專利名稱：含有寡核苷酸的微球體及其在制備用于治療1型糖尿病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明廣泛地涉及AS-寡核苷酸的微球體遞送以誘導樹突狀細胞的耐受性，尤其是在非肥胖糖尿病的(NOD)小鼠模型中。更特別地，本發明涉及通過利用完全水溶性條件制備的微球體的藥物遞送技術，其中微球體中引入了反義(AS)寡核苷酸。這些微球體用作反義方法以預防NOD小鼠體內和原位的自身免疫糖尿病癥狀。
背景技術：
微粒、微球體和微囊是固體或者半固體的粒子，它們的直徑小于1毫米，更優選小于100微米，可以由各種原料形成，包括合成的聚合物、蛋白質和多糖。微球體已經在許多不同的應用中使用，主要是分離、診斷和藥物遞送。
可以使用多種不同的技術從合成的聚合物、天然的聚合物、蛋白質和多糖來制備這些微球體，包括相分離、溶劑蒸發，乳化和噴霧干燥。通常聚合物形成了這些微球體的支撐結構，感興趣的藥物被加入聚合物結構中。用來形成微球體的示例性聚合物包括，如Ruiz在美國專利號5,213,812、Reid等在美國專利號5,417,986、Tice等在美國專利號4,530,840、Tice等在美國專利號4,897,268、Tice等在美國專利號5,075,109、Singh等在美國專利號5,102,872、Boyes等在美國專利號5,384,133、Tice等在美國專利號5,360,610和Southern ResearchInstitute的歐洲專利申請公開號248,531中描述的乳酸和羥基乙酸的均聚物和共聚物(PLGA)；嵌段共聚物如Illum在美國專利號4,904,479中描述的tetronic 908和poloxamer 407；和Cohen等在美國專利號5,149,543中描述的聚偶磷氮(polyphosphazene)。使用這些聚合物制備的微球體表現低的負載效率，常常僅能在聚合物結構中摻入少量百分數的感興趣藥物。因此實際上必須常常給予大量的微球體以達到治療效果。
多年來，生物化學家們已經可在市場上買到球形珠子或者粒子作為一種工具。例如，結合到珠子上的抗體形成特異于特定配體的相對大的粒子。大的抗體包覆顆粒通常用于交聯細胞表面上的受體用于細胞的活化，它們被結合在固相上用于免疫親和純化，和使用結合到顆粒的組織或者腫瘤特異性的抗體將藥劑靶向需要的位置，可以用于遞送隨著時間緩慢釋放的治療劑。
目前可得到的微粒或者珠子的一個缺點是它們生產困難和代價高。通過這些已知的方法生產的微粒有一個寬的粒度分布，常常缺乏一致性，當活性成分處于高濃度時不能顯示出長期的釋放動力學。而且，用于這些已知方法的聚合物需要溶于有機溶劑中以形成微粒。因此它們必須在設計成能操作有機溶劑的特殊設備中生產。這些有機溶劑可以使包含于微粒中的蛋白質或者肽變性。當給予人類或者動物藥物時，殘留的有機溶劑會導致毒性。
另外，可得到的微粒很少是能充分地小到適合穿過針孔大小的尺寸，這種尺寸通常用于給予治療或者適用于經吸入給藥。例如，使用聚乳酸羥基乙酸(PLGA)制備的微粒尺寸大并有積聚的傾向。用于注射時，為除去太大的粒子必需采用會導致產品損失的尺寸選擇步驟。具有用于注射的適當尺寸的PLGA粒子必須被通過大規格針給藥以適應大的顆粒尺寸，這常常引起病人的不適。
通常，許多現在可用的微粒在水性介質中被激活釋放出它們的內容物，因此必須把它們凍干以預防預先釋放。另外，粒子如使用PLGA體系制備的那些顯示出基于侵蝕和擴散的釋放動力學。在這類體系中，觀察到初始的破裂或者迅速地釋放藥物。這種破裂效力可以導致對已經被給予粒子的病人有害的副作用。
