一種脫細胞板層角膜基質片的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學的組織工程技術領域，具體涉及一種脫細胞板層角膜基質片 的制備方法。
【背景技術】
[0002] 角膜病是常見的致盲性眼病之一，臨床上各種因素所致的角膜炎癥和角膜損傷 均可致角膜缺損、糜爛和潰瘍，若得不到有效治療，則將嚴重損傷患者的視功能和生活質 量。據世界衛生組織報告，目前角膜病是引起視力喪失的第二位主要病因，僅次于白內障， 每年因角膜潰瘍、眼外傷等造成的新增角膜盲為150萬至200萬，嚴重威脅著患者的健康。 治療角膜盲的唯一有效方法是角膜移植術。但是由于宗教信仰、風俗習慣的影響，身故后 捐獻角膜者甚少；加上人類免疫缺陷病毒（HIV)、乙肝病毒、狂犬病毒、克雅氏病毒可以通 過植片傳播、角膜屈光手術、人口老齡化等原因使角膜供體材料嚴重不足，極大地限制了角 膜盲患者脫盲。我國角膜移植的對象大部分為嚴重感染、化學傷等高危角膜移植患者，術 后的免疫排斥反應發生率高達60% -90%，由于角膜材料來源不足、免疫排斥反應、角膜移 植并發癥等因素嚴重限制了角膜移植技術的開展。隨著角膜外傷、腫瘤、化學燒傷（堿燒 傷）、血管化嚴重干眼癥、角膜緣干細胞缺乏、免疫性疾病、角膜移植排斥反應等患者人數的 增多，角膜材料的來源也就成為了目前眼科醫生存在的一個棘手的問題。如何高質量長時 間維持板層角膜替代物在眼內的功能，尋找一種能達到理想狀態的角膜替代物也就成了當 前眼科界研究的一個熱點。然而，目前國內外研制的各種種子細胞支架材料在角膜曲率及 地形圖，生物相容性、強度、降解率、透明性、同源性、抗原性及病原性等性能方面均存在著 缺陷。而被認為最有研究前景的為經過脫細胞處理的異種角膜基質片，但是目前常用脫細 胞方法步驟煩瑣，過程復雜，易損傷組織結構，嚴重影響了角膜的透明度而使效果欠佳。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是要提供一種脫細胞板層角膜基質片的制備方法，與現有技術相比 制作過程簡單、時間較短，無需使用外源性酶，使得經過本方法研制的角膜基質片透明度 高、結構破壞少、生物相容性好、性能與新鮮角膜接近，是一種脫細胞徹底的生物支架材料， 可用于角膜移植各種供體材料的替代物，取材方便，安全性強，能被廣大患者接受并長期應 用于臨床。
[0004] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：
[0005] -種脫細胞板層角膜基質片的制備方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟一，取新鮮動物眼球進行消毒；
[0007] 步驟二，消毒后用蘸有酒精的濾紙處理，然后擦除去凈上皮細胞層；
[0008] 步驟三，在手術顯微鏡下做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分離前層角膜，分離完全 后用角膜剪剪下前層角膜；
[0009] 步驟四，用角膜環鉆取出板層角膜；
[0010] 步驟五，將新鮮板層角膜經過血清浸泡，然后將浸泡后的板層角膜基質片進行漂 洗或冰浴電泳處理；
[0011] 步驟六，將漂洗或電泳處理完畢的板層角膜基質片進行梯度脫水，即得到未干燥 板層組織工程角膜支架，采用環氧乙烷滅菌處理，保存備用；
[0012] 步驟七，將未干燥角膜基質片放于24孔板內進行干燥，得到干燥脫細胞板層角 膜；
[0013] 步驟八，將干燥后的樣品進行鈷60消毒，進行復水處理，得到復水板層角膜基質 片，即得所述的板層組織工程角膜基質支架，保存備用。
[0014] 進一步，在步驟一中，將新鮮動物眼球采用碘伏浸泡或含抗菌素的PBS浸泡的方 式進行消毒，浸泡后采用PBS沖洗三次，每次沖洗5min。
[0015] 進一步，在步驟三中，在手術顯微鏡下用寶石刀做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分 離前層角膜，分離完全后用角膜剪剪下前層角膜，角膜緣切口深約1/3,厚為0. 2-0. 8mm，長 為3mm，分離的板層厚度為0. 2-0. 8mm。
[0016] 進一步，在步驟五中，浸泡所用血清為人新鮮血清或人滅活血清，將板層角膜基質 片放于裝有人新鮮血清或人滅活血清的密閉無菌培養皿或EP管內浸泡，浸泡時間為12-30 小時。
