專利名稱：黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的新用途。
背景技術：
黃芩素(黃芩苷元，Baicalein，BAI)是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的有效成份之一，其結構如式(I)所示，為黃色針狀結晶，熔點為268℃-272℃(甲醇)，臨床主要用于治療各種急、慢性炎癥。有報道黃芩素對尖孢鐮刀菌和白色念珠菌有抑制作用(周立剛等，黃酮和甾體類化合物的抗真菌活性，天然產物研究與開發，1997，3P24)，但其抗真菌活性較弱，所需的有效藥物濃度較高。
吡咯類抗真菌藥物包括咪唑組(imidazoles)和三唑組。咪唑組中有酮康唑、克霉唑、咪康唑、益康唑等。三唑組抗真菌藥國內已上市者有氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑等。目前，臨床常用的抗真菌藥物是氟康唑、酮康唑、咪康唑，它們雖然能有效治療深部及淺表部真菌感染。但由于臨床耐藥菌株的越來越普遍，導致這些抗真菌藥物無效或需加大用藥量，而用藥量的增加必然加大了毒副作用的產生。例如酮康唑因其肝臟、心臟毒性而使治療中斷因而限制了其臨床應用。因此，在不增加抗真菌藥物用量甚至在減少用藥量的情況下，利用增效劑有效治療真菌感染特別是耐藥性真菌感染具有重要的臨床應用價值。
至今尚未見黃芩素作為氟康唑、酮康唑、咪康唑等吡咯類抗真菌藥物增效劑的報道。
發明內容
本發明的目的是在不增加抗真菌藥物用量甚至在減少用藥量的情況下，尋找新的增效劑以有效治療真菌感染特別是耐藥性真菌感染。
本發明提供了黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的新用途，所說的抗真菌藥物是吡咯類抗真菌藥物，黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量為4-16微克/毫升或微克/毫克。
上述黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量優選為8微克/毫升或微克/毫克、16微克/毫升或微克/毫克。
上述的抗真菌藥物為咪唑類抗真菌藥物或三唑類抗真菌藥物。
上述的抗真菌藥物為氟康唑、酮康唑或咪康唑。
上述應用中，每毫升液體制劑(或每毫克固體制劑)中加入黃芩素4-16微克，同時加入氟康唑、酮康唑或咪康唑0.125-0.5微克。
經實驗證明，黃芩素在較低濃度時具有明確的增效作用，對于臨床分離的耐藥性菌株和實驗室誘導的耐藥性菌株，當抗真菌藥物與黃芩素合用時，能明顯降低抗真菌藥物的用藥劑量，不僅能在減少用藥量的情況下同樣確保其對淺表部或深部真菌感染的治療效果，并能使抗真菌藥物恢復對耐藥真菌的作用。因此可用作抗真菌藥物的增效劑，用于不同深部和淺表真菌感染的治療。
本發明為黃芩素開辟了新用途，也為吡咯類抗真菌藥物特別是氟康唑、酮康唑、咪康唑等提供了一種有效的增效劑。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明的實施不限于此。
實施例1黃芩素和氟康唑合用對不同臨床真菌株的作用。
材料和方法1.試藥黃芩素購自Sigma公司。
氟康唑常州第二制藥廠。
二甲亞砜中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。
黃芩素用二甲亞砜配成32mg/ml的濃度，氟康唑的濃度為2mg/ml，受試藥物于-20℃保存。實驗前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進行藥效學試驗。
2.菌株白念珠菌、克柔氏念珠菌和羊毛狀小孢子菌臨床株由上海長海醫院真菌室提供，分別采自該醫院不同科室臨床樣本，并經形態學和生化學鑒定。也可以選用白念珠菌SC5314、ATCC76625國際標準菌株。
所有實驗用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養基(SDA)劃板活化，于35℃培養1周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置SDA斜面，用上述方法培養后于4℃保存備用。
3.培養液RPMI 1640培養液RPMI 1640(Gibco BRL公司)10.0g，NaHCO32.0g，嗎啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH調pH至7.0，定容至1000ml，濾過消毒，4℃保存。
沙堡葡萄糖瓊脂(SDA)培養基蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，調整pH至7.0，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。
YEPD培養液酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。
4.儀器隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；THZ-82A臺式恒溫振蕩器(上海躍進醫療器械廠)；511型酶標分析儀(上海第三分析儀器廠)；5.菌液制備(1)念珠菌菌液從4℃保存的SDA培養基上挑取念珠菌少量，接種至1mlYEPD培養液，于30℃以200rpm振蕩培養活化，使真菌處于指數生長期后期。取該菌液至1mlYEPD培養液中，用上述方法再次活化16小時后，用血細胞計數板計數，以RPMI 1640培養液調整菌液濃度至3×103～5×103個/ml的濃度。
(2)羊毛狀小孢子菌菌液從4℃保存的SDA培養基上挑取絲狀菌少量接種至SDA斜面，于35℃培養一周后，再次挑取少量接種至SDA斜面，于35℃培養一周。實驗前加適量RPMI 1640培養液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游離于RPMI 1640培養液中，然后經四層無菌紗布過濾。培養液經血細胞計數板計數后，加RPMI 1640培養液調整孢子濃度至3×103～5×103個/ml的濃度。
6.藥敏板制備取無菌96孔板，于每排1號孔加RPMI1640培養液100μl作空白對照；3-11號孔加入新鮮配制的菌液100μl；2號孔分別加入菌液196μl和6.4mg/ml的氟康唑溶液2μl。在2號孔加入相應濃度的黃芩素2μl，3-11號孔加入黃芩素1μl。
對2～11號孔進行倍比稀釋，使2～11號孔的最終氟康唑濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml；1號孔為不含藥物的RPMI 1640培養液，作為陰性對照，12號孔為不含藥物的菌液，作為陽性對照。各藥敏板于30℃培養。