使用脂質制備的裝入靶藥物的微粒是已知的。例如，排列在環繞多重含水態區室的雙層膜中形成粒子的脂質可被用來裝入水溶性的藥物用于連續的遞送，如Sinil Kim在美國專利號5,422,120中所描述的。這些粒子的尺寸通常大于10微米，被設計用于關節內、鞘內、皮下和硬膜外給藥。做為選擇，脂質體已經被用于靜脈內遞送小分子。脂質體呈球狀顆粒，由單一或者多重的磷脂和膽固醇雙分子層組成。脂質體的尺寸在30微米或者更大，可以攜帶各種水溶性的或者脂溶性的藥物。包括脂質組分的純度、潛在的毒性、小泡異質性和穩定性、過量的攝入和制造或貯藏期限困難等問題阻礙了脂質體技術。
醫藥群體的一個目標是遞送核酸到動物的細胞用于糖尿病治療。例如，核酸可以被相對有效地遞送到培養基中的細胞(體外)，但是當核酸被遞送給動物(體內)時，核酸酶導致高速的核酸降解。
除了保護核酸免于核酸酶消化之外，核酸的運載工具必須顯示低毒，必須被細胞有效地接納和有一種明確的、容易被制備的制劑。如臨床試驗所示，用于遞送的病毒載體可以導致體內嚴重有害的、甚至致命的免疫反應。另外，這些方法在體內有誘導突變效應的可能。經由不同制劑的脂質復合物(如脂質體或者陽離子的脂質復合物)中包裝核酸進行遞送在體內通常是無效的，并可能產生毒性效應。核酸與各種聚合物或者與肽的復合物顯示出不一致的結果，這些制劑的毒性還沒有被解決。核酸也已經被裝入聚合物基質中用于遞送，但是在這些例子中，粒子具有寬的粒度范圍，用于治療應用的有效性還沒有被證明。
因此，存在解決核酸遞送問題的需要，并有需要進行微球體的開發和發展用于制造微球體的新方法。與微球體有關的細節可以參見Scott等在美國專利號6,458,387、Woiszwillo等在美國專利號6,268,053、6,090,925、5,981,719和5,599,719以及Woiszwillo在美國專利號5,578,709中的描述。這些和這里確定的所有參考文獻被合并入本文中作為參考。
發明概要根據本發明，被遞送給樹突狀細胞的DNA以微球體進行遞送。據信這樣的遞送方式防止了核酸酶接近微球體內部的核酸。有關AS-寡核苷酸的微球體遞送，特別是在NOD鼠模型中進行，以誘導樹突狀細胞的耐受性。微球體是利用含水條件制備的，其中摻入了反義(AS)寡核苷酸。這些微球體被用于體內和原位抑制基因表達和防止NOD小鼠的自身免疫糖尿病癥狀。
在本發明的一個優選方面，靶向CD40、CD80和CD86初級轉錄物的三種AS-寡核苷酸被合成，寡核苷酸混合物的水溶液被制備并與聚合物溶液混合。加工之后，提供包含寡核苷酸的微球體并被施用給NOD小鼠。
通過考慮以下詳細的說明，本發明的這些和其它方面、目的、特征和優點包括各種組合，將是顯而易見的并能清楚地被理解。
附圖簡要說明在說明的過程中，將引用附圖，其中
圖1是樹突狀細胞在1型糖尿病中在胰腺胰島素生成β-細胞的自身免疫破壞中的作用的示意圖；圖2是包含β-半乳糖苷酶基因的質粒載體的圖表；
圖3顯示了提供用質粒DNA微球體的轉染NIH 3T3成纖維細胞的證據的顯微照片；圖4是裸質粒DNA和兩個根據本發明的質粒DNA微球體制劑在接觸DNAase后的瓊脂糖電泳凝膠的顯微照片；圖5是在四種不同的質粒DNA應用中β-半乳糖苷酶活性的柱狀圖表；圖6是AS-寡核苷酸和聚L-賴氨酸聚陽離子的微球體的掃描電子顯微照片；圖7是AS-寡核苷酸和聚L-鳥氨酸聚陽離子的微球體的掃描電子顯微照片顯微照片；和圖8是概述在用微球體和按照用于遞送三個初級轉錄物的其它方法處理的三個NOD小鼠組中糖尿病發生率的繪圖。
