煩躁、嗜睡和非正常啼哭

在這4個疫苗組中沒有觀察到顯著性差異，解決了所有疫苗接種后反應，沒有后遺癥。未報道與研究疫苗相關的嚴重副作用。
免疫原性抗-PRP血清轉化率(％血清轉化患者)如下

通過查看(a)抗百日咳桿菌黏附素和抗-凝集原2-3應答的增加和(b)GMT評價抗-百日咳血清轉化率。結果(％患者)如下

抗-白喉和抗-破傷風GMT如下

因此，在四個疫苗組中抗PRP滴度≥0.15μg/mL的對象比例相似，但組C和D的抗PRP滴度≥1.0μg/mL的對象比例(分別為97％和95％)高于組A和B(分別為90％和88％)。抗-PRP GMT顯示出明顯的劑量依賴效應，組A(6.94μg/ml)和B(7.82μg/ml)相似，組C(17μg/mL)和D(18μg/mL)相似，但與C和D組相比，組A和B顯著較低(圖1)。
第三次接種疫苗1個月后，這四個疫苗組各組中的所有對象血清轉化為針對白喉和破傷風(抗體水平≥0.1IU/mL)。在這四個疫苗組中沒有檢測到GMT差異。
在這四個疫苗組中，沒有觀察到與基線相比抗百日咳桿菌黏附素和抗凝集原2-3抗體增加2倍或4倍的對象分數的差異。在這四個疫苗組中GMT也相似。
結論分劑量為5、2.5或1.25μg Hib-偶聯物/劑量的DTwPHib疫苗制劑與參比10μg劑量的免疫原性相同，血清轉化率也是如此。用10μg或5μg偶聯物的制劑引發了高水平和相同水平的抗PRP GMT。雖然2.5μg和1.25μg偶聯物/劑量的制劑引發的抗-PRP GMT水平較低，但它們也有足夠的免疫原性。
因此，本研究證實了在含有DTP疫苗的合適劑型中Hib抗原量可降低到低至1.25μg/劑量，而不會影響其它疫苗組分的保護效果。
DTP-Hib疫苗的所有四種劑型都是安全的，并且所有疫苗組分都有免疫原性。就抗PRP血清保護速率而言，這四種劑型的免疫原性對于短期(滴度≥0.15μg/mL)和長期(滴度≥1μg/mL)來說都是相當的。含有5μg偶聯物的劑型與含有10μg的參比劑型的免疫原性相同，這兩種劑型引起的抗PRP GMT特別高(17和18μg/mL)。與采用分劑量Hib疫苗的其它研究中觀察到的免疫應答相比，含有1.25和2.5μg偶聯物的劑型具有高免疫原性[6，8，9]。
其它信息可參見參考文獻177。
應理解，僅以舉例的方式描述了本發明，可在保持在本發明范圍和精神內的情況下進行修改。
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權利要求
1.一種用于保護對象以至少抵御白喉(′D′)、破傷風(′T′)、百日咳(′P′)和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原的組合疫苗，其中(a)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；(b)所述疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml；和(c)所述Hib偶聯物從未被凍干過。
2.一種裝有可刺穿密封物并含有組合疫苗的藥瓶，所述組合疫苗包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原，其中所述保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物，其中(a)所述疫苗中Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml，(b)藥瓶的可刺穿密封物未被刺穿過。
3.一種含有組合疫苗的密封容器，所述組合疫苗包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原，其中所述保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物，所述疫苗中Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml。
4.一種包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原的組合疫苗的制備方法，其中用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物，所述疫苗中Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml，其特征在于該方法不包括以下步驟的一個或兩個(a)凍干Hib偶聯物抗原的步驟，(b)將白喉、破傷風和百日咳抗原包裝到與Hib偶聯物抗原分開的混合形式中的步驟。
5.一種將組合疫苗注入容器的方法，其中(a)所述疫苗包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原；(b)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；和(c)所述疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml。
6.一種將標記貼在容器上的方法，其中(a)所述容器含有包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原的組合疫苗；(b)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；和(c)疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml。
7.一種將組合疫苗注入容器然后從容器中取出該疫苗的方法，其中(a)所述疫苗包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原；(b)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；和(c)疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml。
8.一種用于保護對象以至少抵御白喉(′D′)、破傷風(′T′)、百日咳(′P′)和B型流感嗜血桿菌(′Hib′)的抗原的組合疫苗，其中(a)用于保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖的偶聯物；(b)所述疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml；和(c)所述疫苗(i)不含氫氧化鋁佐劑和/或(ii)不含硫酸鋁鉀佐劑。
9.如權利要求8所述的疫苗，其包含磷酸鋁佐劑。
10.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述Hib偶聯物不吸附于所述磷酸鋁佐劑。
11.如之前任一項權利要求所述的疫苗、藥瓶、容器或方法，其特征在于，所述白喉抗原包含白喉類毒素，所述破傷風抗原包含破傷風類毒素，所述百日咳抗原包含細胞百日咳組分。
12.如之前任一項權利要求所述的疫苗、藥瓶、容器或方法，其特征在于，所述偶聯物包含CRM197運載體、破傷風類毒素運載體或腦膜炎奈瑟球菌運載體的外膜復合物。
13.如之前任一項權利要求所述的疫苗、藥瓶、容器或方法，其特征在于，所述偶聯物包含Hib聚核糖基核糖醇磷酸的寡糖片段。
14.如之前任一項權利要求所述的疫苗、藥瓶、容器或方法，其特征在于，所述組合疫苗還包含乙肝病毒的表面抗原。
15.如之前任一項權利要求所述的疫苗、藥瓶、容器或方法，其特征在于，所述組合疫苗還包含脊髓灰質炎抗原。
16.一種在哺乳動物中產生抗體應答的方法，該方法包括將之前任一項權利要求所述的疫苗給予哺乳動物。
全文摘要
已知包含用于免疫以抵御白喉、破傷風、百日咳和Hib的抗原的組合疫苗(′DTP－Hib′疫苗)。本發明解決了本領域對含有低劑量Hib抗原以降低成本而且不需要重建的疫苗的需要。因此，本發明提供了包含用于保護對象以至少抵御白喉、破傷風、百日咳和Hib的抗原的組合疫苗，其中(a)保護性抵御Hib的抗原是Hib莢膜糖偶聯物；(b)所述疫苗中該Hib偶聯物的濃度＜15μg/ml；和(c)該Hib偶聯物從未被凍干過。已發現本發明疫苗是安全的并具有高免疫原性。
文檔編號A61K39/08GK1968711SQ200580015290
公開日2007年5月23日 申請日期2005年3月14日 優先權日2004年3月15日
發明者M·肯托尼 申請人:啟龍有限公司