7.MIC80值判定含菌96孔板分別于30℃培養24小時或一周后，用酶標分析儀于620nm測各孔OD值。與陽性對照孔比，以OD值下降80％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC80(真菌生長80％被抑制時的藥物濃度)。
當藥物的MIC80值超過測定濃度范圍時，按以下方法進行統計MIC80值高于最高濃度64μg/ml時，計為“＞64μg/ml”。上述實驗均平行操作2到3次，當MIC80值能準確重復時才被接受；當MIC80值相差一個濃度以上時，則需要新實驗，直到符合要求為止。
實驗結果見表1，表2。
表1黃芩素與氟康唑合用對5株臨床白念珠菌的MIC80值
注Flu表示氟康唑，BAI表示黃芩素(下同)。
表2黃芩素與氟康唑合用對3株臨床克柔氏念珠菌和羊毛狀小孢子菌的MIC80值
由表1和表2可見，8μg/ml的的黃芩素可使白念珠菌對氟康唑的MIC80值下降2-8倍，16μg/ml的的黃芩素可使臨床克柔氏念珠菌和羊毛狀小孢子菌對氟康唑的MIC80值從≥32降為≤0.5，說明黃芩素能明顯增強氟康唑的抗真菌作用。
實施例2黃芩素與氟康唑合用對不同臨床和實驗室誘導耐藥株的作用材料和方法1.試藥黃芩素購自Sigma公司。
氟康唑常州第二制藥廠。
二甲亞砜中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。
黃芩素用二甲亞砜配成32mg/ml的濃度，氟康唑的濃度為2mg/ml，受試藥物于-20℃保存。實驗前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進行藥效學試驗。
2.菌株臨床耐藥株白念珠菌均由上海長海醫院真菌室提供，分別采自該醫院不同科室臨床樣本，并經形態學和生化學鑒定。
實驗室誘導耐藥株白念珠菌(SC5314-R、Y01-R)為白念珠菌標準株SC5314、ATCC76625經氟康唑誘導形成的耐藥株，經形態學和生化學鑒定。
其它實驗步驟與方法同實施例1。
實驗結果見表3，表4。
表3黃芩素與氟康唑合用對2株實驗室誘導白念珠菌耐藥株的MIC80值
表4黃芩素與氟康唑合用對5株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值
由表3、表4可以看出，原先對氟康唑耐藥的臨床白念珠菌MIC80值≥64，用16μg/ml的黃芩素即可使氟康唑的MIC80值下降為0.125-0.5μg/ml，對實驗室誘導的白念珠菌，用16μg/ml的黃芩素即可使氟康唑的MIC80值下降為0.5μg/ml，表明黃芩素能使菌株恢復對藥物的敏感性，大大增強氟康唑的抗菌效力。
實施例3黃芩素與咪康唑、酮康唑的聯合用藥材料和方法1.試藥黃芩素購自Sigma公司。
咪康唑購自中國藥品生物制品檢定所。
酮康唑購自中國藥品生物制品檢定所。
二甲亞砜中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。
黃芩素用二甲亞砜配成32mg/ml的濃度，咪康唑和酮康唑分別用二甲亞砜配成6.4mg/ml的濃度，受試藥物于-20℃保存。實驗前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進行藥效學試驗。
其它實驗步驟與方法同實施例1。
實驗結果見表5，表6。
表5黃芩素與咪康唑合用對3株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值
注Micon表示咪康唑，BAI表示黃芩素。
表6黃芩素與酮康唑合用對3株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值
注Ketocon表示酮康唑，BAI表示黃芩素。
由表5、6可見，黃芩素不但可對氟康唑合用產生增效作用，而且對咪康唑、酮康唑等抗真菌藥同樣具有抗菌增效作用。用8μg/ml的黃芩素即可使咪康唑、酮康唑對耐藥白念珠菌的MIC80值從16-32μg/ml下降為0.5-0.125μg/ml。
權利要求
1.黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的抗真菌藥物為吡咯類抗真菌藥物，黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量為4-16微克/毫升或微克/毫克。
2.根據權利要求1所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量為8微克/毫升或微克/毫克、16微克/毫升或微克/毫克。
3.根據權利要求1或2所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的抗真菌藥物為咪唑類抗真菌藥物。
4.根據權利要求1或2所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的抗真菌藥物為三唑類抗真菌藥物。
5.根據權利要求3所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的咪唑類抗真菌藥物為酮康唑或咪康唑。
6.根據權利要求4所述的黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述的三唑類抗真菌藥物為氟康唑。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域。黃芩素是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的有效成份之一，臨床主要用于治療各種急、慢性炎癥，但其抗真菌活性較弱，所需的有效藥物濃度較高。至今尚未見黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的報道。本發明提供了黃芩素作為抗真菌藥物增效劑的新用途，所說的抗真菌藥物是吡咯類抗真菌藥物，黃芩素在抗真菌藥物有效濃度中加入量為4－16μg/ml。實驗表明，黃芩素與氟康唑、酮康唑、咪康唑等抗真菌藥物合用，不僅能在減少用藥量的情況下同樣確保其對淺表部或深部真菌感染的治療效果，并能使抗真菌藥物恢復對耐藥真菌的作用。因此可用作抗真菌藥物的增效劑。
文檔編號A61K31/496GK101066263SQ200710041688
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月6日 優先權日2007年6月6日
發明者曹穎瑛, 戴寶娣, 王彥, 曹永兵, 朱臻宇, 徐永剛, 姜遠英 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學