優選實施方案的描述根據需要，本發明詳細的技術方案在這里公開；然而，可以理解的是這里所公開的技術方案僅僅是本發明的示例，它們可以以各種形式體現。因此，在這里公開的細節不被解釋成一種限制，而僅僅作為用于主張權利的基礎，和作為一種用于教導本領域的技術人員以實際上任何適當的方式不同地使用本發明的代表性基礎。
預防自身免疫胰島素-依賴的糖尿病的最優方案，其是通過制備和注射這里描述的靶向CD40、CD80和CD86的初級轉錄物的反義(AS)-寡核苷酸微球體來實施的。這些寡核苷酸被設計成能誘導免疫耐受性以預防NOD小鼠模型中胰島素生成β-細胞的破壞。在圖1中圖解了導致這些β-細胞破壞的事件。這舉例說明了在NOD鼠和人類中，1型糖尿病是如何通過胰腺胰島素生成β-細胞的自身免疫破壞表現出來的。在臨床發作時，人類有10-20％剩余的β-細胞量。這剩余量的節約可以產生適于調節葡萄糖水平的剩余胰島素水平。本發明的微粒被提供用來干擾圖1中舉例說明的β-細胞的自身免疫破壞。
可以理解的是樹突狀細胞(DC)可以被激活，成為在所有的組織中發現的有效抗原遞呈細胞并在皮下呈高濃度存在。通過T細胞尤其是在淋巴結中，這些抗原呈遞樹突狀細胞起著免疫反應觸發器的作用。
圖2是包含β-半乳糖苷酶基因的質粒載體圖，該質粒載體可用于轉染NIH 3T3成纖維細胞。通過與加入的β半乳糖苷酶x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳糖吡喃糖苷)反應產生藍色的細胞，NIH 3T3成纖維細胞與質粒DNA微球體轉染的體外證據在圖3中顯示。
圖4舉例說明了微球體保護溶液中DNA的能力。這是一張顯示經質粒DNA的微球體給予核酸酶保護的瓊脂糖電泳凝膠，含有質粒DNA的微球體通常如這里注解生成。在質粒樣品1、2和3中，裸質粒DNA暴露于DNAse，帶有拖尾表明在三個水平的DNAase應用時發生了質粒DNA的降解。在顆粒1和顆粒2樣品中，質粒DNA微球體制劑暴露于DNAase，沒有拖尾表明微球體制劑保護質粒DNA免于降解。
圖5報告了在四種不同的質粒DNA應用中的β-半乳糖苷酶活性。裸質粒DNA應用顯示出極低的水平。使用lipofectamine，一種商業的作為運載工具的陽離子脂質，質粒DNA陽離子脂質復合物應用顯示出稍微高一些的水平。實質上更大的活性在兩種pDNA微球體中顯現，即相應于圖4的顆粒1的微球體1和相應于圖4的顆粒2的微球體2。
在制備用于自身免疫治療小鼠中糖尿病的微球體中，三種AS-寡核苷酸溶于水溶液中并與水溶性聚合物和聚陽離子結合。溶液一般在大約60-70℃進行溫育，隨后冷卻至23℃，移走過量的聚合物。據信包含以下三種AS-寡核苷酸序列的微球體被生成，其中星號象征硫醇化Seq ID 1:CD 40-AS5′C*AC*AG*C C*GA*GG*C*AA*AGA*C*AC*CA*T*GC*AG*GG*C*A-3′Seq ID 2CD80-AS5′-G*GG*AA*A G*CC*AG*G A*AT*CT*A
G*AG*CC*AA*TG G*A-3′Seq ID 3CD86-AS5′-T*GG*GT*G C*TT*CC*G T*AA*GT*T C*TG*GA*A C*AC*G*T*C-3′更特別地，核酸一般包含約30和約100重量百分數之間的微球體，其具有不大于約50微米的平均粒徑。它們一般如下制備。通過混合等分量的三種寡核苷酸溶液，每種溶液含有這三種類型寡核苷酸中的一種，這樣制備出寡核苷酸混合物的水溶液。包含這三種類型寡核苷酸的溶液被制備。溶液優選包含大約10mg/ml寡核苷酸。這些與等分量的10mg/ml聚陽離子溶液的儲備溶液混合，其中聚陽離子∶寡核苷酸的體積比為約1∶1到約4∶1。聚乙烯基吡咯烷酮和/或聚乙二醇的聚合物溶液被制備并與其它溶液混合。多次的加熱、冷卻、離心和洗滌提供了一種水懸浮液，它通常可以凝固和凍干形成一種包含寡核苷酸和聚陽離子的微球體的干粉。
