免疫調節組合物和其用途的制作方法

專利名稱：免疫調節組合物和其用途的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及免疫反應的調節。更特別地，本發明涉及基本上由Gag多肽或其 至少一部分，和可選的抗原呈遞細胞或其前體組成的組合物，用于治療或預防慢病毒感染， 包括相關的獲得性免疫缺陷疾病的治療或預防。在某些具體實施方式
中，該組合物基本由 多種重疊的和/或不重疊的源自單一 Gag多肽或源自不同Gag多肽的肽組成。本說明書中各種通過數字引用的出版物的書目詳情在本說明書的末尾列出。
背景技術：
需要有效的用于人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫治療方法。藥物治療終生伴有顯 著的毒性。迄今，幾個使用常規疫苗的HIV免疫治療嘗試在人類試驗中免疫原性差且效率 低下1_4。使用專能抗原呈遞細胞如樹突狀細胞遞送HIV免疫治療劑已經在獼猴(macaque) 和人類先導研究中顯示出功效但是限于高度專門化的設備5’6。一種簡單的減少長期抗逆轉 錄病毒治療(ART)需要的間歇型免疫治療方法將是治療HIV的一大進步。最近，本發明人開發了一種免疫治療方法，其涉及用重疊的病毒衍生的肽處理未 分級的全血或外周血單核細胞(PBMC)。顯著地，這一簡單的免疫治療方法，稱為OPAL (重疊 的肽脈沖的自體白細胞)，在遠親后代群體中產生了強有力的細胞介導的對抗病毒感染包 括HIV感染的免疫反應7’8。OPAL技術具有幾個優點，包括(1)不需要離體地長期培養抗原 呈遞細胞，(2)誘導針對結構和調節蛋白的CD4+和CD8+T細胞反應，和(3)促進產生肽抗原 在內。現在，本發明人發現，當短尾獼猴用暴露于重疊猿猴免疫缺陷病毒(SIV)肽的新 鮮血細胞免疫時，在針對單獨Gag免疫的動物(“OPAL-Gag動物”)和針對整個SIV基因組 免疫的動物(“0PAL-ALL動物”)之間沒有病毒結果的差異，這顯示單獨的Gag是用于T細 胞免疫治療方法的有效抗原。另外，出乎意料地發現在OPAL-Gag動物中Gag-特異性CD4+ 和CD8+T細胞反應顯著大于在OPAL-All動物中的Gag-特異性⑶4+和⑶8+T細胞反應，雖 然Gag重疊肽的劑量相同。這表明，在來自Gag的肽和其它SIV蛋白之間有抗原競爭性，也 表明，通過多蛋白HIV疫苗誘導免疫顯性的非Gag T細胞反應可以限制治療性或預防性Gag 特異性T細胞反應的開發。已經將這些發現引入新型組合物的實踐中和用于治療或預防慢 病毒感染，包括與那些感染相關的疾病的治療和預防方法的實踐中。

發明內容
因此，本發明的一個方面提供了治療或預防受試者慢病毒感染的方法，其中所述 方法基本上由增加受試者抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體的數目組成，所述抗原呈遞細 胞或抗原呈遞細胞前體在其表面上呈遞至少一個含有對應于Gag多肽一部分的氨基酸序 列的肽。這樣的抗原呈遞細胞和前體在本文也分別稱作“Gag特異性抗原呈遞細胞”和“Gag 特異性抗原呈遞細胞前體”。非限制性的抗原呈遞細胞包括樹突狀細胞、巨噬細胞和朗格漢 斯細胞。
本發明考慮到任何增加受試者Gag特異性抗原呈遞細胞或前體的數目的適當方 法。在一些具體實施方式
中，向受試者施予增加抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體的數目 的免疫刺激劑，所述抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體在其表面呈遞至少一個包含對應于 Gag多肽一部分的氨基酸序列的肽。在這類說明性例子中，免疫刺激劑是抗原呈遞細胞或 前體的形式，其在足以使抗原呈遞細胞或其前體呈遞Gag多肽或肽，或Gag多肽或肽的經處 理形式的條件下，與基本上由Gag多肽或至少一個含有對應于Gag多肽的氨基酸序列的肽 組成的組合物接觸一段時間。在其它說明性例子中，免疫刺激劑是抗原呈遞細胞或抗原呈 遞細胞前體的形式，其含有包含編碼Gag多肽或至少一個包含對應于Gag多肽一部分的氨 基酸序列的肽的核苷酸序列的核酸構建體，其中核苷酸序列可操作地連接至在抗原呈遞細 胞或其前體中可操作的調節元件。這樣的核酸構建體在本文也被稱為“表達Gag的核酸構 建體”。還是在其它說明性例子中，免疫刺激劑是基本上由至少一個Gag分子組成的組合物 的形式，所述Gag分子選自Gag多肽、含有對應于Gag多肽一部分的序列的肽或表達Gag的 核酸構建體。在這類說明性例子中，各個Gag分子是適合于引入(例如通過轉化、內化、內 吞作用或吞噬作用)抗原呈遞細胞或其前體的形式，其包括可溶的和顆粒形式的Gag分子。 在一些具體實施方式
中，顆粒含有Gag分子或Gag分子與顆粒結合，其說明性例子包括脂質 體、微粒、脂質顆粒、陶瓷/無機顆粒和聚合物顆粒。在一些具體實施方式
中，方法不包括向 受試者施予抗原呈遞細胞，所述細胞在其表面呈遞包含對應于其它慢病毒多肽的部分的氨 基酸序列的肽。在一些具體實施方式
中，方法不包括向受試者施予與其它慢病毒分子接觸 的其它慢病毒分子或抗原呈遞細胞，其中其它慢病毒分子選擇慢病毒的非Gag多肽、慢病 毒的非Gag多肽的部分或其中非Gag多肽或非Gag多肽部分可以表達的核酸構建體。在一 些具體實施方式
中，組合物含有由至少一個Gag分子組成的蛋白質性質的成分，所述Gag分 子選自Gag多肽、包含對應于Gag多肽一部分的序列的肽或表達Gag的核酸構建體。在某些具體實施方式
中，免疫刺激劑與藥學上可接受的載體和/或稀釋劑一起施 予。或者，或另外，免疫刺激劑與佐劑或與穩定上面廣泛描述的Gag分子而免受宿主的酶降 解的化合物一起施與。合適地，慢病毒選自人類免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺陷病毒 (SIV)。在一些具體實施方式
中，免疫刺激劑基本上由多個肽組成，其中各個肽包含對應 于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分，和可選地，與多個肽的至少一個其他肽顯示部分序 列同一性或相似性。在這類說明性例子中，在各個肽的一端或兩端含有部分序列同一性或 相似性。合適地，在一個或兩個這些末端上有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個連續的 氨基酸殘基，其序列與至少一個其它肽中含有的氨基酸序列相同或相似。在某些具體實施 方式中，肽的長度為至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29或30個氨基酸殘基，并且合適地不多于約500、200、100、80、60、50、40個氨基 酸的長度。合適地，選擇肽的長度從而增加細胞溶解性T淋巴細胞反應的產生(例如長度 為約8至約10個氨基酸的肽)或T輔助細胞淋巴細胞反應的產生(例如長度為約12至20 個氨基酸的肽)。在一些具體實施方式
中，肽序列源自至少約30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42.43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的對應于Gag多肽的序列。在特定的具體實施實施方式中，多個肽包含來自兩個或更多不同Gag多肽的肽。因此，在相關的方面，本發明考慮到用于在受試者中治療或預防慢病毒感染的方 法，其中該方法包括在受試者中增加Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特異性抗原呈遞細胞 前體的數目的方法，所述Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特異性抗原呈遞細胞前體在其表 面上呈遞至少一個包含對應于Gag多肽一部分的氨基酸序列的肽，其中Gag特異性抗原呈 遞細胞或Gag特異性抗原呈遞細胞前體通過如下方式產生在足以使抗原呈遞細胞或前 體在其表面上呈遞肽或肽的經處理形式的條件下，將抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體與 基本上由多個肽組成的組合物接觸一段時間，其中組合物的各個肽包含對應于Gag多肽的 氨基酸序列的不同部分和可選地，與多個肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似 性。在一些具體實施方式
中，向受試者施與Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特異性抗原呈 遞細胞前體。在其它具體實施方式
中，向受試者施與組合物。本發明的另一個方面提供用于治療與預防慢病毒感染的組合物，其中所述組合物 基本上由下列物質組成如上廣泛描述的Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特異性抗原呈遞 細胞前體，或如上廣泛描述的，選自Gag多肽、包含對應于Gag多肽一部分的序列的肽或表 達Gag的核酸構建體的至少一個Gag分子。在一些具體實施方式
