去細胞異種角膜基質載體及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：去細胞異種角膜基質載體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫用材料技術領域，具體涉及一種去細胞異種角膜基質載體及其制備方法和應用。
背景技術：
據1991年WHO統計，世界上約有角膜病和眼外傷角膜致盲者1000萬人，每年新增病例約150萬到200萬。在我國，共有約400萬角膜病盲人。角膜移植術是角膜病致盲患者唯一的復明手段。由于角膜供體材料匱乏，目前，我國每年僅能做角膜移植手術的不足1%。 因此，如何獲取適用的角膜移植材料成為眼科界亟待解決的問題。隨著組織工程學的發展，人工生物角膜的研究已成為當今國內外眼科學研究的熱點。從臨床應用的角度，組織工程化角膜并不一定需要具有全部三層結構，有時僅需要板層或單純的角膜上皮、基質或內皮組織。目前利用自身或同種異體角膜上皮干細胞重建眼表的相關研究相對較多，其成功構建的難點在于尋找合適的載體。關于干細胞載體，國內外研究最多的是羊膜，它存在完整的基底膜和細胞外基質， 具有良好的組織相容性、抗炎和抗新生血管的作用。但羊膜相對較薄，厚度僅20μπι 100 μ m,如長時間在羊膜表面培養細胞，細胞生長不均勻，易脫落，始終不能完全透明，還存在潛在的HIV感染等危險。這些都影響了以羊膜為載體進行干細胞移植的研究和臨床應用。因此期望選擇更為理想的載體代替羊膜。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術中的不足，提供一種膠原排列整齊，與正常角膜組織相似，復水后透明性好的去細胞異種角膜基質載體。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種去細胞異種角膜基質載體， 其特征在于，該載體是經高滲溶液聯合酶消化法去除上皮細胞及基質細胞后的動物板層角膜；該載體的制備方法包括以下步驟(1)動物眼球的摘取和保存摘取動物眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的動物眼球置于濕房中，4°C 8°C保存二4小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1)中保存的動物眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑5mm 12mm的刻度環鉆鉆取150 μ m 400 μ m厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟( 中所述板層角膜放入高滲溶液中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1天 3天；所述高滲溶液為質量濃度3% 20%的NaCl水溶液；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于含胰酶的緩沖溶液中，在溫度為 25 °C 40°C條件下浸泡1天 4天，所述含胰酶的緩沖溶液中胰酶的質量百分含量為 0. 05% 0. 35% ；或者將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于胰酶替代物中，在溫度為25V 40°C條件下浸泡1天 4天；所述緩沖溶液為D-Hanks溶液，所述胰酶替代物為 TrypLE Express ；303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，得到去細胞異種角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞異種角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有干燥劑的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水1天 3天，所述干燥劑為無水氯化鈣；(5)消毒處理將步驟(4)中干燥后的去細胞異種角膜基質載體置于無菌瓶中，密封，然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞異種角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。上述的去細胞異種角膜基質載體，所述動物為豬、牛或鴕鳥。本發明還提供了上述去細胞異種角膜基質載體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)動物眼球的摘取和保存摘取動物眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的動物眼球置于濕房中，4°C 8°C保存二4小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1)中保存的動物眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑5mm 12mm的刻度環鉆鉆取150 μ m 400 μ m厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟( 中所述板層角膜放入高滲溶液中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1天 3天；所述高滲溶液為質量濃度3% 20%的NaCl水溶液；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于含胰酶的緩沖溶液中，在溫度為 25 °C 40°C條件下浸泡1天 4天，所述含胰酶的緩沖溶液中胰酶的質量百分含量為 0. 05% 0. 