專利名稱：一種微生物聯合發酵制備牛蒡子提取物的方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵制備中藥材提取物的方法技術領域，具體涉及一種微生物聯合發酵制備牛蒡子提取物的方法。
背景技術：
牛蒡子(Fructus Arctii),主要含有牛蒡苷(Arctiin)和牛蒡子苷元(ArCtigenin，ACT)等木脂素類化合物。牛蒡苷在體內被分解為牛蒡子苷元而產生眾多藥理作用。牛蒡子苷元具有顯著的抗菌，抗病毒，抗腫瘤，抗炎及鈣拮抗活性。且牛蒡子苷元來源豐富，其前體牛蒡苷在中藥牛蒡和毛頭牛蒡果實中含量較高，具有很高的新藥開發價值。目前國內已有利用蝸牛酶對提取的牛蒡苷進行體外酶解的報道，但存在一些不足:工藝復雜、成本 過高；而早期研究早已證明木脂素類化合物在酸或堿的情況下可以分解，但會發生異構化，改變原有的結構，從而引起藥效的降低。因此，本申請人擬采用微生物聯合發酵的方法制備牛蒡子苷元提取物，利用微生物產生豐富的酶系，在溫和條件下分解轉化物質的能力強，比一般的物理或化學的炮制手段更大幅度地改變藥性，提高療效，降低毒副作用，擴大適應癥。同時還具有減少環境污染、降低生產成本等優點，在體外可控條件下溫和地將牛蒡苷有效地轉化成牛蒡子苷元，以達到產業化生產轉化，有效地提高了牛蒡子提取物中牛蒡子苷元的含量。
發明內容
針對現有技術中存在的不足，本發明的目的在于提供了一種微生物聯合發酵制備牛蒡子提取物的方法。本發明的目的通過以下技術方案得以實現:一種微生物聯合發酵制備牛蒡子提取物的方法，其特征在于:所述微生物為泡盛曲霉變種和里氏木霉菌。進一步，所述泡盛曲霉變種和里氏木霉菌和分別為泡盛曲霉變種Aspergillusawamori var.CICC2203 和里氏木霉 Trichoderma reesei CICC40932。進一步，所述泡盛曲霉變種和里氏木霉菌的接種量比為1:2。與現有技術相比，本發明方法的優點和有益效果在于:1、采用微生物發酵法制備牛蒡子提取物，與體外酶解法制備牛蒡子提取物相比，工藝簡單，成本低，不發生結構異化，完整地保持了牛蒡子提取物有效成分的原有化學結構，保持提取物的優良藥效;2、采用微生物發酵法制備牛蒡子提取物，與物理或化學方法制備牛蒡子提取物相t匕，在溫和條件下利用微生物產生豐富的酶系、分解轉化物質能力強的優點，大幅度地改變藥性，提高了有效成分的轉化效率和療效，降低毒副作用，擴大適應癥，大大地減少了有機試劑對生態環境的污染；3、本發明采用微生物聯合發酵的方法，確定泡盛曲霉變種和里氏木霉菌為最佳發酵組合，與單一菌株發酵相比，很大程度上提高了牛蒡子中牛蒡苷轉化為牛蒡子苷元的轉化率，達到99.9%，有效地解決了牛蒡苷轉化為牛蒡子苷元轉化率低的問題，為牛蒡子提取物產業化生產解決了技術難題。
圖1是牛蒡子苷元色譜圖；圖2是不同菌種及其組合發酵效果比較結果圖；圖3是碳源對發酵效果的影響示意圖；圖4是氮源對發酵效果的影響示意圖；圖5是時間對發酵效果的影響示意圖；圖6是裝液量對發酵效果的影響示意圖；圖7是pH對發酵效果的影響示意圖；圖8是接種量對發酵效果的影響示意圖；圖9是正交試驗優化結果示意圖。
具體實施例方式以下內容用于進一步闡述本發明的技術方案，以使本領域技術人員對本發明有更深入的理解，但以下內容不應以任何方式被理解為對本發明權利要求書請求保護范圍的限制。本研究室主要從事中獸藥和動物疾病方面的研究，牛蒡子是我國的傳統中藥瑰寶，具有很高的藥用價值，本研究室前期的研究發現牛蒡子苷元具有良好的抗圓環病毒的特性，同時還具有良好的抗炎、免疫調節等作用，牛蒡子苷元這些優良的藥用特性，增加了我們濃厚的研究興趣，準備開發為國家新獸藥。但牛蒡子苷元的規模化提取成為我們的巨大難題，目前在國內外也沒有很好解決這一難題，我們采用化學提取方法，成功地在實驗室制得了牛蒡子苷元純品，但工藝復雜，成本高，大量化學試劑污染環境，無法實現大規模生產。在采用微生物單菌株發酵的時候，做了多次試驗，效果均不理想；在一次發酵試驗中，突然發現有一組試驗結果中牛蒡苷轉化為牛蒡子苷元的轉化率相當高，轉化率幾乎達到100%，最后發現是在平板接種的過程中，里氏木霉菌種平板中混入了泡盛曲霉變種孢子所致，于是我們擬采取聯合發酵，后面的試驗進一步確證了試驗結果。菌種的選擇確實具有很強的目的性，所選取的菌種都是一些常用的，從古至今，人們在生產、生活中都在利用這些真菌進行微生物發酵，微生物可以產生豐富的酶系，因而有著在溫和條件下非常強大的分解轉化物質的能力，并能產生豐富的次生代謝產物，通過微生物的生長代謝和生命活動來發酵炮制中藥，可以比一般的物理或化學的炮制手段更大幅度地改變藥性，提高療效，降低毒副作用，擴大適應癥。同時還具備減少環境污染、減低生產成本等優點。基于微生物所具有的上述獨特優點，本研究采用體外微生物發酵法模擬體內腸道微生物轉化的方式對牛蒡苷進行有效的轉化而生成牛蒡子苷元，利用篩選保藏的這六株β_葡萄糖苷酶的高產菌株與牛蒡子進行共發酵， 利用微生物的酶系作用使牛蒡子苷的糖苷鍵斷裂而生成牛蒡子苷元和葡萄糖。在體外可控條件下溫和地實現將牛蒡苷轉化為牛蒡子苷元，以達到向產業化生產轉化，有效地提高牛蒡子提取物中牛蒡子苷元的含量。
