用于發酵和培養的方法、植物發酵提取物、植物發酵提取物組合物、用于制備脂多糖的方...的制作方法

專利名稱：：用于發酵和培養的方法、植物發酵提取物、植物發酵提取物組合物、用于制備脂多糖的方...的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于通過包含免疫增強劑的可食革蘭氏陰性菌發酵的方法，所述細菌當加入用于植物和動物的藥物、準藥物、化妝品、功能性食物、飼料、肥料和沐浴劑中時是安全的，所述動物如哺乳動物(特別地家畜和寵物動物)包括人類、鳥類(特別是家雞和寵物鳥類)、兩棲動物、爬行動物、魚類(特別是寵物魚類)和無脊推動物，包含通過發酵獲得的免疫增強劑的培養溶液，和通過使免疫增強劑濃縮獲得的提取物。背景領域對于哺乳動物(特別地家畜和寵物動物)包括人類、鳥類(特別是家雞和寵物鳥類)、兩棲動物、爬行動物、魚類(特別是寵物魚類)和無脊推動物以及植物，建立用于預防或治療疾病的方法包括感染防護技術是緊迫的問題。此外，為了實現這點，非常需要其中不使用化學藥品、不發生環境污染、不發生抗藥菌和不在人體中發生累積的方法。本發明人已發現對于上述問題，衍生自天然產物的免疫增強劑安全地實現關于預防和治療疾病的作用(非專利文獻1)。作為其的一個例子，可以使用得自成團泛菌(尸a/3"eaag《/咖ers"s)的脂多糖，所述成團泛菌是小麥中的常住菌(非專利文獻1)。已知鱟陽性糖脂具有強免疫增強活性(非專利文獻2)。所謂的脂多糖也包括在這個類別中。脂多糖已知是革蘭氏陰性菌細胞外壁的主要組分以及Coley's疫苗接種的主要成分之一，且具有有效的免疫增強活性(非專利文獻3)。本發明人已發現鱟陽性糖脂存在于小麥中，其的部分是小麥共生細菌的脂多糖，并且這些強烈激活天然免疫性(非專利文獻4)。上文2種通過經皮或口部施用安全且強烈地激活天然免疫性，并且顯示出用于預防和治療廣泛多樣疾病包括傳染病的作用(非專利文獻5)。此外，本發明人已報道衍生自成團泛菌的脂多糖含量不僅通過用成團泛菌使小麥粉發酵得到增加，所述成團泛菌是小麥粉中的常住菌，而且其為包含衍生自小麥的組分的新型免疫增強劑的發酵的小麥提取物發揮感染防護效果，作為代替畜牧業和水產業領域中的抗生素化學藥品的安全和可靠的天然材料。脂多糖的基本結構由稱為脂質A的脂質和與之共價結合的各種糖(多糖)組成。脂質A后的區域由R核隨后為0抗原多糖部分組成，所述R核在相關細菌中采取相對一致的結構，所述0抗原多糖部分取決于細菌種類采取不同結構(非專利文獻7)。0抗原也具有相同寡糖的重復結構，其表征LPS(脂多糖)(非專利文獻l)。因此，脂多糖一般形成具有多重分子量的混合物。還已知取決于脂多糖衍生自其的微生物脂多糖具有不同結構。例如，衍生自沙門菌屬(&//z^/7e//fl)的脂多糖和衍生自大腸桿菌(&c力eric力iacoh')的脂多糖在結構以及生物活性方面不同。然而，因為一般不易于確定脂多糖的結構，所以衍生自革蘭氏陰性菌的脂多糖的結構和功能的細節未知。因此，描述基于功能差異脂多糖一般具有新型結構。同時，在近期研究中已證實脂多糖經由TLIU激活天然免疫性(非專利文獻6)。已發現脂多糖的脂質A部分是與TLR4結合所需的，和多糖部分在很大程度上影響TLR4的細胞內信號轉導的效率。根據上文，推測脂多糖的細胞應答中的差異指示結構差異。證實脂多糖的經皮或口部施用是可靠和安全的對于確定脂多糖的有用性是重要的。因此，照慣例著重在食物生產和發酵中使用的革蘭氏陰性菌。即，如果鱟陽性糖脂和脂多糖存在于在食物生產中使用的革蘭氏陰性菌中，且作為可食產物與發酵產物一起提供，那么這個事實證實鱟陽性糖脂和脂多糖具有被食用的經驗。這是強烈指出鱟陽性糖脂和脂多糖的經皮或口部施用是可靠和安全的發現，并且同時使用這些物質應使得能夠開發新衛生保健產品和藥物如化妝品和食物。非專利文獻1:ChieKohchi等人，"Naturalimmunityregulatoryactionoffermentedwheatextract,"NewFoodIndustry(2006)第48巻，第19-27頁非專利文獻2:Ulmer，A.J.等人，"Lipopolysaccharide:Structure,Bioactivity，Receptors,andSignalTransduction."TrendsinGlycoscienceandGlycotechnology，(2002)第14巻,第53-68頁專利文獻3:Stames,C.0.，"Coley'stoxinsinperspective."Nature,(1992)第357巻，第11-12頁非專利文獻4:Nishizawa,T.等人，Chem.Pharm.Bui1.，(1992),第40巻，第479-483頁非專利文獻5:InagawaH.等人，"Effectsoflipopolysaccharide(LPSw)derivedfromwheatflourhavingmacrophageactivatingeffectontreatmentandpreventionofvariousdiseases,"Biotherapy，(1991)第5巻，第617-621頁非專利文獻6:KiyoshiTakedal，等人，"Toll-likereceptorsininnateimmunity."InternationalImmunology,第17巻，第1-14頁非專利文獻7:SeikagakuJiten第2版(1990),TokyoKagakuDojin，第1949頁。發明的公開內容待由本發明解決的問題免疫增強劑通常衍生自菌類和海藻或革蘭氏陽性菌如乳酸菌中的多糖。來自菌類和海藻的多糖提取物的商購可得產品是非常昂貴的，因為難以獲得大量的材料和用于提取的成本很高。同時，對于革蘭氏陽性菌如乳酸菌，對于其培養使用動物材料。因此關于培養的成本很高，和動物組分的安全性有疑問。另一方面，為了由植物中廣泛且始終存在的微生物制備克疫增強劑，在植物組分中有效培養微生物并且獲得其結構組分或產物是有用的。作為一個例子，存在于小麥中的成團泛菌可以通過使用小麥粉作為介質培養其安全且廉價地獲得。同時，幾乎不存在革蘭氏陽性菌有意識地口部攝入的經驗。因此，其口部施用經過長時間段的安全性一般是未知的。然而，已公認口部施用與小麥粉一起培養的成團泛菌提取物是非常安全的。因為成團泛菌始終存在于小麥中，所以自小麥培養開始后人類已持續地攝入它。即，成團泛菌及其組分具有經過長時間段經由人類攝入的經驗。事實上，黑面包的乳酸菌生長所需的葉酸由在發酵過程中生長的成團泛菌供應。因此，成團泛菌的生長是生產黑面包所需的。當食用黑面包時，攝入相當大量的微生物細胞組分。關于類似地具有被食用的經驗且能夠用植物組分培養的革蘭氏陰性菌，用于制造醋的醋化醋桿菌(JceM&WeraceO')，用于生產(l)椰果(natadecoco)、(2)龍舌蘭酒、(3)黃原膠和(4)salapao的(1)木醋桿菌(Xc"o6s""jry///2"/z7)，(2)運動發酵單胞菌(Z戸,脂/po6/7/'s)，(3)野';由菜黃單胞菌(X3/^力o邁o/2ssca/z7;esfr2.s)和(4)陰溝腸桿菌(^Wero6ac"rc/oacae)是可用的。然而，在4吏這些發酵的過程中，多個細菌物種的培養是復雜的并且單個細菌物種不生長。