35% ；或者將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于胰酶替代物中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1天 4天；所述緩沖溶液為D-Hanks溶液，所述胰酶替代物為 TrypLE Express ；303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，得到去細胞異種角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞異種角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有干燥劑的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水1天 3天，所述干燥劑為無水氯化鈣；(5)消毒處理將步驟(4)中干燥后的去細胞異種角膜基質載體置于無菌瓶中，密封，然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞異種角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。上述的去細胞異種角膜基質載體的制備方法，步驟301中所述NaCl水溶液的質量濃度為8% 12%。本發明進一步提供了上述去細胞異種角膜基質載體作為角膜移植供體在角膜移植中的應用，以及作為人工生物角膜支架在全層或板層人工生物角膜構建中的應用。上述的去細胞異種角膜基質載體作為角膜移植供體在角膜移植中的應用，應用方法為對需進行角膜移植的受體進行麻醉，術眼常規消毒，鋪巾，開瞼器開瞼，上下直肌固定縫線，將去細胞異種角膜基質載體用生理鹽水復水20分鐘，用環鉆在受體角膜中央鉆取， 然后用角膜板層刀分離板層，形成植床，將復水后的去細胞異種角膜基質載體置于植床，用 10-0尼龍線縫合，球結膜下注射慶大霉素40000U加地塞米松2. 5mg,涂氧氟沙星眼膏，然后用3-0縫線褥式縫合眼瞼，角膜移植手術完成。上述的去細胞異種角膜基質載體作為人工生物角膜支架在全層或板層人工生物角膜構建中的應用，所述板層人工生物角膜的構建方法包括以下步驟(1)基底膜化處理將去細胞異種角膜基質載體放入含0. lg/L纖維連接蛋白的 Hanks溶液或含0. lg/L纖維連接蛋白的生理鹽水中，并置于37°C培養箱中孵育lh，然后將孵育后的去細胞異種角膜基質載體取出，放入含0. lg/L層粘連蛋白的Hanks溶液或含 0. lg/L層粘連蛋白的生理鹽水中，并置于37°C培養箱孵育lh，吸出液體，再將孵育后的去細胞異種角膜基質載體置于37°C培養箱內干燥lh，得到載體膜片，備用；(2)上皮細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，用含200U/mL青霉素和200U/mL鏈霉素的生理鹽水反復沖洗兔眼球，剪下角膜緣，切除角膜緣上殘存的結膜和色素組織，去除角膜內皮及基質，然后將角膜緣切成lmmX2mm的組織塊，置于培養瓶中并使組織塊的上皮面朝上，向培養瓶中加入細胞培養液，置于37°C，50mL/L的(X)2培養箱培養，根據代謝情況， 3 4天換細胞培養液一次，當細胞密度達到80% 90%時，向培養瓶中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min lOmin，用含10% 胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養瓶中的培養物離心兩次，每次離心lOmin，棄去上清，加入含IOwt %胎牛血清的DMEM培養液，吹打制成細胞濃度為2X IO5個細胞/mL的懸液，接種懸液于鋪有步驟(1)中所述載體膜片的培養皿中，所述載體膜片的上皮面朝上，向培養皿中加入細胞培養液，培養條件與所述組織塊在培養瓶中的培養條件相同，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄；所述細胞培養液為常規 DMEM/F12培養基1 1，另含200mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、4mmol/L 谷氨酰胺、1000U/L胰島素、Syg/L表皮生長因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(3)板層人工生物角膜的形成當細胞生長7 后，將生長有細胞的載體膜片置于 Transwell培養板中進行培養，細胞培養液及培養條件均與步驟( 相同，培養時載體膜片的底面浸于細胞培養液中，上皮面暴露于氣體中，形成氣液交界面，培養7 10天形成復層，構建得到板層人工生物角膜。所述全層人工生物角膜的構建方法包括以下步驟(1)基底膜化處理將去細胞異種角膜基質載體放入含0. lg/L纖維連接蛋白的 Hanks溶液或含0. lg/L纖維連接蛋白的生理鹽水中，并置于37°C培養箱中孵育lh，然后將孵育后的去細胞異種角膜基質載體取出，放入含0. lg/L層粘連蛋白的Hanks溶液或含 0. lg/L層粘連蛋白的生理鹽水中，并置于37°C培養箱孵育lh，吸出液體，再將孵育后的去細胞異種角膜基質載體置于37°C培養箱內干燥lh，得到載體膜片，備用；(2)內皮細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，自角膜緣內側Imm剪下全層角膜組織，將全層角膜組織置于培養皿中，用含200U/mL青霉素和200U/mL鏈霉素的無菌生理鹽水沖洗，撕下全層角膜組織的后彈力膜，然后將全層角膜組織的內皮面朝上放入培養皿中，向培養皿中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化15min 30min，用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養皿中的培養物離心兩次，每次離心lOmin，棄去上清，加入含IOwt^胎牛血清的DMEM 培養液，吹打制成細胞濃度為2X IO5個細胞/mL的懸液，接種懸液于鋪有步驟(1)中所述載體膜片的培養皿中，所述載體膜片的內皮面朝上，向培養皿中加入含10wt%胎牛血清的 DMEM培養液，370C CO2孵箱中培養，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄，培養 72h，將培養后的載體膜片翻轉使內皮面朝下；(3)上皮細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，用含200U/mL青霉素和200U/mL鏈霉素的生理鹽水反復沖洗兔眼球，剪下角膜緣，切除角膜緣上殘存的結膜和色素組織，去除角膜內皮及基質，然后將角膜緣切成lmmX2mm的組織塊，置于培養瓶中并使組織塊的上皮面朝上，向培養瓶中加入細胞培養液，置于37°C，50mL/L的(X)2培養箱培養，根據代謝情況， 