[0017] 進一步，將板層角膜基質片放于裝有人新鮮血清或人滅活血清的密閉無菌培養皿 或EP管內浸泡的時間為16-24小時。
[0018] 進一步，在步驟五中，進行漂洗采用的漂洗液為等滲液，漂洗液選自PBS，林格氏液 或生理鹽水，漂洗時間為0. 5-5小時。
[0019] 進一步，在步驟五中，進行漂洗的時間為1-2小時。
[0020] 進一步，在步驟五中，冰浴電泳所用電泳液為TA電泳液，將整個電泳槽放于密閉 消毒盒內進行冰浴電泳，3_5°C恒溫冰箱內進行冰浴電泳，電泳的時間為I. 5_2hs,電泳的 電壓為為120-150V ;其中I X TA溶液配置方法：將4. 84g TrisBase溶于100mL雙蒸水中， 滴加 I. 142ml冰醋酸，然后加雙蒸水至1L。
[0021] 本發明通過單純使用物理及生物學方法來進行組織脫細胞，不使用任何有毒化學 試劑，同時完全保留了天然角膜基質的膠原結構。利用動物源性的角膜在人血清中引起的 體外急性排斥反應脫細胞方法去除基質細胞的核酸及蛋白成分；利用漂洗或電泳的方法將 細胞殘留碎屑和帶電成分去除干凈，達到徹底去除了支架材料的抗原成分的目的，通過完 全電泳出殘留的核酸成分和C〇60消毒的方法去除了支架材料的病原性。為了能達到開發 產品的要求，在脫細胞處理的各個環節如時間、溫度、電壓、如何保證無菌及電解液、漂洗液 的配置等方面均經過詳細周密的設計和反復嚴格的摸索；通過一系列制作過程的反復改良 和優化，使本發明具有以下優點：
[0022] (1)采用本發明的技術方案，制作流程簡單可靠，時間短且易于實施；
[0023] (2)板層組織工程角膜支架來源廣泛，成本低，使用方便；
[0024] (3)采用本發明技術方案制作的板層組織工程角膜支架，經過血清浸泡不含有對 人體有潛在危害的毒性物質，如去污劑等，具有可加工性，便于根據需要加工成不同屈光 度；
[0025] (4)采用本發明的技術方案，脫細胞徹底，采用電泳方法能最小的減少角膜基質骨 架細胞外基質的破壞，不留有任何核酸物質及可溶性蛋白成分，表面由IV型膠原構成的前 彈力層以及基底膜得以保留，有利于自體細胞增殖爬行；
[0026] (5)采用本發明技術方案制作的板層組織工程角膜支架，具有良好的生物相容性 和極低的免疫原性，移植后不引起免疫排斥反應；生物學性質檢測（透明度、含水量、膨脹 率、最大拉伸長度），顯微結構觀察及視光學檢測，結果發現此種材料與人角膜基質極其相 近；
[0027] (6)本發明方法不僅有利于優化動物角膜基質脫細胞條件，同時將為組織工程角 膜產業化提供重要的技術支持。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發明提供的脫細胞板層角膜基質片的制備方法的實現流程圖；
[0029] 圖2是經過本發明方法制作的未干燥脫細胞豬板層角膜基質片的DAPI染色結 果；
[0030] 圖3是經過浸泡于A型血清的板層角膜基質片各時間點殘留細胞核數的比較結 果；
[0031] 圖4是經過本發明方法制作的未干燥脫細胞豬板層角膜基質片的DNA Gel結果；
[0032] 圖5是經過本發明方法制作的未干燥豬板層角膜基質片在兔角膜中央囊袋內平 鋪術后2月后的裂隙燈照片；
[0033] 圖6是經過本發明方法制作的未干燥豬板層角膜基質片用于兔眼角膜移植術后 40天的裂隙燈照片。
【具體實施方式】
[0034] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明， 并不用于限定發明。
[0035] 圖1示出了本發明實施例提供的脫細胞板層角膜基質片的制備方法的實現流程。 該方法包括以下步驟：
[0036] 在步驟SlOl中，取新鮮動物眼球進行消毒；
[0037] 在步驟S102中，消毒后用蘸有酒精的濾紙處理，然后擦除去凈上皮細胞層；
[0038] 在步驟S103中，在手術顯微鏡下做角膜緣切口，伸入虹膜恢復器分離前層角膜， 分離完全后用角膜剪剪下前層角膜；
[0039] 在步驟S104中，用角膜環鉆取出板層角膜；
[0040] 在步驟S105中，將新鮮板層角膜經過血清浸泡，然后將浸泡后的板層角膜基質片 進行漂洗或冰浴電泳處理；
[0041] 在步驟S106中，將漂洗或電泳處理完畢的板層角膜基質片進行梯度脫水，即得到 未干燥板層組織工程角膜支架，采用環氧乙烷