例如，在制造醋的過程中，糖首先由曲霉菌(hpei^///:^)生產，隨后乙醇由酵母(^ccAarfM/cw)生產，和進一步地發生醋細菌(Jce^6a"er)的生長。同時，單獨的醋細菌的單一培養在標準培養基SH(Schramm-Hestrin)培養基(葡萄糖20g、酵母提取物5g、蛋白胨5g、檸檬酸1.15g、磷酸氫二鈉2.7g和蒸餾水1000ml)中進行。然而，蛋白胨是通過用酶使牛奶酪蛋白降解產物，是衍生自牛的蛋白質，并且是昂貴的，以及存在關于安全性的問題。已知在食物發酵中使用或作為可食產物與發酵產物一起提供的幾類革蘭氏陰性菌目前是可獲得的。這些可食產物的代表是醋、龍舌蘭酒、酸奶酪和面包。然而，仍未報道鱟陽性糖脂或脂多糖存在于用于食物發酵或作為可食產物與發酵產物一起提供的革蘭氏陰性菌(醋桿菌屬、葡糖桿菌屬(67歸/2o6s"er)、弗拉托菌屬(尸r"eur/a)、發酵單胞菌屬(^F邁咖o/M)或葡萄糖酸菌(67i/co/7o&c^erSi/6oxj^fa/7s)中。鑒于上述問題，本發明著眼于已經過長時間段被食用的革蘭氏陰性菌的口部施用是高度安全的，且旨在提供通過培養具有經過長時間培養溶液，其提取物、提取物組合物以及:多糖和用于制備脂多糖的方法。本發明著眼于在革蘭氏陰性菌所含有的，在食物發酵中使用或用作可食產物與發酵產物一起使用且具有免疫增強功能的脂多糖。醋桿菌屬群用作全世界具有免疫增強功能的食物。認為這種免疫增強功能衍生自醋桿菌屬群含有的脂多糖。因此，認為鱟陽性糖脂或脂多糖可以通過相同方法從除醋桿菌屬外的具有免疫增強功能的革蘭氏陰性菌中提取。因此，顯而易見的是本發明不限于實施例中描述的微生物，且可以適合于具有免疫增強功能的革蘭氏陰性菌的其他微生物，如發酵單胞菌屬和葡糖桿菌屬。此外，因為鱟陽性糖脂或由本發明提供的脂多糖通過口部或經皮施用可以安全地激活免疫性，所以它們可以進行配制且在為了維持動物和植物中的健康的目的廣泛使用的藥物、食物包括具有補充性或特殊功能的食物、皮膚護理產品、飼料和寵物食物中。用于解決問題的方法用于本發明發酵和培養的方法包括用醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、黃單胞菌屬、發酵單胞菌屬或腸桿菌屬使衍生自可食植物的材料發酵，所述細菌是具有免疫增強功能的可食革蘭氏陰性菌，和同時培養所述細菌。本發明的植物發酵提取物的特征在于，其通過用于發酵和培養方法獲得。本發明的植物發酵提取物粉末的特征在于，其得自植物發酵提取物。本發明的植物發酵提取物組合物的特征在于，其包含植物發酵提取物或植物發酵提取物粉末。植物發酵提取物組合物的特征在于，其可以是藥物、用于動物的藥物、準藥物、化妝品、食物、功能性食物、飼料或沐浴劑。植物發酵提取物組合物的特征在于，其可以顯示抗炎性腸病作用、抗過敏性疾病作用、鎮痛作用、抗癌作用、膽固醇減少作用、血糖減少作用、天然愈合能力增強作用或免疫增強作用。本發明的脂多糖的特征在于，其得自通過用于發酵和培養的方法培養的細菌。用于生產本發明的脂多糖的方法的特征在于，其包括從通過用于發酵和培養的方法培養的細菌獲得脂多糖。本發明的脂多糖的特征在于，其得自醋桿菌屬。用于生產本發明的脂多糖的方法的特征在于，其包括從醋桿菌屬獲得脂多糖。發明效應根據本發明，顯而易見的是鱟陽性糖脂包含在醋化醋桿菌提取物、醋桿菌屬混合物提取物和葡萄糖酸菌提取物中，和脂多糖包含在鱟陽性糖脂中。這證實鱟陽性糖脂或脂多糖包含在用于食物的革蘭氏陰性菌中，且導致提供在鱟陽性糖脂中的脂多糖作為具有被食用經驗的安全、可靠和廉價的免疫增強劑。本發明包括日本專利申請號2005-342971的說明書和/或附圖中描述的內容，這是本發明優先權的基礎。用于執行本發明的最佳方式在下文中，本發明的優選例子將在下面得到詳細描述。實施例1包含醋桿菌屬的鱟陽性糖脂的植物發酵提取物通過使植物組分單獨與醋桿菌屬一起發酵獲得的發酵的植物免疫增強提取物(1)發酵的小麥提取物A.生產用小麥培養各種醋桿菌屬物種添加小麥粉(O.5g)和鹽(磷酸氫二鈉七水合物1.28g、磷酸二氫鉀O.3g、氯化鈉50mg、氯化銨IOOmg、0.2ml1M硫酸鎂水溶液、0.01ml1M氯化鉤水溶液)以及水以制備總體積100ml。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加醋化醋桿菌的1個菌落或0.1fflL醋桿菌屬混合物或葡萄糖酸菌的1個菌落，隨后將其靜置且于301C培養5天。用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器(blockheater)使混合物于90'C加熱30分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用微量離心機在10，000rpin下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖月旨含量通過Endospecy進行測量。B.物理性質和生物活性鱟反應作為通過Endospecy測量每種醋桿菌屬發酵的小麥提取物中的糖脂含量的結果，發現每lg濕固體重量的醋化醋桿菌發酵的小麥提取物，醋桿菌屬混合物發酵的小麥提取物和葡萄糖酸菌發酵的小麥提取物分別提取約18pg、56lug和43ug糖月旨。碘-淀粉反應衍生自小麥的組分也包含在每種發酵的小麥提取物中，并且不同于衍生自醋桿菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用碘淀粉反應。每種發酵的小麥提取物對于碘淀粉反應是陽性的，然而，衍生自醋桿菌屬的純化的脂多糖不反應。即，2邊并不相同。經由各種醋桿菌屬發酵的小麥提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(NO)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞譜系培養的細胞經由本文的各種發酵的小麥提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。醋化醋桿菌發酵的小麥提取物、醋桿菌屬混合物發酵的小麥提取物和葡萄糖酸菌發酵的小麥提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp(成團泛菌的脂多糖)量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當醋桿菌屬發酵的小麥提取物依據LPSp濃度以100ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。對于N0生產，與LPSp的情況類似，當醋化醋桿菌發酵的小麥提取物、醋桿菌屬混合物發酵的小麥提取物或葡萄糖酸菌發酵的小麥提取物依據LPSp濃度以100ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10MM/ml或更多的NO生產。研究在NO生產中經由醋化醋桿菌發酵的小麥提取物、醋桿菌屬混合物發酵的小麥提取物或葡萄糖酸菌發酵的小麥提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當依照LPSp濃度檢查的醋桿菌屬發酵的小麥提取物中的任何一種以100ng/ml的濃度添加時，NO的產生幾乎完全被多粘菌素B的添加4中制。