3 4天換細胞培養液一次，當細胞密度達到80% 90%時，向培養瓶中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min lOmin，用含10% 胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養瓶中的培養物離心兩次，每次離心lOmin，棄去上清，加入含IOwt %胎牛血清的DMEM培養液，吹打制成細胞濃度為2X IO5個細胞/mL的懸液，接種懸液于步驟O)中翻轉后的載體膜片上，加入細胞培養液，培養條件與所述組織塊在培養瓶中的培養條件相同，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄；所述細胞培養液為常規DMEM/F12培養基1 1，另含200mL/L胎牛血清、 100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、4mmo 1 /L谷氨酰胺、1000U/L胰島素、5 μ g/L表皮生長因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(4)全層人工生物角膜的形成當細胞生長7 后，將生長有細胞的載體膜片置于 Transwell培養板中進行培養，細胞培養液及培養條件均與步驟( 相同，培養時載體膜片的底面浸于細胞培養液中，上皮面暴露于氣體中，形成氣液交界面，培養7 10天形成復層，構建得到全層人工生物角膜。本發明與現有技術相比具有以下優點1、本發明通過高滲溶液和胰酶/胰酶替代物的聯合作用去除細胞得到無活性細胞存在的異種角膜基質膠原組織，極大的降低了抗原性。2、本發明采用干燥劑非接觸法進行去細胞異種角膜基質載體的脫水干燥，干燥后的載體膠原排列整齊，與正常角膜組織相似，載體復水后透明性好。3、本發明優選鴕鳥角膜基質作為載體材料，鴕鳥角膜直徑大(> 20mm)，透明性好，韌性強，抗拉力大，組織結構5層，厚度與人角膜一致，光鏡和電鏡顯示鴕鳥角膜基質板層結構與人一致，屈光指數與人接近，是一個理想的人工生物角膜支架材料。4、對本發明的去細胞異種角膜基質載體進行細胞毒性試驗、溶血試驗、致敏試驗和眼部刺激試驗，結果均符合國家相關標準。5、本發明的去細胞異種角膜基質載體可作為角膜移植供體直接進行治療性角膜移植，也可作為人工生物角膜支架進行全層或板層的人工生物角膜的構建。下面結合附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。


圖1為本發明實施例1去細胞處理前鴕鳥角膜蘇木素-伊紅(HE)染色照片。圖2為本發明實施例1去細胞處理后鴕鳥板層角膜蘇木素-伊紅(HE)染色照片。圖3為本發明實施例1去細胞處理前鴕鳥角膜透射電鏡照片。圖4為本發明實施例1去細胞處理后鴕鳥板層角膜透射電鏡照片。圖5為本發明實施例6兔板層角膜移植術后當日照片。圖6為本發明實施例6兔板層角膜移植術后7天照片。圖7為本發明實施例6兔板層角膜移植術后6個月照片。
具體實施例方式實施例1去細胞鴕鳥角膜基質載體的制備(1)動物眼球的摘取和保存在正規、合格的屠宰場取處死2小時內的健康鴕鳥眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的眼球置于濕房中，4°C 8°C保存二4小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1)中保存的鴕鳥眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑8mm的刻度環鉆鉆取 300 μ m厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟⑵中所述板層角膜放入高滲溶液(質量濃度為12%的NaCl水溶液) 中，在溫度為37 °C條件下浸泡2天；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于胰酶替代物(TrypLE)中，在溫度為 37 °C條件下浸泡2天；303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，經組織切片及透射電鏡證實已無完整細胞存在，得到去細胞鴕鳥角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞鴕鳥角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有無水氯化鈣的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水2天；(5)消毒處理將步驟⑷中干燥后的去細胞鴕鳥角膜基質載體置于無菌瓶中，密封，然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞鴕鳥角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。圖1是本實施例去細胞處理前鴕鳥角膜蘇木素-伊紅(HE)染色照片，光鏡下見角膜分為5層，依次為上皮細胞層，前彈力層，基質層，后彈力層和內皮細胞層。圖2是本實施例去細胞處理后鴕鳥板層角膜蘇木素-伊紅(HE)染色照片，光鏡下僅見排列規則的膠原纖維。圖3是本實施例去細胞處理前鴕鳥角膜透射電鏡照片，照片中可見角膜上存在上皮細胞，基質有核細胞等細胞成份。圖4是本實施例去細胞處理后鴕鳥板層角膜透射電鏡照片， 照片中可看出，經去細胞處理后的鴕鳥板層角膜無任何細胞存在，僅見排列規則的膠原纖維。本實施例通過高滲溶液和胰酶替代物的聯合作用去除細胞得到無活性細胞存在的鴕鳥角膜基質膠原組織，極大的降低了抗原性，采用干燥劑非接觸法進行去細胞鴕鳥角膜基質載體的脫水干燥，干燥后的載體膠原排列整齊，與正常角膜組織相似，載體復水后透明性好。