中，所述Gag分子或每個 Gag分子是顆粒的形式。在相關的方面，本發明提供用于產生治療或預防慢病毒感染的抗原呈遞細胞的方 法。這些方法通常包括在足以使抗原呈遞細胞或其前體在其表面上呈遞包含對應于一部 分Gag多肽的氨基酸序列的至少一個肽的條件下，將抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體與 基本上由選自Gag多肽、包含對應于Gag多肽一部分的序列的肽或表達Gag的核酸構建體 (如上廣泛描述)組成的組合物接觸一段時間。合適地，當使用前體時，在足以從前體分化 抗原呈遞細胞的條件下培養前體一段時間。在一些具體實施方式
中，所述Gag分子或每個Gag分子實質上與純化的抗原呈遞 細胞或其前體的群體接觸。在其它的具體實施方式
中，單個Gag分子與抗原呈遞細胞或其 前體的異質群體接觸。在這些具體實施方式
中，細胞的異質群體可以是血或外周血單核細 胞。抗原呈遞細胞或其前體一般選自單核細胞、巨噬細胞、骨髓系細胞、B細胞、樹突狀細 胞或朗格漢斯細胞。還在其它的具體實施方式
中，將Gag分子與未培養的抗原呈遞細胞或 其前體的群體接觸。因此，未培養的群體可以是同質的或異質的，其說明性例子包括全血、 新鮮血或其組分，如但不限于，外周血單核細胞、全血的棕黃層組分、沉積的紅細胞、經輻射 的血、樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、天然殺傷細胞和天然殺傷T 細胞。在一些具體實施方式
中，與Gag分子接觸的未培養的群體ο未經歷激活條件。上面廣泛描述的Gag特異性抗原呈遞細胞還可以用于產生淋巴細胞，包括T淋巴 細胞和B淋巴細胞，用于調節針對Gag多肽的免疫反應。因此，在另一個方面，本發明提供 了用于產生Gag預處理的(primed)淋巴細胞的方法，其中所述方法包括在足以使淋巴細胞 對Gag多肽起始反應的條件下，將淋巴細胞或其前體的群體與如上廣泛描述的Gag特異性 抗原呈遞細胞接觸。在另一個方面，本發明包括用于在受試者中治療或預防慢病毒感染的方法。這些 方法通常包括以有效治療或預防慢病毒感染的量向受試者施與如上廣泛描述的免疫刺激 劑或如上廣泛描述的Gag預處理的淋巴細胞。在一些具體實施方式
中，免疫刺激劑或Gag預處理的淋巴細胞為全身給藥，通常通過注射進行。在相關的方面，本發明提供了用于在受試者中治療或預防獲得性免疫缺陷疾病的 方法。這些方法通常包括以有效治療或預防疾病的量向受試者施與如上廣泛描述的免疫刺 激劑或如上廣泛描述的Gag預處理的淋巴細胞。在另一個方面，本發明考慮到如上廣泛描述的免疫刺激劑或如上廣泛描述的Gag 預處理的淋巴細胞用于治療或預防選自慢病毒感染或獲得性免疫缺陷疾病的狀況的用途。 在一些具體實施方式
中，該用途包括制備適合于治療或預防該狀況的藥物。


圖1是說明OPAL接種的T細胞免疫原性的圖示。通過細胞內細胞因子染色隨時 間研究表達IFN-γ的SIV Gag特異性⑶4(a)和⑶8(b)T細胞。顯示了相對于對照的未 接種動物(圓圈)的疫苗組的平均值士標準誤差。獼猴的最初OPAL接種(箭頭，SIVma。251 感染后4、6、8和10周)由用重疊的SIV Gag 15mer肽(OPAL-Gag，三角)或跨越所有9個 SIV蛋白的肽(0PAL-A11，方塊)脈沖的自體PBMC組成。最初的接種在抗逆轉錄病毒治療 (ART)的覆蓋下施與。在相同的隨機組中，無ART，在39、42和42周用OPAL免疫治療再次激 發動物。在12周，在最后接種后的兩周，通過細胞內細胞因子染色在所有動物中評估相對 于跨越SIV Gag、Env、Pol的重疊肽或組合的調節/輔助蛋白質(Nef、Tat、Rev、Vif、Vpx, Vpr [Reg])集合的CD4(c)和⑶8 (d) T細胞的比例。另外，對SIV Gag CD8T細胞抗原決定簇 KP9的反應通過Mane-A*10/KP9四聚體評估。疫苗組的平均值士標準誤差與< 0. 10的兩 側t-檢驗ρ值一起顯示。(e)在所有21只活的OPAL免疫動物中，SW Gag特異性⑶8T細 胞反應與對非Gag(Env+P0l+調節蛋白質)反應總合的CD8T細胞反應是反向相關的。對合 并的群有> 50%⑶8T細胞反應的動物有50. 4%和54. 5%的總反應，主要是針對Env (分別 為50. 和54. 2% )。顯示了斯皮爾曼等級相關。圖2是顯示了 OPAL免疫治療效率的圖示。在最后接種后第10周撤掉抗逆轉錄病 毒治療(ART)，且隨后撤掉(a)血漿SIV RNA。利用ART控制了病毒血癥的26只動物用疫 苗組的平均值士標準誤差顯示。(b)顯示了接種和對照動物的存活。圖3是顯示了 OPAL接種的非Gag T細胞免疫原性的圖示。通過對Env (a、b)、 Pol (c、d)和跨越結合的調節/輔助蛋白質的重疊肽的集合的細胞內細胞因子染色隨時間 研究了表達IFN- γ的SIV特異性⑶4+和⑶8+T細胞(RTNVVV，e、f)。顯示了相對于未接 種的動物(圓圈)的免疫組的平均值士標準誤差。在第4-10周給予四個最初接種，在第 36-42周給予第二組的3個免疫接種。圖4是顯示了 CD8+T細胞Env應答者(responder)和Gag應答者之間的比較的圖 示。研究了 6只只有Env的應答者，3只只有Gag的應答者，具有Env和Gag特異性⑶8T細 胞反應的3只動物和7只未接種的對照。A.病毒裝載。B.外周⑶4T細胞水平。C.顯示了 在感染后第44周安樂死的6只只有Env應答者中的2只，在第64周安樂死的3只Gag應 答者中的0只，在第44周安樂死的具有Env和Gag特異性反應的3只動物中的2只，在第 64周安樂死的11只對照動物中的7只的存活圖。不包括ManeA*10陽性動物。最后，將進 行前進分析的觀察用于VL和CD4+T細胞的計數，其中動物在第64周前安樂死。
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具體實施例方式1.定義除非另有限定，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬的本領域技 術人員通常理解的相同意思。雖然與本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和 材料可以用于本發明的實施或測試中，描述了優選的方法和材料。為了本發明的目的，下面 限定了下列術語。本文使用的冠詞“a”和“an”是指一個或一個以上(例如至少一個)冠詞的語法 對象。通過舉例子的方式說明，“一個元件”意思是一個元件或一個以上的元件。“約”的意思是相對于參考的數量、水平、值、數目、頻率、百分率、尺寸、大小、量、重 量或長度以如30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 %—樣多改變的數量、水平、值、數
目、頻率、百分率、尺寸、大小、量、重量或長度。術語“激活條件”是指引起CD2、CD83、CD14、MHC I類、MHC II類和TNF_ a中的 每一個的表達的處理條件，所述表達的水平或功能活性由選自下列的激活處理條件引起 在選自細胞因子(例如IL-4、GM-CSF或I型干擾素)、趨化因子、促細胞分裂原、脂多糖的 試劑存在下或在抗原呈遞細胞或其前體中誘導干擾素合成的試劑存在下，孵育抗原呈遞細 胞或其前體；或將抗原呈遞細胞或其前體暴露于物理壓力。但是，應該理解的是，術語“激 活的條件”不包括引起細胞可忽略的激活的處理條件，例如當20 %、15 %、10 %、9 %、8 %、 7%,6%,5%,4%,3%,2%U%>0. 5%,0. 2%或 0. 1 % 以下的細胞被激活，或當 CD2、CD83、 ⑶14、MHCI類、MHC II類和TNF-a中每一個表達的水平或功能活性達到約10% (1/10)、 20% (1/5) ,30% (3/10) ,40% (2/5) ,50% (1/2) ,60% (3/5) ,70% (7/10) ,80% (4/5)或 90% (9/10)的經過上述激活處理條件處理的抗原呈遞細胞或其前體中的水平或功能活 性。“抗原”的意思是能夠在脊椎動物中優選在哺乳動物中引起免疫反應的全蛋白或 部分蛋白、肽或其他分子或大分子。這樣的抗原還與來自用所述蛋白、肽或其他分子或大分 子免疫的動物的抗體反應。“抗原結合分子”的意思是對靶抗原具有結合親和力的分子。應該理解的是，這一 術語擴展至源自顯示抗原結合活性的蛋白構架的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球 蛋白。“自體的”意思是源自相同生物體的某些東西(例如細胞、組織等)。本文使用的術語“異體的(allogeneic) ”是指具有不同遺傳組成的細胞、組織、器官等。“同種抗原”的意思是只在物種的一些成員中發現的抗原，如血型抗原。相反地， “異種抗原”是指在一個物種的成員中存在但不存在于另一個物種的成員的抗原。因此，“同 種異體移植(allograft) ”是相同物種成員之間的移植，“異種移植(xenograft) ”是不同物 種成員之間的移植。除非上下文需要，否則貫穿本說明書，單詞“包含(comprise) ”、“包含 (comprises) ”和“包含(comprising) ”將被理解為意指包括所述步驟或元素，或步驟或元 素的組但不排除任何其它的步驟或元素，或步驟或元素的組。因此，術語“包含”等的使用表 明所列元素是需要的或強制的，但是其它元素是可選的，和可以存在或可以不存在。“由…