(2)醋桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物A.生產添加干豆腐廢料(0.5g)和鹽(磷酸氫二鈉七水合物1.28g、磷酸二氫鉀O.3g、氯化鈉50mg、氯化銨IOOmg、0.2ml1M硫酸鎂水溶液、0.01ml1M氯化鈣水溶液)以及水以制備總體積100ml。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加醋化醋桿菌的l個菌落或0.1mL醋桿菌屬混合物或葡萄糖酸菌的1個菌落，隨后將其靜置且于30'C培養5天。用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器使混合物于90t:加熱30分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用^L量離心機在10，000rpm下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行測量。B.物理性質和生物活性鱟反應作為通過Endospecy測量每種醋桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物中的糖脂含量的結果，發現每lg濕固體重量的醋化醋桿菌發酵的小麥提取物，醋桿菌屬混合物發酵的小麥提取物和葡萄糖酸菌發酵的小麥提取物分別提取約4jag、23jag和21jag糖月旨。黃色蛋白反應衍生自豆腐廢料的組分也包含在每種醋桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物中，并且不同于衍生自醋桿菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用黃色蛋白反應。發酵的豆腐廢料提取物對于黃色蛋白反應是陽性的，然而，衍生自醋桿菌屬的純化的LPS不反應。即，2邊并不相同。經由各種醋桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(N0)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞語系培養的細胞經由本文的各種發酵的豆腐廢料提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。醋化醋桿菌發酵的豆腐廢料提取物、醋桿菌屬混合物發酵的豆腐廢料提取物和葡萄糖酸菌發酵的豆腐廢料提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當醋桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物依據LPSp濃度以100ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。對于N0生產，當醋化醋桿菌發酵的豆腐廢料提取物、醋桿菌屬混合物發酵的豆腐廢料提取物或葡萄糖酸菌發酵的豆腐廢料提取物依據LPSp濃度以100ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10nM/ml或更多的NO生產。研究在NO生產中經由醋化醋桿菌發酵的豆腐廢料提取物、醋桿菌屬混合物發酵的豆腐廢料提取物或葡萄糖酸菌發酵的豆腐廢料提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當依照LPSp濃度檢查的醋桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物中的任何一種以100ng/ml的濃度添加時，NO生產幾乎完全被多粘菌素B的添加抑制。(3)醋桿菌屬發酵的褐藻提取物A.生產添加干"裙帶菜"(褐藻的孢子葉)粉(0.5g)和鹽(磷酸氫二鈉七水合物1.28g、磷酸二氫鉀0.3g、氯化鈉50mg、氯化銨100mg、0.2ml1M硫酸鎂水溶液、0.01ml1M氯化鉀水溶液)以及水以制備總體積100ml。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加醋化醋桿菌的l個菌落或0.lmL醋桿菌屬混合物或葡萄糖酸菌的l個菌落，隨后將其靜置且于30C培養5天。用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器使混合物于901C加熱30分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用微量離心機在IO，OOOrpm下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行領'J量。B.物理性質和生物活性鱟反應作為通過Endospecy測量每種醋桿菌屬發酵的褐藻提取物中的糖脂含量的結果，發現每lg濕固體重量的醋化醋桿菌發酵的褐藻提取物，醋桿菌屬混合物發酵的褐藻提取物和葡萄糖酸菌發酵的褐藻提取物分別提取約17jag、62ug和46pg糖脂。與p-葡聚糖的反應衍生自褐藻的組分也包含在每種醋桿菌屬發酵的褐藻提取物中，并且不同于衍生自醋桿菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用利用FungitecGTestMK(SeikagakuCorporation)與P-葡聚糖的反應。每種發酵的褐藻提取物對于p-葡聚糖反應是陽性的，然而，衍生自醋桿菌屬的純化的LPS不反應。即，2邊并不相同。經由各種醋桿菌屬發酵的褐藻提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(NO)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞譜系培養的細胞經由本文的各種發酵的褐藻提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。醋化醋桿菌發酵的褐藻提取物、醋桿菌屬混合物發酵的褐藻提取物和葡萄糖酸菌發酵的褐藻提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當醋桿菌屬發酵的褐藻提取物依據LPSp濃度以100ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。關于N0生產，當醋化醋桿菌發酵的褐藻提取物、醋桿菌屬混合物發酵的褐藻提取物或葡萄糖酸菌發酵的褐藻提取物依據LPSp濃度以100ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10nM/ml或更多的N0生產。研究在NO生產中經由醋化醋桿菌發酵的褐藻提取物、醋桿菌屬混合物發酵的褐藻提取物或葡萄糖酸菌發酵的褐藻提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當依照LPSp濃度檢查的醋桿菌屬發酵的褐藻提取物中的任何一種以100ng/ml的濃度添加時，N0生產幾乎完全被多粘菌素B的添加抑制。