I試驗材料1.1 菌種海率曲霉Aspergillus phoenicis CICC2216 ;里氏木霉 Trichoderma reeseiCICC40932 ;泡盛曲霉變種 AspergiIIus awamori var.CICC2203 ;米曲霉 AspergiIIusoryzae CICC2014購買于中國工業微生物菌種保藏管理中心。黑曲霉Aspergillus nigerATCC16404 ;綠色木霉Trichoderma viride CICC41495由華中農業大學生命科學技術學院郝勃教授饋贈。1.2儀器與設備超凈工作臺(SW-CJ-1FD)，JY2002型電子天平，高壓滅菌鍋，恒溫培養箱，恒溫培養搖床，安捷倫1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，KQ-100B型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司生產)，SZ-93型自動雙重純水蒸餾器，RE-5203A型旋轉蒸發儀(上海精密科學儀器有限公司)，AUY120型分析天平(日本Shimadzu公司)，CS101型電熱鼓風干燥箱(重慶試驗設備廠)，顯微鏡，pH計，電磁攪拌器,索氏回流裝置,錐形瓶(2501111^、501]11^),容量瓶，血球計數板，玻璃球，毛細管，展開室，移液管，移液槍，試管，脫脂棉，紗布。1.3藥物與試劑
牛蒡子苷元對照品，純度> 99%，批號120307，牛蒡苷對照品，純度> 99%，批號110107，上海融禾醫藥科技發展有限公司；牛蒡子粉(200目)，批號20110402，武漢強康藥業有限公司；麩皮、玉米粉、豆柏粉，批號20120302，武漢安佑飼料有限公司；鹿糖、甲醇、乙醇、三氯甲烷、冰醋酸、正丁醇、葡萄糖、瓊脂、無菌水、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、尿素、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鈷、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、吐溫80、蛋白胨，分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；GF254硅膠板，批號20120108，青島海洋化工有限公司。2試驗方法2.1培養基的制備2.1.1平板培養基PDA (Potato Dextrose Agar)其做法是先將馬鈴薯洗凈去皮,再稱取200g切成小塊，加水煮爛(煮沸20-30min,能被玻璃棒戳破即可),用四層紗布過濾，向濾液中加入20g葡萄糖和15g瓊脂，再補足水分至1000mL，12rC滅菌15min，制成平板培養基，冷卻后貯存備用。2.1.2種子培養基Mandel營養液:磷酸二氫鉀2g,硫酸銨1.4g,尿素0.3g,硫酸鎂0.3g,氯化隹丐
0.3g,硫酸鐵5mg,硫酸猛1.56mg,硫酸鋅1.4mg,氯化鈷0.2mg,無菌水定容至1000mL。向Mandel營養液中加入吐溫802mL/L,蛋白胨lg/L,葡萄糖10g/L,用硫酸調pH至
5.0-6.0，115°C滅菌20min，得到種子培養液。2.1.3發酵培養基 稱取牛蒡子粉8g，麩皮5g，玉米粉5g，蛋白胨0.6g，裝入250mL錐形瓶中，121 °C滅菌15min。然后加入無菌Mandel營養液20mL，并注入無菌水將裝液量定容為130mL，121°C滅菌15min。2.2菌種的活化
菌種凍干粉存儲于真空干燥管內并低溫保存，取出后恢復至室溫，轉移至超凈工作臺內。以沾有75%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加熱外管尖端。滴數滴無菌水于加熱處，使外管破裂。取出隔熱纖維質和內管，以滅菌過的鑷子取出內管棉塞。用無菌吸管吸取