實施例2去細胞豬角膜基質載體的制備(1)動物眼球的摘取和保存在正規、合格的屠宰場取處死2小時內的健康豬眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的眼球置于濕房中，4°C 8°C保存二4小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1)中保存的豬眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑5mm的刻度環鉆鉆取150 μ m 厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟O)中所述板層角膜放入高滲溶液(質量濃度為3%的NaCl水溶液) 中，在溫度為25 °C條件下浸泡3天；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于含胰酶0. 05wt%的D-Hanks溶液中，在溫度為25 °C條件下浸泡4天；303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，經組織切片及透射電鏡證實已無完整細胞存在，得到去細胞豬角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞豬角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有無水氯化鈣的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水3天；(5)消毒處理將步驟中干燥后的去細胞豬角膜基質載體置于無菌瓶中，密封，然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞豬角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。本實施例通過高滲溶液和胰酶的聯合作用去除細胞得到無活性細胞存在的豬角膜基質膠原組織，極大的降低了抗原性，采用干燥劑非接觸法進行去細胞豬角膜基質載體的脫水干燥，干燥后的載體膠原排列整齊，與正常角膜組織相似，載體復水后透明性好。實施例3去細胞牛角膜基質載體的制備(1)動物眼球的摘取和保存在正規、合格的屠宰場取處死2小時內的健康牛眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的眼球置于濕房中，4°C 8°C保存二4小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1)中保存的牛眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑5mm的刻度環鉆鉆取150 μ m 厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟⑵中所述板層角膜放入高滲溶液(質量濃度為20%的NaCl水溶液) 中，在溫度為40°C條件下浸泡1天；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于含胰酶0. 35wt%的D-Hanks溶液中，在溫度為40°C條件下浸泡1天；303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，經組織切片及透射電鏡證實已無完整細胞存在，得到去細胞牛角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞牛角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有無水氯化鈣的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水1天；(5)消毒處理將步驟中干燥后的去細胞牛角膜基質載體置于無菌瓶中，密封，然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞牛角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。本實施例通過高滲溶液和胰酶的聯合作用去除細胞得到無活性細胞存在的牛角膜基質膠原組織，極大的降低了抗原性，采用干燥劑非接觸法進行去細胞牛角膜基質載體的脫水干燥，干燥后的載體膠原排列整齊，與正常角膜組織相似，載體復水后透明性好。實施例4去細胞鴕鳥角膜基質載體的制備(1)動物眼球的摘取和保存在正規、合格的屠宰場取處死2小時內的健康鴕鳥眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的眼球置于濕房中，4°C 8°C保存二4小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1)中保存的鴕鳥眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑8mm的刻度環鉆鉆取 300 μ m厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟⑵中所述板層角膜放入高滲溶液(質量濃度為8%的NaCl水溶液) 中，在溫度為37°C條件下浸泡2天；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于含胰酶0. 25wt%的D-Hanks溶液中，在溫度為30°C條件下浸泡3天；303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，經組織切片及透射電鏡證實已無完整細胞存在，得到去細胞鴕鳥角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞鴕鳥角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有無水氯化鈣的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水3天；(5)消毒處理將步驟⑷中干燥后的去細胞鴕鳥角膜基質載體置于無菌瓶中，密封，然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞鴕鳥角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。本實施例通過高滲溶液和胰酶的聯合作用去除細胞得到無活性細胞存在的鴕鳥角膜基質膠原組織，極大的降低了抗原性，采用干燥劑非接觸法進行去細胞鴕鳥角膜基質載體的脫水干燥，干燥后的載體膠原排列整齊，與正常角膜組織相似，載體復水后透明性好。實施例5去細胞豬角膜基質載體的制備