10組成”意思是包括但限于短語“由…組成”后的任何事物。因此，短語“由…組成”表明所列 元素是需要的或強制的，且沒有其它元素可以存在。“基本上由…組成”的意思是包括任何 短語后所列的元素，且限于不干擾或影響本說明書中指定的所列元素的中活性或作用的其 它元素。因此，短語“基本上由…組成”表明所列元素是需要的或強制的，但是其他元素是 可選的和可以存在或可以不存在，而這取決于它們是否影響所列元素的活性或作用。如本文使用的，術語“培養(culturing) ”、“培養(culture) ”等是指體外使用的成 套過程，其中在顯示為支持細胞體外生長或維持的條件下孵育細胞群體(或單個細胞)。本 領域認得廣泛數目的形式、介質、溫度范圍、氣體濃度等，其需要在培養系統中限定。所述參 數將基于所選的形式和實施本文公開的方法的個體的特殊需要而變化。但是，應認識到培 養參數的確定在本質上是常規的。“對應于(corresponds to) ”或“對應于(corresponding to) ”的意思是編碼顯示 與靶抗原中的氨基酸序列本質上相似的氨基酸序列的抗原。通常，抗原將顯示與靶抗原的 至少一部分有約 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 的相 似性或同一性。在調節免疫反應或治療或預防疾病或狀況的上下文中，“有效量”的意思是以單一 劑量或作為一系列劑量的部分向需要其的個體施與有效調節、治療或預防的量的組合物。 有效量將根據待治療個體的健康和身體狀況、待治療個體的分類學組、組合物的組成、醫療 狀況的評估和其他相關的因素而改變。據預期，該量將落入可以通過常規試驗確定的相對 廣的范圍中。“表達載體”的意思是任何能夠指導載體編碼的蛋白合成的自主遺傳元件。這樣的 表達載體是本領域技術人員已知的。本文使用的術語“基因”是指任何和所有的細胞基因組的分離的編碼區，以及相關 的非編碼區和調節區。基因還預期指編碼特異性多肽的開放閱讀框、內含子和參與表達調 節的相鄰的5’和3’非編碼核苷酸序列。在這點上，基因可以進一步包含控制信號如啟動 子、增強子、終止子和/或與給定基因天然相連的多腺苷酸化信號，或異源控制信號。DNA序 列可以是cDNA或基因組DNA或其片段。基因可以引入合適的載體中用于染色體外維持或 用于整合進入宿主。如果一個化合物或組合物能夠進行下列操作，則其是“免疫原性的” :a)在首次用 于實驗的個體中產生針對抗原(例如病毒抗原)的免疫反應；或b)在個體中重建、激發或 維持超出不施與化合物或組合物時將發生的免疫反應的免疫反應。當施與單一或多劑量 時，如果化合物或組合物能夠獲得這些標準之一，其是免疫原性的。本文對“免疫相互作用”的參考包括對任何分子間的相互作用、反應或其他形式的 結合的參考，特別是其中分子之一是免疫系統的成分或免疫系統成分的模擬物。“分離的”的意思是本質上或基本上沒有在其天然狀態下正常伴隨其的成分的材 料。術語“慢病毒”包括和包含靈長類動物慢病毒，例如人類免疫缺陷病毒1和2 型(HIV-1/HIV-2)；來自黑猩猩(SIV。PZ)、烏白眉猴(SIVsJ、非洲綠猴(SIV_)、Syke氏猴(SIVsyk)、山魈(SIV d)和獼猴(SIVma。)的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒還包括貓科動物 慢病毒例如貓科動物免疫缺陷病毒(FIV)；牛族動物慢病毒，例如牛免疫缺陷病毒(BIV)； 綿羊慢病毒，例如梅迪/威斯納病毒(Maedi/Visnavirus，MVV)和山羊關節炎和腦炎病毒 (CAEV)；和馬科動物慢病毒，例如馬傳染性貧血病毒(EIAV)。除了 Gag、Pol和Env蛋白以 外，所有的慢病毒還表達至少兩個另外的調節蛋白質(Tat、Rev)。靈長類動物慢病毒產生其 它輔助蛋白質，包括Nef、Vpr、Vpu、VpX和Vif。通常，慢病毒是各種疾病，加上免疫缺陷，包 括神經退化和關節炎的病原體。各種慢病毒的核苷酸序列可以在GenBank中的下列登錄號 下找到(來自 J. M. Coffin, S. H. Hughes和H. E. Varmus,"Retroviruses"ColdSpring Harbor Laboratory Press, 199, 7p 804) : 1) HIV-1 :K03455、M19921、K02013、M38431、M38429、 K02007 和 M17449 ；2)HIV_2 :M30502、J04542、M30895、J04498、M15390、M31113 和 L07625 ；3) SIV :M29975、M30931、M58410、M66437、L06042、M33262、M19499、M32741、M31345 和 L03295 ； 4)FIV :M25381、M36968 和 U11820 ；5)BIV. M32690 ；6)EIAV :M16575、M87581 和 U01866 ；6)威 斯納病毒:M10608、M51543、L06906、M60609 和 M60610 ；7) CAEV :M33677 ；和 8)綿羊慢病毒 M31646和M34193。各種慢病毒多肽的氨基酸序列還在這些GenBank登錄中提供。還可以 從美國模式培養物保藏所(ATCC)中獲得慢病毒DNA。例如，貓科動物免疫缺陷病毒可以在 ATCC保藏號VR-2333和VR-3112下獲得。馬傳染性貧血病毒A可以在ATCC保藏號VR-778 下獲得。山羊關節炎和腦炎病毒可以在ATCC保藏號VR-905下獲得。威斯納病毒可以在 ATCC保藏號VR-779下獲得。“調節”的意思是直接地或間接地增加或減少個體的免疫反應。在某些具體實施方 式中，“調節(modulation) ”或“調節(modulating)，，的意思是與抗原不存在或比如果單獨 使用抗原時相比，所需的/所選的反應更有效(例如至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 % 或更多)，更快(例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更多)，強度更大(例如至 少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更多)，和/或更容易被誘導(例如至少10%、20%、 30%、40%、50%、60%或更多)。本文使用的術語“可操作連接的(operably connected) ”或“可操作連接的 (operably linked) ”的意思是將結構基因置于調節元件(包括但不限于啟動子)的調節 控制之下，然后其控制基因的轉錄和可選的翻譯。在異源啟動子/結構基因組合的構建中， 通常優選的位置為遺傳序列或啟動子至基因轉錄起始位點的距離與該遺傳序列或啟動子 和在其天然環境中其控制的基因(即遺傳序列或啟動子源自于其的基因)之間的距離是大 約相同的。如本領域已知的，這一距離的一些變化是可以調節的而不喪失功能。相似地，關 于在調節序列元件控制下放置的異源基因，優選其定位由在其天然環境中的元件的定位限 定；即元件所源自的基因。術語“患者”、“受試者”、“宿主”或“個體”在本文可交換使用，是指任何受試者， 特別是脊椎動物受試者，更特別地是哺乳動物受試者，其需要治療或預防。合適的落入本 發明范圍的脊椎動物包括但不限于任何脊索動物亞門的成員，包括靈長類、嚙齒類(例如 小鼠大鼠、豚鼠)、兔類(例如家兔、野兔)、牛類(例如牛(cattle))、綿羊類(例如綿羊 (she印))、山羊類(例如山羊)、豬類(例如豬)、馬類(例如馬)、犬類(例如狗)、貓類(例 如貓)、鳥類(例如雞、火雞、鴨、鵝，伴侶鳥例如金絲雀、相思鸚鵡(budgerigar)等)、海洋 哺乳動物(例如海豚、鯨)、爬行動物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和魚。優選的受試者是需要治療
12或預防狀況或疾病的靈長類(例如人、猴、黑猩猩)。但是，應該理解的是前面提到的術語不 意味著存在癥狀。“藥學上可接受的載體”的意思是可以安全地用于局部或全身給藥的固體或液體 的填充劑、稀釋劑或封裝物質。本文可交換使用的“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸殘基的聚合物和其變體和 合成類似物。因此，這些術語應用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是合成的非 天然存在的氨基酸，如對應于天然存在的氨基酸的化學類似物以及天然存在的氨基酸聚合 物。本文對“啟動子”的參考采取其最廣泛的語境并且包括經典基因組基因的轉錄調 節序列，包括精確轉錄起始所需的TATA盒，具有或沒有CCAAT盒序列和根據發育和/或環 境刺激而改變基因表達的另外的調節元件(即上游激活序列、增強子和沉默子)，或以組織 特異性或細胞類型特異性的方式改變基因表達。啟動子通常位于其調節表達的結構基因的 上游或5’，但并非必須。另外，含有啟動子的調節元件通常位于基因轉錄的起始位點的2kb 內。根據本發明優選的啟動子可以含有一個或多個特異性調節元件的額外拷貝從而增強在 細胞中的表達，和/或改變其可操作連接的結構基因的表達的周期。術語“純化的多肽”或“純化的肽”的意思是多肽或肽基本上沒有來自所述多肽或 肽源自的細胞或組織來源的細胞材料或其他污染性蛋白，或當被化學合成時基本上沒有化 學前體或其他化學品。“基本上沒有”的意思是本發明的Gag多肽或肽的制備物是至少10% 純的。在某些具體實施方式