根據本發明的微球體是可用于質粒DNA和反義寡核苷酸和其它核酸的無病毒遞送工具。它們允許體外遞送β-半乳糖苷酶質粒DNA進3T3成纖維細胞。微球體保護質粒DNA阻攔核酸酶活性。在用微球體制劑轉染后表達出高水平的β-半乳糖苷酶活性。
包含使人感興趣的反義寡核苷酸的微球體下調表面細胞抗原CD40、CD80和CD86，已知這些抗原在能導致破壞胰腺的胰島素生成β-細胞的自身免疫反應的活化中是至關重要的。這可以通過皮下注射到位于皮下的樹突狀細胞實施。NOD小鼠研究證明能有效的預防β細胞的自身免疫破壞。DNA和寡核苷酸微球體是有效的體外和體內的轉染載體。樹突狀細胞看來似乎攝取寡核苷酸微球體和抑制了表面細胞抗原CD40、CD80和CD86的表達。反義寡核苷酸微球體有效地預防了NOD鼠中糖尿病的發生。
以下的實施例更進一步地解釋說明了本發明的某些特征和優點。實施例不被認為是對發明的限定或者其它方面的限制。
實施例1三種靶向CD40、CD80和CD86初級轉錄物的AS-寡核苷酸經匹茲堡大學(Pittsburgh，PA)的DNA合成儀合成。AS-寡核苷酸序列是Seq ID 1CD 40-AS5′C*AC*AG*C C*GA*GG*C*AA*AGA*C*AC*C A*T*G C*AG*GG*C*A-3′Seq ID 2CD80-AS5′-G*GG*AA*A G*CC*AG*G A*AT*CT*AG*AG*CC*A A*TG G*A-3′Seq ID 3CD86-AS5′-T*GG*GT*G C*TT*CC*G T*AA*GT*T C*TG*GA*A C*AC*G*T*C-3′寡核苷酸混合物的水溶液通過混合等分量的三種寡核苷酸溶液制備，每種寡核苷酸溶液包含一種寡核苷酸，最后形成了三種寡核苷酸的10mg/ml的溶液。制備了在diH2O中的10mg/ml的聚L-賴氨酸·HBr(通過Bachem的聚L-賴氨酸·HBr直到50,000，King of Prussia，PA)。以體積比1∶1將聚L-賴氨酸·HBr加入到寡核苷酸溶液中。溫和地渦旋混合物。在1M乙酸鈉(Spectrum，Gardena，CA)中包含12.5％PVP(聚乙烯基吡咯烷酮，40000道爾頓，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(聚乙二醇，3350道爾頓，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)的25％的聚合物溶液被制備，pH＝5.5。聚合物溶液以2∶1的體積比如下加入750μl的AS-寡核苷酸，0.75ml的聚L-賴氨酸·HBr，3.0ml的PEG/PVP，總體積為4.50ml。
上述批量在70℃溫育30分鐘，然后冷卻到23℃，冷卻后，溶液變混濁和發生沉淀。然后將懸浮液進行離心，除去過量的PEG/PVP。產生的沉淀經在去離子水中重懸進行洗滌，接著離心和移去上清液。洗滌過程重復三次。水中懸浮體被冷凍干燥，形成了一種包含寡核苷酸和聚L-賴氨酸的微球體的干粉。