(1)動物眼球的摘取和保存在正規、合格的屠宰場取處死2小時內的健康豬眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的眼球置于濕房中，4°C 8°C保存二4小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1)中保存的豬眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑12mm的刻度環鉆鉆取 400 μ m厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟⑵中所述板層角膜放入高滲溶液(質量濃度為10%的NaCl水溶液) 中，在溫度為37 °C條件下浸泡3天；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于胰酶替代物(TrypLE)中，在溫度為 30°C條件下浸泡4天；303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，經組織切片及透射電鏡證實已無完整細胞存在，得到去細胞豬角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞豬角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有無水氯化鈣的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水2天；(5)消毒處理將步驟中干燥后的去細胞豬角膜基質載體置于無菌瓶中，密封，然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞豬角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。本實施例通過高滲溶液和胰酶的聯合作用去除細胞得到無活性細胞存在的豬角膜基質膠原組織，極大的降低了抗原性，采用干燥劑非接觸法進行去細胞豬角膜基質載體的脫水干燥，干燥后的載體膠原排列整齊，與正常角膜組織相似，載體復水后透明性好。實施例6新西蘭兔治療性板層角膜移植實驗以實施例1制備的去細胞鴕鳥角膜基質載體為供體材料，選擇體重2. 5Kg的健康新西蘭兔為受體進行板層角膜移植手術，陸眠寧II肌注麻醉(麻醉劑量為0. 2mL/Kg)，術眼常規消毒，鋪巾，開瞼器開瞼，上下直肌固定縫線，將供體材料(實施例1制備的去細胞鴕鳥角膜基質載體)用生理鹽水復水20分鐘，用7. 5mm環鉆在受體角膜中央鉆取約200 μ m深度，然后用角膜板層刀分離板層，形成植床，將植片(復水后的去細胞鴕鳥角膜基質載體) 置于植床，用10-0尼龍線(Alcon Laboratories, Fort Worth, TX)作16針間斷縫合，球結膜下注射慶大霉素40000U加地塞米松2. 5mg，涂氧氟沙星眼膏，然后用3-0縫線褥式縫合眼瞼。術后當日照片參見圖5，從圖中可以看出，植片植床縫合良好，植片透明。術后第3日拆瞼緣線，每日應用抗生素或抗排斥滴眼液點眼1月，隔日裂隙燈下觀察，術后3天受體角膜上皮形成，術后7天照片參見圖6，從圖中可以看出，植片較透明，有輕度水腫，結膜輕度充血，在左側縫線處有輕度熒光素著色，其余部位上皮均已形成。術后6個月內未見排斥反應發生，生物相容性好，參見圖7，從圖中可以看出，角膜透明，無水腫及熒光素染色，結膜無充血，植片植床融合性好。實施例7板層人工生物角膜的構建
(1)基底膜化處理取實施例1制備的去細胞鴕鳥角膜基質載體，用含0. lg/L FN(纖維連接蛋白)的Hanks溶液或含0. lg/L FN的生理鹽水浸泡載體，置于37°C培養箱孵育lh，然后將孵育后的去細胞異種角膜基質載體取出，放入含0. lg/L LN(層粘連蛋白) 的Hanks溶液或含0. lg/L LN的生理鹽水中浸泡，置于37°C培養箱孵育lh，吸出液體，再將孵育后的去細胞異種角膜基質載體放入37°C培養箱內干燥lh，得到載體膜片，備用；(2)細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，用含青霉素O00U/mL)和鏈霉素QOOU/ mL)的生理鹽水反復沖洗兔眼球，剪下角膜緣，切除角膜緣上殘存的結膜和色素組織，去除角膜內皮及大部分基質，將角膜緣切成lmmX2mm組織塊，置于培養瓶中并使組織塊的上皮面朝上，向培養瓶中加入細胞培養液，將培養瓶置于37°C，50mL/L的(X)2培養箱培養，根據代謝情況，3 4天換細胞培養液一次，當細胞密度達到80% 90%時，向培養瓶中加入含 0. 02wt% EDTA和 0. 25wt%胰酶的 D-Hanks 溶液，置于 37°C CO2 孵箱中消化 5min IOmin, 用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養瓶中的培養物離心兩次，每次離心lOmin，棄去上清，加入含IOwt^胎牛血清的DMEM培養液，吹打制成細胞濃度為2 X IO5個細胞/mL的懸液，接種懸液于鋪有步驟(1)中所述載體膜片的培養皿中，所述載體膜片的上皮面朝上，向培養皿中加入細胞培養液，培養條件與所述組織塊在培養瓶中的培養條件相同，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄；所述細胞培養液為常規DMEM/F12培養基1 1，另含200mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1000U/L胰島素、5 μ g/L表皮生長因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(3)板層人工生物角膜的形成當細胞生長7 后，將生長有細胞的載體膜片置于 Transwell培養板中進行培養，細胞培養液及培養條件均與步驟( 相同，培養時載體膜片的底面浸于細胞培養液中，上皮面暴露于氣體中，形成氣液交界面，培養7 10天形成復層，構建得到板層人工生物角膜。