中，Gag多肽或肽的制備物具有約30%、25%、20%、15%、10% 和目標的5% (干重)以下的非肽蛋白(本文也稱作“污染性蛋白”)或化學前體或非肽化 學品。本發明包括分離的或純化的至少0. 01,0. 1,1. 0和10毫克干重的制備物。本文使用的術語“重組的多核苷酸”是指在體外通過操作核酸使成為自然中正常 情況下不能發現的形式形成的多核苷酸。例如，重組多核苷酸可以是表達載體的形式。通 常，這樣的表達載體包括與核苷酸序列可操作連接的轉錄和翻譯調控核酸。“重組的多肽”意思是使用重組技術，即通過表達重組多核苷酸制備的多肽。“調控元件”或“調控序列”的意思是在特定宿主細胞中表達可操作連接的編碼序 列所需的核酸序列(例如DNA)。適合原核細胞的調控序列例如包括啟動子和可選的，順式 作用序列如操縱基因序列和核糖體結合位點。適合真核細胞的控制序列包括啟動子、多腺 苷酸化信號、轉錄增強子、翻譯增強子、調節mRNA穩定性的引導或尾隨序列以及將轉錄的 多核苷酸編碼的產物靶向細胞內的胞內隔室或細胞外環境的靶向序列。術語“序列同一性”和“同一性”在本文可交換使用，是指在比較窗口上在核苷 酸_核苷酸的基礎上或氨基酸_氨基酸的基礎上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分 比”是通過下述步驟計算而得在比較窗口上比較兩個最佳比對序列，確定在兩個序列中發 生相同核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如Ala、Pr0、Ser、Thr、Gly、Val、 Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Iys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys 和 Met)的位置的數目而產生 匹配位置的數目，匹配位置的數目除以比較窗口中位置的總數(即窗口大小)并將該結果 乘以100從而產生序列同一性的百分比。為了本發明的目的，將理解的“序列同一性”意思 是通過DNASIS計算機程序(windows的為2. 5版本；可以從Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA獲得)并使用軟件隨附的參考手冊中使用的標準缺省值計算的“匹配百分比”。術語“序列相似性，，和“相似性”在本文可交換使用，是指相同的或如以下表 1中定義的組成保守性置換的氨基酸的百分比數目。相似性可以使用序列比較程序如 GAP(Deveraux 等人 1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)確定。以這種方式，與那 些本文引用的序列具有相似的或基本上不同長度的序列可以通過向比對中插入空位而得 以比較，這樣的空位可以例如通過GAP使用的比較算法而確定。用于描述兩個或多個多核苷酸或多肽之間序列關系的術語包括“參考序列”、“比 較窗口 ”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本上同一”。“參考序列”是長度上為 至少12但經常是15至18，且通常是至少25個單體單元，包括核苷酸和氨基酸殘基。由于 兩個多肽可以每個均包含(1)在兩個多肽之間相似的序列(即只有完整多肽序列的一部 分)，和⑵兩個多肽之間不同的序列，兩個(或更多)多肽之間的序列比較通常通過在“比 較窗口 ”上比較兩個多肽的序列而進行，從而鑒定和比較序列相似性的局部區域。“比較窗 口 ”是指至少6個連續位置，通常約50至約100個連續位置，更通常約100至約150個連 續位置的概念片段(segment)，其中兩個序列最佳比對后序列與具有相同連續位置數目的 參考序列比較。與用于兩個序列最佳比對的參考序列(其不包含添加或刪除)相比，比較 窗口可以包含約20%或以下的添加或刪除(即空位)。用于比對比較窗口的最佳序列比 對可以通過計算機化的算法實施(Wisconsin Genetics Software Package Release7. 0， Genetics Computer Group, 575Science Drive Madison，WI，美國的 GAP、BESTFIT、FASTA， 和TFASTA)或通過任意的各種所選方法產生的檢查和最佳比對(即在比較窗口引起最高百 分比同源性)進行。還可以參考如例如Altschul等人，1997，Nucl. Acids Res. 25 :3389公 開的程序的BLAST家族。序列分析的詳細討論可以在Ausubel等人“Current Protocols in Molecular Biology”，John ffiley&Sons Inc，1994-1998，第 15 章 19. 3 單元中找到。“基本上純化的群體”等的意思是在所選類型的抗原呈遞細胞的群體中大于細胞 的約80 %，通常大于約90 %，更通常大于約95 %，通常大于約98 %，和更通常大于約99 %。“治療”的意思是至少改善與困擾宿主的病理狀況相關的癥狀，其中改善以廣泛的 意義使用，是指至少減少參數的強度，例如與治療的病理狀況相關的癥狀，如每單位血中的 病毒顆粒的數目。照這樣，治療還包括病理狀況或至少與其相關的癥狀被完全抑制(例如 防止發生或停止，例如終止)的情況，以至宿主不再患有病理狀況或至少沒有病理狀況的 特征的癥狀。本文使用的術語“非培養的”是指一群細胞(或單個細胞)，其從動物中移出并在 不引起細胞在體外生長或擴增，或引起細胞的可忽略的生長或擴增(例如與在孵育或處理 的開始的細胞數目相比，細胞數目增加約50%,40%,30%,20%,15%,10%,9%,8%,7%, 6%,5%,4%,3%,2%U%>0. 5%,0. 2%或0. 以下)的條件下孵育或處理。在某些希望 的具體實施發生中，在支持細胞在體外維持的條件下孵育或處理細胞群體(或單個細胞)。“載體”的意思是核酸分子，合適地為源自例如質粒、噬菌體或植物病毒的DNA分 子，其中核酸序列可以被插入或克隆。載體優選含有一個或多個單一限制性位點并且能夠 在限定的宿主細胞包括靶細胞或組織或其祖細胞或組織中自主復制，或可以與限定的宿主 的基因組整合，以便克隆的序列可以復制。因此，載體可以是自主復制的載體，即作為染色 體外實體存在的載體，其復制不依賴染色體的復制，例如線性的或閉環的質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以包含任何保證自我復制的成分。或者，載體可以是 這樣的載體當被引入宿主細胞中時，其整合至基因組中并與其整合進入的染色體一起復 制。載體系統可以包含單個載體或質粒、兩個或更多載體或質粒，其一起含有待引入宿主細 胞的基因組中的總DNA或轉座子。載體的選擇通常取決于載體與需要引入載體的宿主細胞 的相容性。載體還可以包括選擇性標記，如可以用于選擇合適的轉化子的抗生素抗性基因。2.縮寫貫穿本申請，使用下列的縮寫AIDS =獲得性免疫缺陷疾病APC =抗原呈遞細胞ART =抗逆轉錄病毒治療BIV =牛免疫缺陷病毒CAEV =羊關節炎和腦炎病毒cm=厘米CTL =細胞毒T淋巴細胞EIAV =馬傳染性貧血病毒FIV =貓免疫缺陷病毒g =克G-CSF =粒細胞集落刺激因子GM-CSF =粒細胞巨噬細胞集落刺激因子hr=小時HIV =人免疫缺陷病毒IFN-y = Y 干擾素IFN-a = a 干擾素IL=白介素IV =靜脈內mAb =單克隆抗體mL =毫升mg=毫克u g =微克u L =微升um=微米MVV =梅迪/威斯納病毒nm=納米NF_KB=核因子 KBOPAL =重疊肽脈沖的自體白細胞(overlapping p印tide—pulsedautologous leukocytes)PMBC =外周血單核細胞pro-GP =祖細胞生成素(progenipoietin)SIV=猿猴免疫缺陷病毒CN TGF^ =轉化生長因子βTNF=腫瘤壞死因子VL =病毒裝載VLP =病毒樣顆粒3.基于慢病毒Gag抗原的免疫調節組合物本發明部分基于以下令人驚訝的發現在只免疫了 SIV Gag的動物與免疫了整個 SIV基因組的動物之間沒有病毒結果的差異。另外，出乎意料地發現，抗SIVGag以及其它 SIV抗原的免疫誘導免疫顯性的非Gag T細胞反應，其可以限制治療性或預防性Gag特異性 T細胞反應的發展。基于這些觀察，本發明人提出，受試者中的慢病毒治療或預防不需要針 對最寬的多蛋白慢病毒疫苗，而是基本上通過增加受試者中抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞 前體(本文還分別稱作Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特異性抗原呈遞細胞前體)可以獲 得，所述細胞或細胞前體呈遞包含對應于Gag多肽一部分的氨基酸序列的至少一個肽。因 此，本發明提供了治療或預防受試者中慢病毒感染的方法，其中所述方法基本上由增加受 試者中Gag特異性抗原呈遞細胞或前體的數目組成。在一些具體實施方式