圖6顯示了1∶1比率的聚L-賴氨酸∶寡核苷酸物質的掃描電子顯微照片(SEM)。裝配的微球體的大小為0.5-4μm，平均粒度約為2.5μm。也觀察到一種未知物質的沉淀。通過HPLC的補充研究證實沉淀包括殘留的PEG/PVP、主要是PVP。
實施例2靶向CD40、CD80和CD86初級轉錄物的AS-寡核苷酸是實施例1中的AS-寡核苷酸序列。寡核苷酸混合物的水溶液通過混合等分量的三種寡核苷酸溶液制備，每種寡核苷酸溶液包含一種寡核苷酸，最后形成了三種寡核苷酸的10mg/ml的溶液。寡核苷酸混合物的溶液被制備。制備了在diH2O中的10mg/ml的聚L-鳥氨酸·HBr(通過Sigma的聚L-鳥氨酸·HBr 11,900(vis))。聚L-鳥氨酸·HBr加入到寡核苷酸溶液中，將混合物溫和地渦旋。在0.1M乙酸鈉(Spectrum，Gardena，CA)中包含12.5％PVP(聚乙烯基吡咯烷酮，40000道爾頓，SpectrumChemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(聚乙二醇，3350道爾頓，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)的25％的聚合物溶液被制備，pH＝5.5。加入聚合物溶液。接著如實施例1所述進行溫育和沖洗。制備總體積為6.0ml，其中AS-寡核苷酸1.5ml，聚L-鳥氨酸·HBr 1.5ml，PEG/PVP 3ml。
圖7顯示了1∶1比率的聚L-鳥氨酸∶寡核苷酸物質的SEM。裝配的微球體的大小為0.2-8μm，平均粒度約為2μm。也觀察到未知物質的沉淀。HPLC的補充研究能夠證實沉淀包括殘留的PEG/PVP、主要是PVP。
實施例3體內試驗是利用1型糖尿病的NOD小鼠模型來進行的。1型糖尿病如在圖1中解釋的是通過胰腺的胰島素生成β-細胞的自身免疫破壞來表現的。在三種應用中使用AS-寡核苷酸以干擾β-細胞的自身免疫破壞。目標是通過靶向CD40、CD80和CD86的初級轉錄物干擾樹突狀細胞的功能，所述的初級轉錄物編碼T細胞活化所需的樹突狀細胞表面蛋白。已知具有低水平的CD40、CD80和CD86的樹突狀細胞促進了體內抑制性免疫細胞網絡。這些級聯可以導致體內T細胞對β-細胞的反應性不足。
在第一組試驗動物中，樹突狀細胞由NOD小鼠的骨髓祖細胞離體()增殖而來。三種靶向CD40、CD80和CD86的初級轉錄物的AS-寡核苷酸的組合被添加到組織培養基中的細胞。培養后，AS-寡核苷酸轉染的樹突狀細胞被注射入5-8周齡的有血緣關系的受體(還不是糖尿病患者)中。這是已知的離體的遞送方法。
平行地，AS-寡核苷酸微球體被直接地注射進另外的同齡NOD小鼠中。在各種這樣處理的小鼠上進行單次注射。另一個組的這些NOD鼠不進行治療，作為一種對照。
圖8顯示了對照、未處理的NOD小鼠到23周齡時全部發生了糖尿病。離體AS-寡核苷酸轉染的和重新注入樹突狀細胞的組(AS-ODNDC)顯示出糖尿病的延緩發生，其中20％保持無糖尿病，這表明葡萄糖水平在非糖尿病范圍內維持。微球體體內注射的NOD小鼠中，在43周時71％的鼠保持無糖尿病。
很清楚已經描述的本發明的技術方案是對本發明的原理應用中的一些解釋性說明，本領域技術人員可以進行各種修飾而不背離本發明內涵和外延。在這里描述的各種特征可在任何組合中使用，不局限于在這里特別列出的確定組合。