(4)各種醋化醋桿菌植物發酵提取物對功能性食物的實踐應用的例子包含各種醋化醋桿菌植物發酵提取物的糖果的生產作為材料，使砂糖、稠麥芽糖漿、水和在實施例中生產的每種醋化醋桿菌植物發酵提取物(醋化醋桿菌小麥、豆腐廢料或發酵的褐藻提取物)以5:5:5:1的比率混合，并且使混合物于120-160X:加熱至熬稠。使熬稠的混合物在用于冷卻的鋼板上進行冷卻，并且拉伸成條狀，并且塑成具有約lg重量的粒狀以提供糖果。將合適量的這些糖果置于20ml水中并通過加熱進行溶解。測量這種溶液中作為醋桿菌屬植物發酵提取物的活性組分的脂多糖的量，對于醋化醋桿菌發酵的小麥提取物、醋化醋桿菌發酵的豆腐廢料提取物和醋化醋桿菌發酵的褐藻提取物，量分別為3.5pg/g、3.1pg/g和2.4jag/g。這種糖被由于感冒具有咽喉痛的6個男人和女人攝取。緊在其后進行關于咽喉痛的調查。關于咽喉痛，所有6個人感覺咽喉痛由于每種醋化醋桿菌植物發酵提取物而減輕(單樣本符號檢驗p<0.03)。(5)關于各種醋化醋桿菌植物發酵提取物的藥物功效的例子每種醋化醋桿菌植物發酵提取物對特應性皮炎的抑制作用為了檢查每種醋化醋桿菌植物發酵提取物對特應性皮炎的作用，引入I型過敏癥模型。抗二硝基苯基鼠類單克隆抗體(1Hg/小鼠)靜脈內注入在1個組中的5只雄性BALB/c小鼠中。l小時后，腹部-皮內施用在實施例中生產的醋化醋桿菌發酵的小麥提取物、醋化醋桿菌發酵的豆腐廢料提取物和醋化醋桿菌發酵的褐藻提取物(各50"1/小鼠)。另外1小時后，0.25%含二硝基氟苯的丙酮和橄欖油(4:1)的20ji1混合溶液作為變應原應用于小鼠中的耳廓表面和背面。在應用后l、2、24和48小時使用測厚儀測量耳廓的厚度，并且厚度與緊在應用前的厚度的差異(A)反映水腫程度。藥物施用功效通過抑制率=(1_藥物施用后的A耳部水腫/對照中的A耳部水腫)x100進行評估，所述抑制率在變應原施用后1小時觀察到的早期應答和在24小時后誘導的延遲應答中獲得。結果顯示于表中。如從表中顯而易見的，醋化醋桿菌發酵的小麥提取物、醋化醋桿菌發酵的豆腐廢料提取物和醋化醋桿菌發酵的褐藻提取物抑制變應性應答。[表l]表l各種醋化醋桿菌植物發酵提取物對變應性反應的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例2包含黃單胞菌屬的鱟陽性糖脂的植物發酵提取物通過使植物組分單獨與黃單胞菌屬一起發酵獲得的發酵的植物免疫增強提取物(1)發酵的小麥提取物A.生產用小麥培養黃單胞菌屬添加小麥粉(0.5g)和鹽(磷酸氫二鈉七水合物1.28g、磷酸二氫鉀O.3g、氯化鈉50mg、氯化銨IOOing、0.2ml1M硫酸鎂水溶液、0.01ml1M氯化鉤水溶液)以及水以制備總體積100ml。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加野油菜黃單胞菌的1個菌落，隨后將其靜置且于30t:培養5天。用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器使混合物于^x:加熱3o分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用微量離心機在10,000rpm下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行觀，J量。B.物理性質和生物活性鱟反應作為通過Endospecy測量黃單胞菌屬發酵的小麥提取物中的糖脂含量的結果，發現每lg濕固體重量的野油菜黃單胞菌提取物提取約2.2mg糖脂。碘淀粉反應衍生自小麥的組分也包含在黃單胞菌屬發酵的小麥提取物中，并且不同于衍生自黃單胞菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用碘淀粉反應。每種發酵的小麥提取物對于碘淀粉反應是陽性的，然而，衍生自黃單胞菌屬的純化的脂多糖不反應。即，2邊并不相同。經由各種黃單胞菌屬發酵的小麥提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(N0)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞語系培養的細胞經由黃單胞菌屬發酵的小麥提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。野油菜黃單胞菌提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當黃單胞菌屬發酵的小麥提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。關于N0生產，當黃單胞菌屬發酵的小麥提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10pM/ml或更多的N0生產。研究在N0生產中經由黃單胞菌屬發酵的小麥提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當依照LPSp濃度檢查的黃單胞菌屬發酵的小麥提取物以10ng/ml的濃度添加時，NO生產幾乎完全被多粘菌素B的添加抑制。(2)黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物A.生產添加干豆腐廢料(O.5g)和鹽(磷酸氫二鈉七水合物1.28g、磷酸二氫鉀O.3g、氯化鈉50mg、氯化銨IOOmg、0.2ml1M硫酸鎂水溶液、0.01ml1M氯化鈣水溶液)以及水以制備總體積100ml。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加野油菜黃單胞菌的1個菌落,隨后將其靜置且于30C培養5天。用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器使混合物于90C加熱30分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用微量離心機在10，000rpm下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行測量。B.物理性質和生物活性鱟反應作為通過Endospecy測量黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物中的糖脂含量的結果，發現每lg濕固體重量的野油菜黃單胞菌提取物提取約1.6mg糖脂。黃色蛋白反應衍生自豆腐廢料的組分也包含在黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物中，并且不同于衍生自黃單胞菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用黃色蛋白反應。發酵的豆腐廢料提取物對于黃色蛋白反應是陽性的，然而，衍生自黃單胞菌屬的純化的LPS不反應。即，2邊并不相同。