中，該方法包括向受試者施與增加Gag特異性抗原呈遞細胞 或其前體的有效量的免疫刺激劑。例如，免疫刺激劑可以基本上由Gag多肽或包含對應于 Gag多肽一部分的氨基酸序列的至少一個肽(本文還稱作Gag肽)組成。或者，免疫刺激劑 可以基本上由包含Gag多肽或至少一個Gag肽的編碼序列的核酸構建體(可操作地連接至 調控序列)組成。在其它的說明性例子中，免疫刺激劑基本上由自體或異體Gag特異性抗 原呈遞細胞或其前體組成。非限制性的抗原呈遞細胞包括樹突狀細胞、巨噬細胞和朗格漢 斯細胞。因此，在說明性例子中，可以通過下列方法增加Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特 異性抗原呈遞細胞前體的數目(1)向受試者施與抗原呈遞細胞或前體(例如來自受試者的自體抗原呈遞細胞或 前體或來自組織相容的供體的異體抗原呈遞細胞或前體)，所述細胞或前體已經在使抗原 呈遞細胞或其前體足以呈遞Gag多肽或肽，或Gag多肽或肽經處理的形式的條件下與基本 上由Gag多肽或包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的至少一個肽組成的組合物接觸(例如 離體的或體內的)一段時間；(2)向受試者施與抗原呈遞細胞或前體(例如來自受試者的自體抗原呈遞細胞或 前體或來自組織相容的供體的異體抗原呈遞細胞或前體)，所述細胞或前體含有包含核苷 酸序列的核酸構建體(本文也稱為表達Gag的核酸構建體)，所述核苷酸序列編碼Gag多肽 或包含對應于Gag多肽一部分的氨基酸序列的至少一個肽，其中核苷酸序列可操作地連接 至在抗原呈遞細胞或其前體中可操作的啟動子；(3)向受試者施與基本上由至少一個Gag分子組成的組合物，所述Gag分子選自 Gag多肽、包含對應于Gag多肽一部分的序列的肽或表達Gag的核酸構建體。Gag分子是可 溶的或顆粒的形式。3. IGaR多肽和肽本發明考慮到全長Gag多肽以及肽(本文也稱作Gag肽)的用途，所述肽包含對 應于全長Gag多肽的部分的氨基酸序列，用于產生Gag特異性抗原呈遞細胞或前體。說明
16性的肽包含存在于全長Gag多肽中的至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400 或 500 個連續的氨
基酸殘基，或幾乎達氨基酸的總數。通常，Gag肽是可以被抗原呈遞細胞或其前體處理和/ 或呈遞的合適的大小。一些因素可以影響肽大小的選擇。例如可以選擇肽的大小以至其包 括或對應于CD4+T細胞抗原決定部位、CD8+T細胞抗原決定部位和/或B細胞抗原決定部位 和其處理需要的大小。本領域技術人員將認識到I類限制的CD8+T細胞抗原決定部位的長 度通常在8至10個氨基酸殘基之間，并且如果被置于非天然側翼殘基旁邊，這樣的抗原決 定部位通常需要2至3個天然的側翼氨基酸殘基以保證它們可以有效的被處理和呈遞。II 類限制的CD4+T細胞抗原決定部位的長度通常在12至25個氨基酸殘基之間的范圍，并且 有效的蛋白水解處理可以不需要天然側翼殘基，雖然據信天然側翼殘基可以起作用。II類 限制的抗原決定部位的另一個重要特征是其在中間通常含有9-10個氨基酸殘基的核心， 所述核心特異性結合至II類MHC分子，在該核心的兩側具有側翼序列，以不依賴序列的方 式通過與II類MHC抗原兩側上的保守結構結合而穩定結合。因此，II類限制的抗原決定 部位的功能區的長度通常在15個氨基酸殘基以下。線性B細胞抗原決定部位的大小和影 響其處理的因素如II類限制的抗原決定部位是非常可變的，雖然這樣的抗原決定部位的 大小經常小于15個氨基酸殘基。從上述內容可見，肽的大小為至少6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、20、25、30個氨基酸殘基是有利的但不是必須的。合適地，肽的大小不在約500、200、 100、80、60、50、40個氨基酸殘基以上。在一些具體實施方式
中，肽的大小大得足以最小化T 細胞和/或B細胞抗原決定部位的損失。在其它的具體實施方式
中，肽的大小足以使抗原 呈遞細胞呈遞肽中含有的T細胞和/或B細胞抗原決定部位。在這類說明性例子中，肽的 大小為約15個氨基酸殘基。本領域中已知許多Gap多肽序列和其對應的編碼序列，其可以用于制備純化的、 合成的或重組的Gag多肽和肽或其編碼序列。說明性的Gag多肽序列可以從任何公開可 獲得的數據庫，包括GenBank, EMBL和SffISSPROT中獲得。例如，代表性的HIV-IGag多 肽序列可以從GenBank的下列登錄號下獲得AAB04036、AAB03744、AAB59875、AAA44853、 AAB04036、AAB50258、AAA44987 和 AAB59747。非限制性的 HI V_2Gag 多肽序列可以從 GenBank 的下列登錄號下獲得AAB00736、AAA76840、AAA43932、AAB00745、AAB00763、AABO1351 和AAA43941。另外，說明性的SIV Gag多肽序列可以從GenBank的下列登錄號下獲得 AAA91905、AAA91913、AAA47588、AAA91922、AAA74706、AAA47632、AAB59905、AAA91930 和 AAB59769。代表性的FIV Gag多肽序列可以從GenBank的下列登錄號下獲得AAB59936、 AAA43075和AAB09309。非限制性的BIV Gag多肽序列的例子可以從GenBank的下列登錄 號下獲得AAA91270。說明性的ElAVGag多肽序列可以從GenBank的下列登錄號下獲得 AAB59861和AAA43003。非限制性的威斯納Gag多肽序列可以從GenBank的下列登錄號下 獲得AAA17520、AAA48353、AAA48358、AAA17523 和 AAA17528。代表性的 CAEVGag 多肽序列 可以從GenBank的下列登錄號下獲得AAA91825。說明性的綿羊慢病毒Gag多肽序列可以 從GenBank的下列登錄號下獲得AAA66811和AAA46779。但應該理解的是，本發明不限于 任何特定的Gag氨基酸或核酸序列并且廣泛延伸至任何天然或重組的Gag多肽或其編碼序 列。在特別的具體實施方式
中，多個肽用于產生Gag特異性抗原呈遞細胞或其前體，其中各個肽包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可選地，顯示與多個肽的至少 一個其他肽的部分序列同一性或相似性。部分序列同一性或相似性通常包含在各個肽的一 端或兩端。在一個具體實施方式
中，在各個肽的一端或兩端有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、20、25、30、40、50個連續的氨基酸殘基，其序列與至少一個其它肽中包含的氨基 酸序列相同或相似。在可選的具體實施方式
中，在各個肽的一端或兩端有500、100、50、40、 30個以下的連續氨基酸殘基，其序列與至少一個其它肽中包含的氨基酸序列相同或相似。 這樣的‘序列重疊’有利于防止或減少Gag多肽內包含的任何潛在抗原決定部位的損失。在 本文公開的特別的例子中，序列重疊為11個氨基酸殘基。在某些具體實施方式
中，各個肽的大小為約14或15個氨基酸殘基，并且在各個肽 的一端或兩端重疊的序列為約11個氨基酸殘基。但是應該理解的是，本發明考慮到其它合 適的肽大小和序列重疊大小，其可以容易地被本領域技術人員確定。通常，當肽具有部分序列相似性時，其序列通常有一個或多個保守的和/或非保 守的氨基酸置換的差異。示例性的保守的置換在表1中列出。保守的或非保守的置換可以 對應于Gag內的多態性。在這一點上，熟知的是多態性的Gag多肽通過不同的病毒株或分 化枝(clade)表達。因此，在Gag中有多態性區域的地方，通常需要使用額外幾套覆蓋多態 性位點上的氨基酸殘基變異的肽。有利地但不用必須使用Gag多肽的全序列以產生多個重疊的肽。通常使用對應 于 Gag 多肽的序列的至少 330、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42. 43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99%以產生重疊的肽。但是，應該理解的是，用于產生重疊肽的來自Gag多肽的序列信 息越多，重疊肽作為免疫原的遠親繁殖群體的覆蓋度越大。合適地，無來自Gag多肽的序列 信息被排除在外(例如由于明顯缺少免疫的抗原決定部位，因為更稀少的或亞顯性的抗原 決定部位會不可避免的丟失)。如果需要，Gag多肽內的高可變序列可以從一套重疊肽的構 建中被排除，或可以構建或施與另外幾套覆蓋多態性區域的肽。肽序列可以包括不源自Gag 多肽的額外序列。這些額外的序列可以具有各種功能，包括增加可溶性、穩定性或免疫原性 或有利于純化。通常，這樣的額外序列包含在各自肽的一端或兩端上。可以基于任何合適的Gag氨基酸序列設計重疊肽，其說明性例子在上面以及在表 4和5中列出。用于調節針對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和/或嵌合體SIV-HIV-I (SHIV)的 免疫反應的代表性重疊肽(已知兩者是人類中致病性HIV-I病毒的合適模型)，可以基于一 個或多個下表2和3中列出的Gag多肽序列。可以通過本領域技術人員已知的任何合適的過程制備Gag多肽和肽。例如， 可以使用溶液合成或固相合成方便的合成Gag肽，如例如Atherton和Sh印hard(1989、 Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach. IRL Press, Oxford)中的第 9章和Roberge等人(1995，Science 269:202)中描述的。合成可以使用例如t_叔丁氧 羰基(t-Boc)或 9-芴甲氧羰基(Fmoc)化學(見 Coligan 等人 Current Protocols in ProteinScience, John Wiley&Sons， Inc.1995—1997 第 9. 1 章；Stewart 禾口 Young，1984， SolidPhase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chemical Co. , Rockford, 111 ；禾口上面 的Atherton和Sh印hard)。在特別的具體實施方式