0.3-0.5mL無菌水，滴入內管內，待干燥粉末溶解后，以無菌吸管吸取并滴入約含有5mL無菌水的滅菌試管內，輕微震蕩使其均勻后，靜置30-60min。取0.1-0.2mL菌體懸浮液均勻涂布于制作好的PDA平板培養基上,做分離培養，培養溫度為28-30°C。檢驗菌種純度及活化情況。2.3種子菌液的制備取活化好的菌種，采用無菌操作對PDA平板培養基進行接種。于培養箱內，28-30°C培養5-6d。培養完成后即可產生成熟孢子。取已培養好的菌種平板，加入IOml無菌水，輕輕晃動將瓊脂表面的孢子沖下，將該孢子懸浮液置于已滅菌50ml錐形瓶內，瓶中預先放置數粒無菌玻璃球，充分振搖后用滅菌的三層紗布進行過濾，并用無菌水沖洗濾渣2-3次，最終使濾液體積達到10.0ml，待測孢子懸浮液即得。將孢子懸浮液用無菌水稀釋100-1000倍，吸取適量的稀釋液至血球計數板的計數室內，然后加上蓋玻片，靜置約5mi·n，先在低倍鏡下找到計數室，再轉換成高倍鏡觀察并計數。計算孢子濃度，并將其配制成濃度為IO6-1O7個/mL的孢子懸浮液備用。取50mL制備好的種子培養基置于250mL錐形瓶中，吸取2mL制備好的IO6-1O7個/mL的孢子懸浮液進行接種。175rpm，28-3(TC條件下培養l_2d，即得種子菌液。2.4牛蒡子粉中牛蒡苷與牛蒡子苷元的含量測定2.4.1標準液的配制 精確稱取牛蒡苷標準品4.59 mg、牛蒡子苷元標準品11.68 mg溶解于25mL甲醇中，配制成牛蒡苷與牛蒡子苷元標準品摩爾濃度分別為3.435X10_4mmol/L和
1.246 X I(T3HimoI/L的混合標準溶液。2.4.2色譜檢測條件發酵所得樣品采用Agilent高效液相色譜儀，280nm波長下進行檢測；圖1為泡盛曲霉變種和里氏木霉菌組合發酵樣品中牛蒡子苷元色譜行為。2.4.2牛蒡苷及牛蒡子苷元的提取稱取8g牛蒡子粉，用10倍質量的80%乙醇進行回流提取，提取3次，每次lh。合并3次的提取液，用旋轉蒸發儀蒸干后，取出燒瓶里的浸膏并烘干，用50mL甲醇定容，制成待測溶液。按相同方法提取三份平行樣品。按上述HPLC條件，對提取物進行檢測。采用外標法分別計算牛蒡子粉中牛蒡苷與牛蒡子苷元的物質的量濃度(Ctll與Ctl2),從而作為未經發酵藥物原粉對照樣品，按下式計算經過發酵藥粉的轉化率，溶出率及損失率。T (%) = (C01-Cel) /C01X 100 ；S (%) = (Cel+Ce2) / (C01+C02) X 100 ；L (%) =100%-S (%)式中:T-轉化率；S_溶出率；L_損失率Ktll-未經發酵藥粉中牛蒡苷物質的量濃度(mol/mL) 經過發酵藥粉中牛蒡苷物質的量濃度(mol/mL) Kci2-未經發酵藥粉中牛蒡子苷元物質的量濃度(mol/mL) ;(^2_經過發酵藥粉中牛蒡子苷元物質的量濃度(mol/mL)。
2.5牛蒡子粉的發酵炮制2.5.1發酵菌種的篩選分別將制備好的海棗曲霉CICC2216，里氏木霉CICC40932，泡盛曲霉變種CICC2203，米曲霉CICC2014，黑曲霉ATCC 16404和綠色木霉CICC 41495種子菌液按下表I所示接種量及排列組合接種至已配制好的發酵培養基內，每組做3個平行樣品。28-30°C，175rpm,發酵時間為168h。表I接種試驗表
權利要求
1.一種微生物聯合發酵制備牛蒡子提取物的方法，其特征在于:所述微生物為泡盛曲霉變種和里氏木霉菌。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述泡盛曲霉變種和里氏木霉菌和分別為泡盛曲霉變種awamori var.CICC2203 取里氏木霉 Trichoderma reeseiCICC40932。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述泡盛曲霉變種和里氏木霉菌的接種量比為1:2。
全文摘要
本發明屬于微生物發酵制備中藥材提取物的方法技術領域，具體公開了一種微生物聯合發酵制備牛蒡子提取物的方法。本發明采用泡盛曲霉變種Aspergillusawamorivar.CICC2203和里氏木霉TrichodermareeseiCICC40932聯合發酵來制備牛蒡子提取物，并對發酵工藝條件進行了優化研究，很大程度上提高了牛蒡子中牛蒡苷轉化為牛蒡子苷元的轉化率，達到99.9%，有效地解決了牛蒡苷轉化為牛蒡子苷元轉化率低的問題，為牛蒡子提取物產業化生產解決了技術難題。
文檔編號C12R1/665GK103233056SQ20131011409
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月2日 優先權日2013年4月2日
發明者陳潔, 何斌, 陸征, 操繼躍, 錢運國, 楊文海, 童新紅, 葉勝強, 韓艷云, 童偉文, 陶弼菲, 夏瑜, 孫書林 申請人:武漢市畜牧獸醫科學研究所