實施例8全層人工生物角膜的構建(1)基底膜化處理取實施例1制備的去細胞鴕鳥角膜基質載體，用含0. lg/L FN(纖維連接蛋白)的Hanks溶液或含0. lg/L FN的生理鹽水浸泡載體，置于37°C培養箱孵育lh，然后將孵育后的去細胞異種角膜基質載體取出，放入含0. lg/L LN(層粘連蛋白) 的Hanks溶液或含0. lg/L LN的生理鹽水中浸泡，置于37°C培養箱孵育lh，吸出液體，再將孵育后的去細胞異種角膜基質載體放入37°C培養箱內干燥lh，得到載體膜片，備用；(2)內皮細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，自角膜緣內側Imm剪下全層角膜組織，將全層角膜組織置于培養皿中，用含青霉素O00U/mL)和鏈霉素O00U/mL)的無菌生理鹽水沖洗，撕下全層角膜組織的后彈力膜，然后將全層角膜組織的內皮面朝上放入培養皿中，向培養皿中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化15min 30min，用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養皿中的培養物離心兩次，每次離心lOmin，棄去上清，加入含10wt%胎牛血清的DMEM培養液，吹打制成細胞濃度為2 X IO5個細胞/mL的懸液，接種懸液于鋪有步驟⑴ 中所述載體膜片的培養皿中，所述載體膜片的內皮面朝上，向培養皿中加入含10wt%胎牛血清的DMEM培養液，370C CO2孵箱中培養，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄，培養72h，將培養后的載體膜片翻轉使內皮面朝下；
(3)上皮細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，用含青霉素O00U/mL)和鏈霉素 (200U/mL)的生理鹽水反復沖洗兔眼球，剪下角膜緣，切除角膜緣上殘存的結膜和色素組織，去除角膜內皮及大部分基質，將角膜緣切成lmmX2mm組織塊，置于培養瓶中并使組織塊的上皮面朝上，向培養瓶中加入細胞培養液，將培養瓶置于37°C，50mL/L的(X)2培養箱培養，根據代謝情況，3 4天換細胞培養液一次，當細胞密度達到80% 90%時，向培養瓶中加入含0. 02wt % EDTA和0. 25wt %胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min IOmin,用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養瓶中的培養物離心兩次，每次離心lOmin，棄去上清，加入含IOwt^胎牛血清的DMEM培養液，吹打制成細胞濃度為2X IO5個細胞/mL的懸液，接種懸液于步驟( 中翻轉后的載體膜片上， 加入細胞培養液(同上)，培養條件與所述組織塊在培養瓶中的培養條件相同，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄；所述細胞培養液為常規DMEM/F12培養基1 1，另含200mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1000U/L胰島素、Syg/L表皮生長因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(4)全層人工生物角膜的形成當細胞生長7 后，將生長有細胞的載體膜片置于 Transwell培養板中進行培養，細胞培養液及培養條件均與步驟( 相同，培養時載體膜片的底面浸于細胞培養液中，上皮面暴露于氣體中，形成氣液交界面，培養7 10天形成復層，構建得到全層人工生物角膜。本發明對制備的去細胞異種角膜基質載體進行了細胞毒性試驗、溶血試驗、致敏試驗和眼部刺激試驗，結果均符合國家相關標準。細胞毒性試驗參照《中華人民共和國國家標準GB/T16886. 5-2003》的方法，對本發明的去細胞異種角膜基質載體進行細胞毒性試驗，去細胞異種角膜基質載體組少量細胞呈圓形，疏松貼壁，無胞漿內顆粒，偶見細胞溶解。結合MTT法分析，表明去細胞異種角膜基質載體的細胞毒性為1級。溶血試驗將本發明的去細胞異種角膜基質載體與滅菌的0. 9%氯化鈉注射液混合，37°C恒溫箱浸提對小時制得供試液；家兔心臟采血約10mL，除去纖維蛋白原，加生理鹽水混勻后離心，重復多次至上清液不顯紅色為止，得到紅細胞，用生理鹽水將紅細胞稀釋成 2%的混懸液；將供試液與混懸液按梯度混合，觀察4小時，均無溶血現象。致敏試驗參照《中華人民共和國國家標準GB/T16886. 10-2005》及《中華人民共和國國家標準GB/T16886. 12-2005》的方法，對本發明的去細胞異種角膜基質載體進行豚鼠皮膚致敏試驗，根據皮膚反應分級標準，結果表明，本發明的去細胞異種角膜基質載體對豚鼠皮膚無致敏反應。眼部刺激試驗參照《中華人民共和國國家標準GB/T16886. 10-2005))的方法，對本發明的去細胞異種角膜基質載體進行大耳白家兔眼刺激試驗，根據反應分級標準，結果表面，本發明的去細胞異種角膜基質載體對大耳白家兔眼睛潛在性無刺激反應。以上所述，僅是本發明的較佳實施例，并非對本發明做任何限制，凡是根據發明技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結構變化，均仍屬于本發明技術方案的保護范圍內。
1權利要求