中，各個肽以高濃度(Img肽/10-30 μ LDMS0)溶解于DMSO(例如100%純的DMS0)以便當大量集中的肽被脈沖至細胞時不含有過 量的DMS0。在某些有利的具體實施方式
中，可溶形式的一套或多套肽為了方便地向受試者 給藥被置于單個容器中(例如再輸注即時可用的輸血導管或瓶)并且這樣的容器也被本發 明考慮到了。或者，可以通過包括下列步驟的過程制備Gag多肽或肽(a)制備包含編碼Gag多 肽或肽的核苷酸序列的核酸構建體，其中核苷酸序列被可操作地連接至調控序列；(b)將 核酸構建體引入至合適的宿主細胞；(c)培養宿主細胞以表達核苷酸序列；和(d)分離Gag 多肽或肽。核酸構建體通常是表達載體的形式。例如，表達載體可以是自我復制的染色體 外載體，如質粒，或整合進入宿主基因組的載體。通常，調控序列包括但不限于啟動子序列、 引導或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列和增強子或 激活子序列。本發明考慮到本領域已知的組成性或誘導性啟動子。啟動子可以是天然存在 的啟動子或組合了一個以上啟動子元件的混合啟動子。調控序列通常適合于用于表達的宿 主細胞。許多類的用于各種宿主細胞的合適的表達載體和合適的調控多核苷酸在本領域是 已知的。在某些具體實施方式
中，表達載體含有可選擇的標記基因以允許選擇轉化的宿主 細胞。選擇基因在本領域是熟知的并將隨著使用的宿主細胞改變。在其它的具體實施方式
中，表達載體還包括編碼融合伴侶(partner)的核酸序列以便Gag多肽或肽作為融合多肽 與融合伴侶一起表達。融合伴侶的主要優點是其幫助融合多肽的鑒定和/或純化。舉例性 的融合伴侶包括但不限于谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麥芽糖結合蛋白 (MBP)和六組氨酸(HIS6),其特別有用于通過親和色譜分離融合多肽。為了通過親和色譜 純化融合蛋白的目的，用于親和色譜的相關基質分別為谷胱甘肽、直鏈淀粉和鎳或鈷共軛 連接的樹脂。許多這樣的基質可以以試劑盒的形式獲得，如與(His6)融合伴侶一起使用的 QIAexpress 系統(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統。在優選的具體實施方式
中，重組多 核苷酸在商業載體PFLAG 中表達。有利地，融合伴侶還具有蛋白酶切割位點如Factori^ 凝血酶和內蛋白(inteins，蛋白內含子)的切割位點，其允許相關蛋白酶部分消化本發明 的融合多肽從而釋放重組Gag多肽或源自其的肽。然后被釋放的Gag多肽或肽可以通過隨 后的色譜分離從融合伴侶中分離出來。根據本發明的融合伴侶的范圍還包括“抗原決定部 位標簽”，其通常是短的肽序列，其特異性抗體是可以獲得的。抗原決定部位標簽(其特異性 單克隆抗體是容易獲得的)的熟知例子包括c-Myc、流行性感冒病毒、血細胞凝集素和FLAG 標簽。可以通過使用任何合適的技術，包括轉染和轉化，實現將核酸構建體引入宿主細 胞的步驟，所述技術的選擇取決于應用的宿主細胞。這樣的方法對本領域技術人員是熟知 的。可以通過培養用合成構建體轉化的宿主細胞產生本發明的肽。適用于蛋白質表達的條 件隨選擇的表達載體和宿主細胞而變化。這可以容易地被本領域的技術人員通過常規實驗 而確定。用于表達的合適的宿主細胞可以是原核的或真核的。用于表達根據本發明的多肽 的一個優選的宿主細胞是細菌。使用的細菌可以是大腸桿菌(Escherichia coli)。或者， 宿主細胞可以是昆蟲細胞，例如可以與桿狀病毒表達系統一起使用的SF9細胞。Gag多肽或肽的氨基酸可以是非天然存在的或天然存在的。肽合成過程中非天 然的氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羥 基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、t- 丁基甘氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、苯基
19甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、2_噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-同分異構體。本發明考慮到的 非天然氨基酸的名單顯示于表6中。本發明還考慮到使用一般的分子生物學技術修飾Gag多肽和肽以便改變其對蛋 白降解的抗性或優化溶解性質或使其更適于作為免疫原性試劑。3. 2用于基因治療的表汰Gag的核酸構津體在特別的具體實施方式
中，將可操作地連接至調控元件的包含Gag編碼序列的核 酸構建體用于經由基因治療制備Gag特異性抗原呈遞細胞。基因治療是指通過向受試者施 與表達的或可表達的核酸進行的治療。在本發明的這些具體實施方式
中，核酸構建體在抗 原呈遞細胞中產生其編碼的Gag多肽或肽，從而介導所需的治療或預防效果。可以根據本發明使用任何本領域中可獲得的用于基因治療的方法。下面描述了示 例的方法。基因治療方法的一般性綜述參見Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 12: 488505(1993) ； ；Wu 禾口 Wu，Biotherapy 3:8795(1991) ；Tolstoshev, Ann.Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 573596(1993) ；Mulligan, Science 260 =926932 (1993)；和 Morgan 和 Anderson, Ann. Rev.Biochem. 62 191217 (1993) ；TIBTECH11(5) 155215(1993 年 5 月))。 可以使用的本領域中公知的重組DNA技術的方法在Ausubel等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY(1993)；禾口 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)中有描述。可以通過將患者直接暴露于核酸構建體或通過首先用核酸構建體在體外轉化抗 原呈遞細胞或其前體，然后將經轉化的抗原呈遞細胞或前體移植進入患者而實現向抗原呈 遞細胞或前體遞送核酸構建體。這兩個方法分別作為體內或離體基因治療是已知的。如所述的，例如在美國專利號5，976，567 (Inex)中，天然的或合成的核酸的表達 通常通過將目的核酸可操作地連接至啟動子(其可以是組成性的或誘導性的)而實現， 通常將構建體整合進入表達載體，并將載體引入合適的宿主細胞。典型的載體含有轉錄和 反應終止子、轉錄和反應起始序列和用于調控特定核酸表達的啟動子。載體可選地包含 遺傳表達盒，其含有至少一個獨立的終止子序列、允許在真核生物或原核生物或兩者(例 如穿梭載體)中復制該盒的序列和用于原核和真核系統二者的選擇標記。載體可以在原 核生物、真核生物或優選兩者中適于復制和整合，參見Giliman和Smith(1979)，Gene,8 81-97 ；Roberts等人(1987) ,Nature, 328 :731_734 ；Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger) ；Sambrook ^A (1989), Molecular Cloning-Α Laboratory Manual(2nd ed. )Vol. 1-3, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N. Y. , (Sambrook)；禾口 F. M. Ausubel 等人·，Current Protocols in Molecular Biology, eds. , Current Protocols, a joint venturebetween Greene Publishing Associates, Inc.