經由黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(NO)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞鐠系培養的細胞經由黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。野油菜黃單胞菌豆腐廢料提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。關于N0生產，當黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10juM/ml或更多的N0生產。研究在NO生產中經由黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當依照LPSp濃度檢查的黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物以10ng/ml的濃度添加時，NO生產幾乎完全被多粘菌素B的添加抑制。(3)黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物A.生產添加干裙帶菜粉(G.5g)和鹽(磷酸氫二鈉七水合物1.28g、磷酸二氫鉀O.3g、氯化鈉50mg、氯化銨IOOmg、0.2ml1M硫酸鎂水溶液、0.01ml1M氯化鈣水溶液)以及水以制備總體積100nil。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加野油菜黃單胞菌的1個菌落，隨后將其靜置且于301C培養5天。用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器使混合物于90C加熱30分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用微量離心機在10，000rpm下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行須情。B.物理性質和生物活性鱟反應作為通過Endospecy測量黃單胞菌屬發酵的海藻提取物中的糖脂含量的結果，發現每lg濕固體重量的野油菜黃單胞菌褐藻提取物提取約2.2mg糖脂。與葡聚糖的反應衍生自褐藻的組分也包含在每種黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物中，并且不同于衍生自黃單胞菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用利用FungitecGTestMK(SeikagakuCorporation)與p-葡聚糖的反應。黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物對于P-葡聚糖反應是陽性的，然而，衍生自黃單胞菌屬的純化的LPS不反應。即，2邊并不相同。經由黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(NO)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞譜系培養的細胞經由黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。野油菜黃單胞菌提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。關于N0生產，當黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10pM/ml或更多的NO生產。研究在NO生產中經由黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當檢查的黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物依照LPSp濃度以10ng/ml的濃度添加時，NO生產幾乎完全^f皮多粘菌素B的添加抑制。(4)各種黃單胞菌屬植物發酵提取物對功能性食物的實踐應用的例子包含各種黃單胞菌屬植物發酵提取物的糖果的生產作為材料，使砂糖、稠麥芽糖漿、水和在實施例中生產的每種黃單胞菌屬植物發酵提取物(黃單胞菌屬小麥、豆腐廢料或發酵的褐藻提取物)以5:5:5:1的比率混合，并且使混合物于120-160匸加熱至熬稠。使熬稠的混合物在用于冷卻的鋼板上進行冷卻，并且拉伸成條狀，并且塑成具有約lg重量的粒狀以提供糖果。將合適量的這些糖果置于20ml水中并通過加熱進行溶解。測量這種溶液中作為黃單胞菌屬植物發酵提取物的活性組分的脂多糖的量，對于黃單胞菌屬發酵的小麥提取物、黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物和黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物，量分別為3.5pg/g、3.1pg/g和2.4pg/g。這種糖被由于感冒具有咽喉痛的6個男人和女人攝取。緊在其后進行關于咽喉痛的調查。關于咽喉痛，所有6個人感覺咽喉痛由于每種黃單胞菌屬植物發酵提取物而減輕(單樣本符號檢驗p<0.03)。(5)關于各種黃單胞菌屬植物發酵提取物的藥物功效的例子每種黃單胞菌屬植物發酵提取物對特應性皮炎的抑制作用為了檢查每種黃單胞菌屬植物發酵提取物對特應性皮炎的作用，引入I型過敏癥模型。抗二硝基苯基鼠類單克隆抗體(1jag/小鼠)靜脈內注入在1個組中的5只雄性BALB/c小鼠中。l小時后，腹部-皮內施用在實施例中生產的黃單胞菌屬發酵的小麥提取物、黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物和黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物(各50m1/小鼠)。另外1小時后，0.25%含二硝基氟苯的丙酮和橄欖油(4:1)的20p1混合溶液作為變應原應用于小鼠中的耳廓表面和背面。在應用后l、2、24和48小時使用測厚儀測量耳廓的厚度，并且厚度與緊在應用前的厚度的差異(A)反映水腫程度。藥物施用功效通過抑制率=(1-藥物施用后的A耳部水腫/對照中的A耳部水腫)x100進行評估，所述抑制率在變應原施用后1小時觀察到的早期應答和在24小時后誘導的延遲應答中獲得。結果顯示于表中。如從表中顯而易見的，黃單胞菌屬發酵的小麥提取物、黃單胞菌屬發酵的豆腐廢料提取物和黃單胞菌屬發酵的褐藻提取物抑制變應性應答。表2表2各種黃單胞菌屬植物發酵提取物對變應性反應的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例3實施例1包含腸桿菌屬的鱟陽性糖脂的植物發酵提取物通過使植物組分單獨與腸桿菌屬一起發酵獲得的發酵的植物免疫增強提取物(1)發酵的小麥提取物A.生產用小麥培養腸桿菌屬添加小麥粉(0.5g)和鹽(磷酸氬二鈉七水合物1.28g、磷酸二氫鉀O.3g、氯化鈉50mg、氟化銨IOOmg、0.2ml1M石克酸鎂水溶液、0.01ml1M氯化鈣水溶液)以及水以制備總體積100ml。