1.一種去細胞異種角膜基質載體，其特征在于，該載體是經高滲溶液聯合酶消化法去除上皮細胞及基質細胞后的動物板層角膜；該載體的制備方法包括以下步驟(1)動物眼球的摘取和保存摘取動物眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的動物眼球置于濕房中，4°C 8°C保存，24小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1) 中保存的動物眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑5mm 12mm的刻度環鉆鉆取 150 μ m 400 μ m厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟O)中所述板層角膜放入高滲溶液中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1 天 3天；所述高滲溶液為質量濃度3% 20%的NaCl水溶液；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于含胰酶的緩沖溶液中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1天 4天，所述含胰酶的緩沖溶液中胰酶的質量百分含量為0. 05% 0. 35% ；或者將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于胰酶替代物中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1天 4天；所述緩沖溶液為D-Hanks溶液，所述胰酶替代物為TrypLE Express ；303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，得到去細胞異種角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞異種角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有干燥劑的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水1天 3天，所述干燥劑為無水氯化鈣；(5)消毒處理將步驟(4)中干燥后的去細胞異種角膜基質載體置于無菌瓶中，密封， 然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞異種角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。
2.根據權利要求1所述的去細胞異種角膜基質載體，其特征在于，所述動物為豬、牛或鴕鳥。
3.一種制備如權利要求1或2所述的去細胞異種角膜基質載體的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)動物眼球的摘取和保存摘取動物眼球，用生理鹽水沖洗眼球，將沖洗后的動物眼球置于濕房中，4°C 8°C保存，24小時內進行板層角膜的剖切；(2)板層角膜的剖切用生理鹽水和含400U/mL妥布霉素的生理鹽水交替沖洗步驟(1) 中保存的動物眼球，然后在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑5mm 12mm的刻度環鉆鉆取 150 μ m 400 μ m厚的板層角膜；(3)高滲溶液聯合酶消化法去除板層角膜上皮細胞及基質細胞301、將步驟O)中所述板層角膜放入高滲溶液中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1 天 3天；所述高滲溶液為質量濃度3% 20%的NaCl水溶液；302、將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于含胰酶的緩沖溶液中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1天 4天，所述含胰酶的緩沖溶液中胰酶的質量百分含量為0. 05% 0. 35% ；或者將301中浸泡后的板層角膜取出后放置于胰酶替代物中，在溫度為25°C 40°C條件下浸泡1天 4天；所述緩沖溶液為D-Hanks溶液，所述胰酶替代物為TrypLEExpress ；`303、將302中浸泡后的板層角膜取出后用去離子水洗滌3次，得到去細胞異種角膜基質載體；(4)干燥處理將303中所述去細胞異種角膜基質載體置于無菌平皿中，然后一同放入裝有干燥劑的干燥器中，密封，室溫下干燥脫水1天 3天，所述干燥劑為無水氯化鈣；(5)消毒處理將步驟(4)中干燥后的去細胞異種角膜基質載體置于無菌瓶中，密封， 然后采用Co 60輻射進行消毒處理，輻射照射總劑量為25kGy ；(6)保存將步驟(5)中經消毒處理后的去細胞異種角膜基質載體在室溫條件下常規保存，備用。
4.根據權利要求3所述的去細胞異種角膜基質載體的制備方法，其特征在于，步驟301 中所述NaCl水溶液的質量濃度為8% 12%。
5.一種如權利要求1或2所述的去細胞異種角膜基質載體作為角膜移植供體在角膜移植中的應用。
6.根據權利要求5所述的去細胞異種角膜基質載體作為角膜移植供體在角膜移植中的應用，其特征在于，應用方法為對需進行角膜移植的受體進行麻醉，術眼常規消毒，鋪巾，開瞼器開瞼，上下直肌固定縫線，將去細胞異種角膜基質載體用生理鹽水復水20分鐘， 用環鉆在受體角膜中央鉆取，然后用角膜板層刀分離板層，形成植床，將復水后的去細胞異種角膜基質載體置于植床，用10-0尼龍線縫合，球結膜下注射慶大霉素40000U加地塞米松 2. 5mg，涂氧氟沙星眼膏，然后用3-0縫線褥式縫合眼瞼，角膜移植手術完成。
7.—種如權利要求1或2所述的去細胞異種角膜基質載體作為人工生物角膜支架在全層或板層人工生物角膜構建中的應用。
8.根據權利要求7所述的去細胞異種角膜基質載體作為人工生物角膜支架在板層人工生物角膜構建中的應用，其特征在于，所述板層人工生物角膜的構建方法包括以下步驟(1)基底膜化處理將去細胞異種角膜基質載體放入含0.lg/L纖維連接蛋白的Hanks 溶液或含0. lg/L纖維連接蛋白的生理鹽水中，并置于37°C培養箱中孵育lh，然后將孵育后的去細胞異種角膜基質載體取出，放入含0. lg/L層粘連蛋白的Hanks溶液或含0. lg/L層粘連蛋白的生理鹽水中，并置于37°C培養箱孵育lh，吸出液體，再將孵育后的去細胞異種角膜基質載體置于37°C培養箱內干燥lh，得到載體膜片，備用；(2)上皮細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，用含200U/mL青霉素和200U/mL鏈霉素的生理鹽水反復沖洗兔眼球，剪下角膜緣，切除角膜緣上殘存的結膜和色素組織，去除角膜內皮及基質，然后將角膜緣切成ImmX2mm的組織塊，置于培養瓶中并使組織塊的上皮面朝上，向培養瓶中加入細胞培養液，置于37°C，50mL/L的(X)2培養箱培養，根據代謝情況，3 4天換細胞培養液一次，當細胞密度達到80% 90%時，向培養瓶中加入含0. 