和 John ffiley&Sons, Inc.，(1994 增刊)(Ausubel)。含有來自真核病毒如逆轉錄病毒的調控元件的表達載體通常用于表達真核細胞 中的核酸序列。SV40載體包括pSVT7和pMT2。源自牛乳頭瘤病毒的載體包括pBV_lMTHA， 源自EB病毒的載體包括pHEBO和p205。其它示例的載體包括pMSG、pAV009/A+、pMTOlO/ A+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE和任何其它在SV-40早期啟動子、SV-40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或其它 對真核細胞中表達顯示有效的啟動子的指導下允許表達蛋白的載體。雖然可以使用各種載體，應該注意的是，病毒表達載體可以用于修飾真核細胞，因 為病毒載體轉染靶細胞和整合進入靶細胞基因組具有高效率。說明性的這類表達載體可以 源自病毒DNA序列，包括但不限于腺病毒、腺相關病毒、單純性皰疹病毒和逆轉錄病毒如B、 C和D逆轉錄病毒以及泡沫病毒和修飾的慢病毒。用于轉染動物細胞的合適的表達載體例 如被 Wu 和 Ataai (2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2), 205-208) ,Vigna 和 Naldini (2000， J. Gene Med. 2 (5)，308-316) ,Kay 等人(2001，Nat. Med. 7 (1)，33-40) ,Athanasopoulos 等人 (2000，Int.J. Mol. Med. 6(4)，363-375)和 Walther 和 Stein(2000，Drugs 60(2)，249-271) 所描述。表達載體的編碼Gag的部分可以包含天然存在的序列或其變體，其已經使用重組 技術被工程化。在變體的一個例子中，編碼抗原的多核苷酸的密碼子組成被修飾以允許使 用國際出版物WO 99/02694和WO 00/42215中詳細列出的方法增強抗原在靶細胞或所選組 織中的表達。簡而言之，這些方法基于這樣的觀察不同密碼子的翻譯效率在不同的細胞或 組織之間變化并且這些差異可以與基因的密碼子組成一起被應用以便調控蛋白在特定細 胞或組織類型中的表達。因此，為了構建密碼子優化的多核苷酸，至少一個現有的親代多核 苷酸密碼子用相對于其所替換的現有密碼子在靶細胞或組織中具有更高翻譯效率的同義 密碼子替換。雖然希望用具有更高翻譯效率的同義密碼子替換所有現有的親代核酸分子的 密碼子，但這不是必須的，因為甚至用部分替換就可實現表達增加。合適地，替換步驟影響 5%、10%、15%、20%、25%、30%，更優選地35%、40%、50%、60%、70%或更多的現有親代 多核苷酸的密碼子。表達載體與其引入的抗原呈遞細胞或前體相容以便編碼抗原的多核苷酸在所述 細胞或前體中是可表達的。可以使用任何合適的方法將表達載體引入抗原呈遞細胞或 前體，這將取決于表達載體的特定選擇和使用的抗原呈遞細胞。這樣的引入方法對本領 域技術人員是熟知的。例如，可以利用接觸(例如在病毒載體的情況下)、電穿孔、轉化、 轉導、共軛連接或三親交配、轉染、用陰離子脂質進行的感染膜融合、用包被DNA的微粒 (microprojectile)的高速轟擊、用磷酸鈣-DNA沉淀進行的孵育、直接顯微注射入單個 細胞等影響引入。其它的方法也是可獲得的并且對于本領域技術人員是已知的。或者， 利用陰離子脂質的方法，例如脂質體，引入載體。這樣的脂質體是商業上可獲得的(例如 Lipofectin<D、Lipofectamine 等，由 Life Technologies^Gibco BRL、Gaithersburg，Md.提 供)。在其它的具體實施方式
中，通過將核酸構建體與進行受體介導的內吞作用的 配體一起施與將其引入抗原呈遞細胞或其前體(參見例如Wu和Wu，J. Biol. Chem. 262 44294432(1987))(其可以用于靶向特異性表達受體的細胞類型)等。還是在其它的具 體實施方式中，可以形成核酸-配體復合物，其中配體包含可產生融合(fusogenic)的 病毒肽以便破壞內含體，以允許核酸構建體避免溶酶體降解。仍是在其他的具體實施方 式中，可以通過靶向特異性受體在體內靶向核酸構建體以使細胞特異性攝取和表達(參 見例如1992年4月16日的PCT公布WO 92/06180 (Wu等人)；1992年12月23日的WO 92/22635 (Wilson 等人)；1992 年 11 月 26 日的 W092/20316 (Findeis 等人)；1993 年 7 月22 日的 W0093/14188 (Clarke 等人)；禾口 1993 年 10 月 14 日的 WO 93/20221 (Young))。或 者，可以通過同源重組將核酸引入細胞內并整合進入宿主細胞DNA，以進行表達(Koller和 Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 89328935 (1989) ；Zijlstra 等人，Nature 342 435438(1989))。另一個基因治療的方法包括將核酸構建體轉移至組織培養中的細胞，其通常包括 將選擇標記轉移至細胞。然后將細胞置于選擇之下以便分離那些已經攝取并表達所述經轉 移的基因的細胞。然后，將這些細胞遞送入患者。在這一具體實施方式
中，在體內施與所得 重組細胞前，將核酸構建體引入抗原呈遞細胞或前體。可以通過本領域中的任何已知方法 進行這樣的引入，包括但不限于轉染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌體 載體進行的感染、細胞融合、染色體介導的基因轉移、微孔介導的基因轉移、原生質體融合 等。用于將外源基因引入細胞的許多技術在本領域是已知的(參見例如Loeffler和Behr， Meth. Enzymol. 217 599618 (1993) ；Cohen 等人，Meth. Enzymol. 217 618644 (1993) ；Cline, Pharmac. Ther. 29 :6992 (1985))，并且可以根據本發明使用，只要受體細胞必需的發育和生 理功能不被破壞。該技術應該提供核酸向細胞的穩定轉移，以便核酸可以被細胞表達和優 選地被其細胞后代遺傳和表達。可以通過各種本領域中已知的方法將所得的重組細胞遞送 至患者。重組抗原呈遞細胞通常通過靜脈內施與。3. 3顆粒
具體實施例方式在一些具體實施方式
中，如3. 1部分中廣泛描述的Gag多肽或肽或如3. 2部分中 廣泛描述的表達Gag的核酸構建體(在本文也稱作“免疫刺激劑”或“Gag免疫刺激劑”)以 顆粒的形式提供(在本文也稱作“Gag顆粒”)。這些具體實施方式
對于向抗原呈遞細胞或 其前體在離體的或在體內遞送免疫刺激劑是特別有利的，因為顆粒優選地被這樣的細胞攝 取(例如通過內吞作用或吞噬作用)。各種顆粒可以用于本發明，包括但不限于脂質體、微 粒、脂質顆粒、陶瓷/無機顆粒和聚合物顆粒，并且通常選自納米顆粒或微粒。適當地調整 顆粒的大小以用于抗原呈遞細胞或其前體的吞噬作用或內吞作用。抗原呈遞細胞包括專能和兼性類型的抗原呈遞細胞。專能抗原呈遞細胞包括但不 限于巨噬細胞、單核細胞、B淋巴細胞、骨髓系細胞包括單核細胞-粒細胞-DC前體、邊緣區 枯否細胞(marginal zone Kupffer cells)、小膠質細胞、T細胞、朗格漢斯細胞和樹突狀細 胞包括指突狀樹突狀細胞和濾泡樹突狀細胞。兼性抗原呈遞細胞的例子包括但不限于激活 的T細胞、星形膠質細胞、濾泡細胞、內皮細胞和成纖維細胞。在一些具體實施方式
中，抗原 呈遞細胞選自單核細胞、巨噬細胞、B-淋巴細胞、骨髓系細胞、樹突狀細胞或朗格漢斯細胞。 在特別的具體實施方式
中，抗原呈遞細胞表達CDllc并且包括樹突狀細胞。在說明性的例 子中，顆粒具有約100 μ m以下的尺寸，更適合地在等于約500nm或以下的范圍內，雖然顆粒 可大至約10 μ m和小至幾個nm。脂質體基本上由在水核周圍形成外殼的磷脂雙層組成。優 點包括“模擬”細胞的外膜層的外層的親油性及相對容易被各種細胞攝取。聚合物載體通 常由生物相容的聚合物形成的微/納米球和微/納米膠囊組成，其是生物可降解的(例如 聚乳酸)或不能生物降解的(例如乙烯醋酸乙烯酯)。聚合物裝置的一些優點是容易制造 和高承載能力、直徑大小的范圍為從納米至微米以及受控制的釋放和降解特征。在一些具體實施方式
中，顆粒在其表面上包含抗原結合分子，其與在抗原呈遞細 胞上(例如樹突狀細胞)(相對于在非抗原呈遞細胞上)有更高水平的表達的標記有免疫相互作用。這類的說明性的標記包括MGL、DCL-I、DEC-205、巨噬細胞甘露糖R、DC-SIGN 或其它DC或骨髓特異性的(凝集素)受體，如例如Hawiger等人(2001，J Exp Med 194， 769)，Kato 等人 2003，J Biol Chem 278，34035)，Benito 等人(2004，J Am Chem Soc 126， 10355) ,Schjetne 等人 2002，Int Immunol 14，1423)和 van Vliet 等人 2006，Nat Immunol Sep 24 ；[電子版在印刷版之前])(van Vliet 等人 Immunobiology 2006，211 :577_585)所 公開的。可以從免疫刺激劑和表面活性劑、賦形劑或聚合物材料的組合制備顆粒。在一些具體實施方式