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加陰溝腸桿菌的1個菌落，隨后將其靜置且于30r培養5天。用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器使混合物于90C加熱30分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用微量離心才幾在10，000rpm下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行測量。B.物理性質和生物活性鱟反應作為通過Endospecy測量腸桿菌屬發酵的小麥提取物中的糖脂含量的結果，發現每1g濕固體重量的陰溝腸桿菌提取物提取約1.9mg捵-淀粉反應衍生自小麥的組分也包含在腸桿菌屬發酵的小麥提取物中，并且不同于衍生自腸桿菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用碘淀粉反應。發酵的小麥提取物對于碘淀粉反應是陽性的，然而，衍生自腸桿菌屬的純化的脂多糖不反應。即，2邊并不相同。經由腸桿菌屬發酵的小麥提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(NO)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞鐠系培養的細胞經由腸桿菌屬發酵的小麥提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。陰溝腸桿菌提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當黃單胞菌屬發酵的小麥提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。關于NO生產，當黃單胞菌屬發酵的小麥提取物依據LPSp濃度以10ng/m1或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10mM/m1或更多的N0生產。研究在NO生產中經由腸桿菌屬發酵的小麥提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當依照LPSp濃度檢查的腸桿菌屬發酵的小麥提取物以10ng/ml的濃度添加時，NO生產幾乎完全被多粘菌素B的添加抑制。(2)腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物a.生產添加干豆腐廢料(0.5g)和鹽(磷酸氫二鈉七水合物1.28g、磷酸二氫鉀O.3g、氯化鈉50mg、氯化銨100mg、0.2ml1M硫酸鎂水溶液、0.01ml1M氯化鈣水溶液)以及水以制備總體積100ml。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加陰溝腸桿菌的1個菌落，隨后將其靜置且于30"C培養5天。用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器使混合物于90匸加熱30分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用微量離心機在10，000rpm下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行領'j量。B.物理性質和生物活性鱟反應作為通過Endospecy測量腸桿菌屬發酵的小麥提取物中的糖脂含量的結果，發現每lg濕固體重量的陰溝腸桿菌提取物提取約560jug糖脂。黃色蛋白反應衍生自豆腐廢料的組分也包含在每種腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物中，并且不同于衍生自腸桿菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用黃色蛋白反應。發酵的豆腐廢料提取物對于黃色蛋白反應是陽性的，然而，衍生自腸桿菌屬的純化的脂多糖不反應。即，2邊并不相同。經由腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(N0)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞傳系培養的細胞經由腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。陰溝腸桿菌發酵的豆腐廢料提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。關于N0生產，當腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10pM/ml或更多的N0生產。研究在NO生產中經由腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所迷多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當依照LPSp濃度檢查的腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物以10ng/ml的濃度添加時，NO生產幾乎完全被多粘菌素B的添加抑制。(3)腸桿菌屬發酵的褐藻提取物A.生產添加干裙帶菜粉(O.5g)和鹽(磷酸氫二鈉七水合物l.28g、磷酸二氫郜O.3g、氯化鈉50mg、氯化銨IOOmg、0.2ml1M硫酸23鎂水溶液、0.01ml1M氯化鈣水溶液)以及水以制備總體積100ml。這使用高壓滅菌鍋進行滅菌。向其中添加陰溝腸桿菌的1個菌落，隨后將其靜置且于301C培養5天。B.物理性質和生物活性用熱水提取(提取物)固體含量通過離心從每種培養溶液中進行收集，向這種固體含量中加入等體積的蒸餾水，并使用干式加熱器^f吏混合物于90匸加熱30分鐘。冷卻至室溫后，每種上清液通過使用孩i量離心機在10，000rpm下離心10分鐘進行分離。在這種上清液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行效'J量。鱟反應作為通過Endospecy測量腸桿菌屬發酵的褐藻提取物中的糖脂含量的結果，發現每lg濕固體重量的陰溝腸桿菌發酵的褐藻提取物提取約910pg糖脂。與p-葡聚糖的反應衍生自褐藻的組分也包含在腸桿菌屬發酵的褐藻提取物中，并且不同于衍生自腸桿菌屬的純化的脂多糖。為了證實這點，使用利用FungitecGTestMK(SeikagakuCorporation)與P-葡聚糖的反應。腸桿菌屬發酵的褐藻提取物對于P-葡聚糖反應是陽性的，然而，衍生自腸桿菌屬的純化的LPS不反應。即，2邊并不相同。經由腸桿菌屬發酵的褐藻提取物的腫瘤壞死因子(TNF)生產和一氧化氮(NO)生產及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞鐠系培養的細胞經由腸桿菌屬發酵的褐藻提取物的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行研究。