02wt% EDTA 和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min lOmin，用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養瓶中的培養物離心兩次， 每次離心lOmin，棄去上清，加入含IOwt %胎牛血清的DMEM培養液，吹打制成細胞濃度為 2X105個細胞/mL的懸液，接種懸液于鋪有步驟(1)中所述載體膜片的培養皿中，所述載體膜片的上皮面朝上，向培養皿中加入細胞培養液，培養條件與所述組織塊在培養瓶中的培養條件相同，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄；所述細胞培養液為常規 DMEM/F12培養基1 1，另含200mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、4mmol/L 谷氨酰胺、1000U/L胰島素、5μ g/L表皮生長因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(3)板層人工生物角膜的形成當細胞生長7 后，將生長有細胞的載體膜片置于 Transwell培養板中進行培養，細胞培養液及培養條件均與步驟( 相同，培養時載體膜片的底面浸于細胞培養液中，上皮面暴露于氣體中，形成氣液交界面，培養7 10天形成復層，構建得到板層人工生物角膜。
9.根據權利要求7所述的去細胞異種角膜基質載體作為人工生物角膜支架在全層人工生物角膜構建中的應用，其特征在于，所述全層人工生物角膜的構建方法包括以下步驟(1)基底膜化處理將去細胞異種角膜基質載體放入含0.lg/L纖維連接蛋白的Hanks 溶液或含0. lg/L纖維連接蛋白的生理鹽水中，并置于37°C培養箱中孵育lh，然后將孵育后的去細胞異種角膜基質載體取出，放入含0. lg/L層粘連蛋白的Hanks溶液或含0. lg/L層粘連蛋白的生理鹽水中，并置于37°C培養箱孵育lh，吸出液體，再將孵育后的去細胞異種角膜基質載體置于37°C培養箱內干燥lh，得到載體膜片，備用；(2)內皮細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，自角膜緣內側Imm剪下全層角膜組織，將全層角膜組織置于培養皿中，用含200U/mL青霉素和200U/mL鏈霉素的無菌生理鹽水沖洗，撕下全層角膜組織的后彈力膜，然后將全層角膜組織的內皮面朝上放入培養皿中，向培養皿中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化 15min 30min，用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養皿中的培養物離心兩次，每次離心lOmin，棄去上清，加入含IOwt^胎牛血清的DMEM培養液，吹打制成細胞濃度為2 X IO5個細胞/mL的懸液，接種懸液于鋪有步驟(1)中所述載體膜片的培養皿中，所述載體膜片的內皮面朝上，向培養皿中加入含10wt%胎牛血清的DMEM 培養液，370C CO2孵箱中培養，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄，培養72h， 將培養后的載體膜片翻轉使內皮面朝下；(3)上皮細胞接種無菌條件下摘取兔眼球，用含200U/mL青霉素和200U/mL鏈霉素的生理鹽水反復沖洗兔眼球，剪下角膜緣，切除角膜緣上殘存的結膜和色素組織，去除角膜內皮及基質，然后將角膜緣切成ImmX2mm的組織塊，置于培養瓶中并使組織塊的上皮面朝上，向培養瓶中加入細胞培養液，置于37°C，50mL/L的(X)2培養箱培養，根據代謝情況，3 4天換細胞培養液一次，當細胞密度達到80% 90%時，向培養瓶中加入含0. 02wt% EDTA 和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min lOmin，用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，在轉速為2000rpm的條件下將培養瓶中的培養物離心兩次， 每次離心lOmin，棄去上清，加入含IOwt %胎牛血清的DMEM培養液，吹打制成細胞濃度為 2X IO5個細胞/mL的懸液，接種懸液于步驟O)中翻轉后的載體膜片上，加入細胞培養液， 培養條件與所述組織塊在培養瓶中的培養條件相同，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并攝影記錄；所述細胞培養液為常規DMEM/F12培養基1 1，另含200mL/L胎牛血清、IOOU/ mL青霉素、100U/mL鏈霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1000U/L胰島素、5 μ g/L表皮生長因子和 0. 118mmol/L 腺嘌呤；(4)全層人工生物角膜的形成當細胞生長7 后，將生長有細胞的載體膜片置于Transwell培養板中進行培養，細胞培養液及培養條件均與步驟( 相同，培養時載體膜片的底面浸于細胞培養液中，上皮面暴露于氣體中，形成氣液交界面，培養7 10天形成復層，構建得到全層人工生物角膜。
全文摘要
本發明公開了一種去細胞異種角膜基質載體及其制備方法和應用，該載體是經高滲溶液聯合酶消化法去除上皮細胞及基質細胞的動物板層角膜，載體的制備方法為首先取新鮮動物眼球，在手術顯微鏡下無菌操作，用直徑5mm～12mm的刻度環鉆鉆取150μm～400μm厚的板層角膜，然后在高滲溶液和胰酶/胰酶替代物的聯合作用下去除細胞，最后脫水干燥得到去細胞異種角膜基質載體，保存，備用。該去細胞異種角膜基質載體可作為角膜移植供體直接進行治療性角膜移植，也可作為人工生物角膜支架進行全層或板層的人工生物角膜的構建。本發明制備的去細胞異種角膜基質載體具有以下特點膠原排列整齊，與正常角膜組織相似，復水后透明性好。
文檔編號A61L27/36GK102294053SQ20111020730
公開日2011年12月28日 申請日期2011年7月24日 優先權日2011年7月24日
發明者劉先寧, 吳潔, 朱秀萍, 楊華, 潘士印, 肖湘華, 銀勇 申請人:陜西省眼科研究所