序列表<110>巴克斯特國際公司(BAXTER INTERNATIONAL INC.)巴克斯特醫療保健股份有限公司(BAXTER HEALTHCATE S.A.)匹茲堡兒童醫院(CHILDREN′S HOSPITAL OF PITTSBURGH)<120>含有寡核苷酸的微球體及其在制備用于治療1型糖尿病的藥物中的應用(OLIGONUCLEOTIDE-CONTAINING MICROSPHERES，THEIR USE FOR THEMANUFACTURE OF A MEDICAMENT FOR TREATING DLABE)<130>SCT064887-47<141>2005-05-12<160>3<210>1<211>31<212>DNA<213>Mus musculus<400>1cacagccgag gcaaagacac catgcagggc a 31<210>2<211>29<212>DNA<213>Mus musculus<400>2gggaaagcca ggaatctaga gccaatgga 29<210>3<211>30<212>DNA<213>Mus Musculus<400>3tgggtgcttc cgtaagttct ggaacacgtc 30
權利要求
1.包含寡核苷酸的用于治療1型糖尿病的微球體，所述寡核苷酸基于微球體總重量占所述微球體的約30重量百分數和約100重量百分數之間的，所述的微球體具有的平均粒度不大于約50微米。
2.權利要求1的微球體，其中所述的寡核苷酸靶向結合選自CD40、CD80和CD86的初級轉錄物和它們的組合。
3.權利要求2的微球體，其中所述的寡核苷酸選自Seq ID 1、SeqID 2或者Seq ID 3和它們的組合。
4.一種以微球體形式用于遞送核酸到患有1型糖尿病的個體的方法，其中用于遞送所述微球體的給藥途徑選自靜脈內的、肌肉的、皮下的、局部的、皮內的、腹膜內的、口的、肺的、眼的、鼻的或者直腸的途徑。
5.一種用于保護非肥胖糖尿病小鼠的胰腺β-細胞免于自身免疫破壞的方法，包括皮下注射根據權利要求1的微球體。
6.一種用于保護非肥胖糖尿病小鼠的胰腺β-細胞免于自身免疫破壞的方法，包括皮下注射根據權利要求2的微球體。
7.一種用于保護個體的胰腺β-細胞免于自身免疫破壞的方法，包括皮下注射根據權利要求1的微球體。
8.一種用于保護個體的胰腺β-細胞免于自身免疫破壞的方法，包括皮下注射根據權利要求2的微球體。
9.一種用于保護人的胰腺β-細胞免于自身免疫破壞的方法，包括皮下注射根據權利要求1的微球體。
10.一種用于保護人的胰腺β-細胞免于自身免疫破壞的方法，包括皮下注射根據權利要求2的微球體。
11.一種用于保護個體的胰腺β-細胞免于自身免疫破壞和1型糖尿病發病的方法，包括皮下注射根據權利要求1的微球體。
12.一種用于保護個體的胰腺β-細胞免于自身免疫破壞和1型糖尿病發病的方法，包括皮下注射根據權利要求2的微球體。
全文摘要
本發明涉及包含用于治療1型糖尿病的寡核苷酸的微球體，基于微球體的總重量所述寡核苷酸占微球體的約30重量百分數至約100重量百分數，所述微球體平均粒度不大于約50微米。所述寡核苷酸靶向結合初級轉錄物CD40、CD80、CD86和它們的組合。
文檔編號A61K39/00GK1980641SQ200580015308
公開日2007年6月13日 申請日期2005年5月12日 優先權日2004年5月12日
發明者特倫斯·L·斯克特, 黛博拉·拉弗里尼埃, 尼克·吉安努卡基斯, 韋雷德·比什克－利布, 拉里·R·布朗, 珍妮弗·梅琴 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特醫療保健股份有限公司, 匹茲堡兒童醫院