此外，研究這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。陰溝腸桿菌提取物的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。對于TNF生產，與LPSp的情況類似，當腸桿菌屬發酵的褐藻提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。關于N0生產，當腸桿菌屬發酵的褐藻提取物依據LPSp濃度以10ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10)iM/ml或更多的NO生產。研究在NO生產中經由腸桿菌屬發酵的褐藻提取物的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當依照LPSp濃度檢查的腸桿菌屬發酵的褐藻提取物以10ng/ml的濃度添加時，NO生產幾乎完全被多粘菌素B的添加抑制。(4)各種腸桿菌屬植物發酵提取物對功能性食物的實踐應用的例子包含各種腸桿菌屬植物發酵提取物的糖果的生產作為材料，使砂糖、稠麥芽糖漿、水和在實施例中生產的每種腸桿菌屬植物發酵提取物(腸桿菌屬小麥、豆腐廢料或發酵的褐藻提取物)以5:5:5:1的比率混合，并且使混合物于120-160"C加熱至熬稠。使熬稠的混合物在用于冷卻的鋼板上進行冷卻，并且拉伸成條狀，并且塑成具有約lg重量的粒狀以提供糖果。將合適量的這些糖果置于20ml水中并通過加熱進行溶解。測量這種溶液中作為腸桿菌屬植物發酵提取物的活性組分的脂多糖的量，對于腸桿菌屬發酵的小麥提取物、腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物和腸桿菌屬發酵的褐藻提取物，量分別為IO.1pg/g、8.4ng/g和6.8pg/g。這種糖被由于感冒具有咽喉痛的6個男人和女人攝取。緊在其后進行關于咽喉痛的調查。關于咽喉痛，所有6個人感覺咽喉痛由于每種腸桿菌屬植物發酵提取物而減輕(單樣本符號檢驗p<0.03)。(5)關于各種腸桿菌屬植物發酵提取物的藥物功效的例子每種腸桿菌屬植物發酵提取物對特應性皮炎的抑制作用為了檢查每種腸桿菌屬植物發酵提取物對特應性皮炎的作用，引入I型過敏癥模型。抗二硝基苯基鼠類單克隆抗體(1pg/小鼠)靜脈內注入在1個組中的5只雄性BALB/c小鼠中。1小時后，腹部-皮內施用在實施例中生產的腸桿菌屬發酵的小麥提取物、腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物和腸桿菌屬發酵的褐藻提取物(各50y1/小鼠)。另外l小時后，0.25%含二硝基氟苯的丙酮和橄欖油(4:1)的20|li1混合溶液作為變應原應用于小鼠中的耳廓表面和背面。在應用后1、2、24和48小時使用測厚儀測量耳廓的厚度，并且厚度與緊在應用前的厚度的差異(A)反映水腫程度。藥物施用功效通過抑制率-(l-藥物施用后的A耳部水胂/對照中的A耳部水腫)xIOO進行評估，所述抑制率在變應原施用后1小時觀察到的早期應答和在24小時后誘導的延遲應答中獲得。結果顯示于表中。如從表中顯而易見的，腸桿菌屬發酵的小麥提取物、腸桿菌屬發酵的豆腐廢料提取物和腸桿菌屬發酵的褐藻提取物抑制變應性應答。表3表3各種腸桿菌屬植物發酵提取物對變應性反應的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實施例4醋桿菌屬(醋化醋桿菌、醋桿菌屬混合物、葡萄糖酸菌)脂多糖醋桿菌屬物種是全世界廣泛使用，經常被食用并且是制造醋所需的革蘭氏陰性菌。來自用動物材料或植物材料培養的醋桿菌屬的脂多糖迄今仍是未知的。它的生物活性也不同于已知脂多糖的那些。(1)通過用于醋桿菌屬培養的常規方法獲得的醋桿菌屬脂多糖A.生產將醋化醋桿菌或葡萄糖酸菌種植在瓊脂培養基(蛋白胨5.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖5.0g、硫酸鎂七水合物1.0g和瓊脂15.0g/升)上，且于30。C培養2天。向培養瓶中添加醋化醋桿菌或葡萄糖酸菌的1個菌落或0.1ml醋桿菌屬混合物，在所述培養瓶中已加入50ml滅菌的液體培養基(蛋白胨5.0g、酵母提取物5.Og、葡萄糖5.0g和硫酸鎂七水合物1.0g/升)，并且將其靜置且于30C培養5天。培養5天后，向其中已加入50ml培養基的30個培養瓶中添加1ml培養的細菌溶液，并且將其靜置且于30C培養5天。提取作為提取方法，使用Westphal's法。將蒸餾水加入醋化醋桿菌或葡萄糖酸菌或醋桿菌屬混合物的濕微生物細胞中，以制備100mg/ml的終濃度，并且使微生物細胞懸浮。向這種懸浮液中加入等體積的90%苯酚溶液，隨后使其于65-68匸攪動20分鐘。隨后使溶液冷卻至10。C或以下，并且使用高速冷卻離心機在10，000rpm下于4X:離心20分鐘。離心后，僅將上面的水層轉移至另一個容器中，并且將中間層和下面的苯酚層放回原始容器中，向其中添加與收集的水層的量相同量的蒸餾水。將所得到的溶液再次于65-68€攪動20分鐘。隨后，使溶液冷卻至IOX:或以下，并且使用高速冷卻離心機在10，000rpm下于4C離心20分鐘。僅收集上面的水層，并且與先前收集的水層組合。為了去除苯酚對收集的水層實施超濾或透析。每種提取的溶液中包含的糖脂含量通過Endospecy進行測量。B.物理性質和生物活性衍生自醋桿菌屬的脂多糖通過Westphal's法得自醋桿菌屬微生物細胞。在這項研究中，使用3個醋桿菌-屬物種，即醋桿菌屬物種代表的醋化醋桿菌、在制造醋中使用的醋桿菌屬混合物、和葡萄糖酸菌。作為通過Endospecy測量糖脂含量的結果，發現每1g醋化醋桿菌、醋桿菌屬混合物和葡萄糖酸菌的濕微生物細胞已分別提取約5mg、12.5mg和10mg糖脂。為了研究生物活性，嘗試進一步純化所得到的苯酚提取溶液。因為提取溶液中包含的除糖脂外的主要組分是核酸，所以首先用DNA酶且隨后用RNA酶處理溶液。隨后，加入等體積的90%苯酚。將所得到的溶液攪動IO分鐘，且隨后使用高速冷卻離心機在10，000rpni下于4iC離心20分鐘。僅收集上面的水層。為了去除苯酚對收集的水層實施超濾或透析。鱟反應使用用于檢測脂多糖特異性反應且從SeikagakuCorporation商購可得的Endospecy試劑盒，檢查鱟陽性糖脂是否包含在醋化醋桿菌、醋桿菌屬混合物和葡萄糖酸菌中。結果發現每lg醋化醋桿菌、醋桿菌屬混合物和葡萄糖酸菌的濕微生物細胞分別提取約5mg、12.5mg和10mg鱟陽性糖脂。這證實鱟陽性糖脂包含在醋化醋桿菌、醋桿菌屬混合物和葡萄糖酸菌中。分子量進行SDS-PAGE用于分析衍生自醋化醋桿菌或醋桿菌屬混合物的鱟陽性糖脂(脂多糖)的分子量。關于LPSp，觀察到約5，000的條帶，認識到它是低分子的事實。對于衍生自醋化醋桿菌或醋桿菌屬混合物的脂多糖，觀察到約5,000的條帶，暗示這些鱟陽性糖脂(脂多糖)是低分子的。TNF生產和NO生產，及其經由多粘菌素B的抑制巨噬細胞鐠系培養的細胞經由衍生自醋化醋桿菌脂多糖、葡萄糖酸菌脂多糖和醋桿菌屬混合物脂多糖的脂多糖的激活通過測量TNF或NO生產作為指示劑進行檢查。此外，檢查這種激活是否被多粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。醋化醋桿菌脂多糖、葡萄糖酸菌脂多糖和醋桿菌屬混合物脂多糖的增加量由依據基于鱟反應結果轉換的LPSp量的數值表示。關于TNF生產，與LPSp的情況類似，當醋化醋桿菌脂多糖、葡萄糖酸菌脂多糖或醋桿菌屬混合物脂多糖依據LPSp濃度以1000ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。關于NO生產，當醋化醋桿菌脂多糖、葡萄糖酸菌脂多糖或醋桿菌屬混合物脂多糖依據LPSp濃度以10，000ng/ml或更多的濃度添加時，觀察到以濃度依賴性方式的20pM/ml或更多的NO生產。研究在NO生產中經由醋桿菌屬脂多糖的巨噬細胞激活是否被粘菌素B抑制，所述多粘菌素B是脂多糖的抑制劑。與LPSp的情況一樣，當醋化醋桿菌脂多糖、葡萄糖酸菌脂多糖或醋桿菌屬混合物脂多糖依照LPSp濃度以10，000ng/ml的濃度添加時，N0生產幾乎完全被多粘菌素B的添加抑制。TNF使用TLR4刪除的巨噬細胞的TNF生產通過使用刪除TLR4的巨噬細胞，所述TLR4是關于脂多糖的受體，鑒定由醋化醋桿菌脂多糖、葡萄糖酸菌脂多糖或醋桿菌屬混合物脂多糖誘導的巨噬細胞的激活功能減弱。脂多糖經由TLR4將信號傳遞給巨噬細胞，所述TLR4是其呈現在細胞表面上的受體。同時，其為酵母細胞壁的酵母聚糖經由TLR2傳遞信號以激活巨噬細胞。因此，認為當醋桿菌屬中包含的巨噬細胞活化物質是脂多糖時，信號在已刪除TLR4的巨噬細胞中不傳遞，并且因此，巨噬細胞激活被減弱以減少TNF和N0生產。在刪除TLR4的巨噬細胞中，當醋化醋桿菌脂多糖、葡萄糖酸菌脂多糖或醋桿菌屬混合物脂多糖依據LPSp濃度以1000ng/ml或更多的濃度添加時，沒有觀察到TNF生產。這個結果意指巨噬細胞激活被減弱以減少TNF和N0生產。因此，證實TLR4經由醋化醋桿菌脂多糖、葡萄糖酸菌脂多糖或醋桿菌屬混合物脂多糖涉及巨噬細胞激活。醋桿菌屬脂多糖和已知脂多糖之間的功能差異醋化醋桿菌脂多糖和醋桿菌屬混合物脂多糖在TNF生產和N0生產中的劑量依賴性方面完全不同于已知脂多糖，例如，大腸桿菌脂多糖和成團泛菌脂多糖。已知脂多糖，例如，大腸桿菌脂多糖和成團泛菌脂多糖以IOng/ml的濃度(依據基于鱟反應的LPSp濃度)添加時，指出以濃度依賴性方式的10U/ml或更多的TNF生產。同樣在N0生產中，以10ng/ml或更多的濃度的那些指出以濃度依賴性方式的20|nM/ml或更多的N0生產。另一方面，以100ng/ml濃度(依據基于鱟反應的LPSp濃度)的醋化醋桿菌脂多糖和醋桿菌屬混合物脂多糖指出無TNF生產。同樣在NO生產中，^據LPSp濃度以1000ng/ml濃度的醋化醋桿菌脂多糖和醋桿菌屬混合物脂多糖不誘導NO生產。即，這指出醋桿菌屬脂多糖和已知的脂多糖在生物活性方面不同，并且i/v為醋桿菌屬脂多糖作為物質是新型的。(2)醋桿菌屬脂多糖對功能性食物的實踐應用的例子包含醋桿菌屬脂多糖的糖果的生產作為材料，使砂糖、稠麥芽糖漿、水和在實施例2中生產的醋化醋桿菌脂多糖以5:5:5:1的比率混合，并且使混合物于120-160匸加熱至熬稠。使熬稠的混合物在用于冷卻的鋼板上進行冷卻，并且拉伸成條狀，并且塑成具有約1g重量的粒狀以提供糖果。將合適量的這些糖果置于20ml水中并通過加熱進行溶解。測量這種溶液中作為醋化醋桿菌的活性組分的脂多糖的量，量為2.1pg/g。這種糖被由于感冒具有咽喉痛的6個男人和女人攝取。緊在其后進行關于咽喉痛的調查。關于咽喉痛，所有6個人感覺咽喉痛被減輕(單樣本符號檢驗p<0.03)。(3)關于醋桿菌屬脂多糖的藥物功效的例子醋桿菌屬脂多糖對特應性皮炎的抑制作用為了檢查醋化醋桿菌脂多糖對特應性皮炎的作用，引入I型過敏癥模型。抗二硝基苯基鼠類單克隆抗體(1pg/小鼠)靜脈內注入在1個組中的5只雄性BALB/c小鼠中。1小時后，腹部-皮內施用在實施例中生產的醋化醋桿菌脂多糖(各50jil/小鼠)。另夕卜l小時后，0.25%含二硝基氟苯的丙酮和橄欖油(4:1)的20p1混合溶液作為變應原應用于小鼠中的耳廓表面和背面。在應用后l、2、24和48小時使用測厚儀測量耳廓的厚度，并且厚度與緊在應用前的厚度的差異(△)反映水腫程度。藥物施用功效通過抑制率-(1_藥物施用后的A耳部水腫/對照中的A耳部水腫)xl00進行評估，所述抑制率在變應原施用后1小時觀察到的早期應答和在24小時后誘導的延遲應答中獲得。結果顯示于表中。如從表中顯而易見的，醋化醋桿菌脂多糖通過皮內施用或口部施用同樣抑制變應性應答。表4表4醋化醋桿菌醋化醋桿菌對變應性反應的抑制作用用于施用脂多糖的方法劑量(小鼠)抑制率(％)(1小時后)抑制率(％)(24小時后)皮內施用85.2100口部施用55.358.4本文引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用整體合并入本文。30權利要求1.發酵和培養的方法，其特征在于用醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、黃單胞菌屬、發酵單胞菌屬或腸桿菌屬使來自可食用植物的材料發酵，所述菌屬是具有免疫增強功能的可食用革蘭氏陰性細菌，同時培養所述細菌。2.植物發酵提取物，其特征在于，其通過根據權利要求1的發酵和培養的方法獲得。3.植物發酵提取物粉末，其特征在于，其得自根據權利要求2的植物發酵提取物。4.植物發酵提取物組合物，其特征在于，其包含根據權利要求2的植物發酵提取物或根據權利要求3的植物發酵提取物粉末。5.根據權利要求4的植物發酵提取物組合物，其特征在于，所述植物發酵提取物組合物選自藥物、用于動物的藥物、準藥物、化妝品、食物、功能性食物、飼料和沐浴劑。6.根據權利要求5的植物發酵提取物組合物，其特征在于，所述植物發酵提取物組合物顯示抗炎性腸病作用、抗過敏性疾病作用、鎮痛作用、抗癌作用、降低膽固醇作用、降低血糖作用、天然愈合能力增強作用或免疫增強作用。7.脂多糖，其特征在于，其得自用根據權利要求1的發酵和培養的方法培養的所述細菌。8.用于制備脂多糖的方法，其特征在于，從根據權利要求1的發酵和培養的方法培養的所述細菌獲得所述脂多糖。9.脂多糖，其特征在于，其得自醋桿菌屬。10.用于制備脂多糖的方法，其特征在于，從醋桿菌屬獲得所述脂多糖。全文摘要為了提供廉價地無需使用衍生自動物的組分用于培養具有被食用的經驗含免疫增強劑的生物的方法，使用主要由小麥或豆腐廢料組成的培養溶液來培養醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、黃單胞菌屬、發酵單胞菌屬或腸桿菌屬，所述菌屬是具有免疫增強功能的可食革蘭氏陰性菌。因此，醋桿菌屬可以廉價且安全地獲得，并且其為免疫增強劑的低分子量脂多糖也可以廉價且安全地獲得。此外，不混合衍生自動物組分的雜質。文檔編號A61P37/04GK101360829SQ20068005147公開日2009年2月4日申請日期2006年11月28日優先權日2005年11月28日發明者杣源一郎,河內千惠,稻川裕之,西澤孝志申請人:杣源一郎;生物醫學研究集團有限公司