中，顆粒是生物可降解的和生物相容的，可選地能夠以受控制的速率生物降 解以用于遞送治療或診斷試劑。顆粒可以由各種材料制成。無機的和有機的材料都可以使 用。可以使用聚合物的和非聚合物的材料，如脂肪酸。其它合適的材料包括但不限于明膠、 聚乙二醇、海藻糖、葡聚糖和殼聚糖。基于因素如顆粒材料，可以設計和制備具有從幾秒至 幾個月范圍的降解和釋放時間的顆粒。3. 3.1聚合物顆粒聚合物顆粒可以從任何生物相容的和所需的生物可降解聚合物、共聚物或混合物 中形成。可以專門制作聚合物以優化顆粒的不同特征，包括i)待遞送的免疫刺激劑和聚 合物之間的相互作用，以提供免疫刺激劑的穩定性和遞送時活性的保留；ii)聚合物降解 的速率，從而影響試劑釋放速率的特征；iii)通過化學修飾的表面特征和定向能力；和iv) 顆粒的多孔性。可以使用表面侵蝕的聚合物如聚酐來形成顆粒。例如，可以使用聚酐如聚[(P-羧 基苯氧基)-己烷酐](PCPH)。生物可降解的聚酐在美國專利號4，857，311中有描述。在其它的具體實施方式
中，可以使用大塊侵蝕聚合物，如那些基于聚酯的聚合物， 包括聚(羥基酸)或聚(酯)。例如，可以使用聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或其共聚物 來形成顆粒。聚酯還可以具有帶電荷的或官能化基團，如氨基酸。在說明性的例子中，具 有受控制的釋放性質的顆粒可以由聚(D，L-乳酸)和/或聚(D，L-乳酸乙醇酸共聚物) (“PLGA”)形成，其加入了表面活性劑如DPPC。其它聚合物包括聚氰基丙烯酸烷基酯(polyfelkylcyanoacrylates))、聚酰胺、聚 碳酸酯、聚烯烴(polyalkylenes)如聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚對苯 二甲酸乙酯(poly (ethylene ter印hthalate))、聚乙烯化合物如聚乙烯醇、聚乙烯醚和聚 乙烯酯、丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物、纖維素和其它多糖和肽或蛋白，或其共聚物或混合 物。可以選擇或修飾聚合物而在體內具有合適的穩定性和降解速率以用于不同的受控制的 藥物遞送應用。在一些具體實施方式
中，顆粒從功能化的聚酯移植共聚物形成，如Hrkach等 人(1995, Macromolecules, 28 4736-4739 ；禾口“Poly(L—Lactic acid-co—amino acid) GraftCopolymers :A Class of Functional Biodegradable Biomaterials，，in Hydrogels andBiodegradable Polymers for BioappIications, ACS Symposium Series No. 627, RaphaelM. Ottenbrite ^A Eds.，American Chemical Society, Chapter 8, pp. 93-101, 1996.)中描述的。生物可降解的聚合物之外的材料可以用于形成顆粒。合適的材料包括各種不能生 物降解的聚合物和各種賦形劑。顆粒還可以從免疫刺激劑和表面活性劑單獨形成。
聚合物顆粒可以使用單和雙乳化溶劑蒸發、噴霧干燥、溶劑提取、溶劑蒸發、相分 離、簡單和復雜凝聚法、界面聚合作用和其它本領域普通技術人員熟知的方法制備。顆粒可 以使用本領域已知的制作微球或微膠囊的方法制備，只要優化條件以形成具有所需直徑的 顆粒。用于制作遞送封裝試劑的微球而開發的方法在文獻中有描述，例如在Doubrow， Μ. , Ed. , "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,，，CRC Press, Boca Raton, 1992 中描述的。方法還在 Mathiowitz 禾口 Langer (1987，J. ControlledRelease 5,13-22) ；Mathiowitz 等人(I987，Reactive Polymers 6,275-283)；和 Mathiowitz 等 人(1988，J. Appl. Polymer Sci. 35，755-774)以及美國專利號 5，213，812、美國專利號 5，417，986、美國專利號5，360，610和美國專利號5，384，133中有描述。方法的選擇取決 于聚合物的選擇、大小、外部形態和所需的結晶度，例如Mathiowitz等人(1990，Scanning Microscopy 4 329-340 ； ； 1992, J. Appl. Polymer Sci. 45，125-134)；和Benita等人(1984， J. Pharm. Sci. 73，1721-1724)所述的。在例如Mathiowitz 等人(1990)，Benita ；和授予 Jaffe 的美國專利號 4，272，398 中所述的溶劑蒸發中，聚合物溶解于揮發性有機溶劑，如二氯甲烷。可以使用幾個不同的聚 合物濃度，例如在0. 05至2. Og/mL之間。將可溶形式或作為細顆粒分散的免疫刺激劑加入 聚合物溶液，將混合物懸浮于含有表面活性試劑如聚(乙烯醇)的水相中。水相可以是例 如蒸餾水中濃度為的聚(乙烯醇)w/v。將所得乳劑攪拌直到大多數有機溶劑蒸發，剩 下固體的微球，其可以用水洗滌并在冷凍干燥器中干燥過夜。可以通過這一方法獲得具有 不同大小(在1至1000 μ m之間)和形態的微球。最初設計溶劑的去除以用于較不穩定的聚合物，如聚酐。在這一方法中，將試劑分 散或溶解于在揮發性有機溶劑如二氯甲烷中的所選聚合物的溶液中。然后將混合物懸浮于 油中，如硅油，通過攪拌而形成乳劑。在24小時內，溶劑擴散進入油相，乳劑小滴變硬進入 固體聚合物微球。不同于例如Mathiowitz等人(1987，Reactive Polymers,6 275)中描 述的熱熔微膠囊化方法，這一方法可以用于從具有高熔點和寬分子量范圍的聚合物制作微 球。用這一過程可以獲得具有例如在1至300 μ m之間直徑的微球。對于一些聚合物系統，使用單或雙乳劑技術制備的聚合物顆粒的大小根據小滴的 大小而變化。如果在油包水乳劑中的小滴大小不適于形成具有所需大小范圍的顆粒，可以 制備更小的小滴，例如通過乳劑的超聲處理或勻漿，或通過加入表面活性劑。如果通過任何上述方法制備的顆粒的大小范圍在所需范圍以外，可以使用例如篩 子改變顆粒的大小，并根據密度使用本領域技術人員已知的技術進一步分離。可以通過噴霧干燥制備聚合物顆粒。噴霧干燥的方法如由Sutton和Johnson申 請的PCT WO 96/09814所公開的，其公開了水溶性材料的光滑球形微粒(至少90%的顆粒 具有1-10 μ m的平均大小)的制備。3. 3. 2陶瓷顆粒陶瓷顆粒也用于遞送本發明的免疫刺激劑。這些顆粒通常使用與熟知 的溶膠_凝膠過程相似的過程制備，并且通常需要簡單的和室溫的條件，如例 如 Brinker 等人("Sol-Gel Science :The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing ； ”AcademicPress :San Diego,1990, p-60)禾口 Avnir 等 人(1994，Chem.
24Mater. 6,1605)中描述的。可以以所需大小、形狀和多孔性制備陶瓷顆粒，并且非常穩定。 這些顆粒還有效地保護摻雜的分子(多肽、藥物等)免受極端PH和溫度誘發的變性(Jain 等人1998，J. Am. Chem. Soc. 120，11092-11095)。另外，其表面可以容易地用不同的基團功能 化(Lal 等人 2000，Chem. Mater. 12,2632-2639 ；Badley 等人 1990，Langmuir, 6, 792-801), 因此可以將其連接至各種單克隆抗體或其它配體上以便將它們在體內靶向所需的位點。已經描述了用于在體內遞送含有活性試劑的有效負荷(payloads)的各種陶瓷顆 粒。例如英國專利1590574公開了將生物活性成分加入溶膠-凝膠基質中。國際公布WO 97/45367公開了通過溶膠-凝膠過程制備的可控制的可溶的二氧化硅干凝膠，其中通過浸 漬入預燒結的顆粒(1至500μπι)或圓盤加入生物活性試劑。國際公布WO 0050349公開了 通過溶膠_凝膠過程制備的可控制地生物可降解的二氧化硅纖維，其中在纖維合成過程中 加入生物活性試劑。美國專利申請公布20040180096描述了其中加入生物活性物質的陶瓷 納米顆粒。通過染料的膠束組合物形成制備陶瓷納米顆粒。將陶瓷材料加入膠束組合物，并 通過堿水解沉淀陶瓷納米顆粒。美國專利申請公布20050123611公開了受控制釋放的包含 在整個顆粒中本質上均質分散的活性材料的陶瓷顆粒。通過將表面活性劑與無極性溶劑混 合制備這些顆粒以制備反膠束溶液；(b)將凝膠前體、催化劑、凝結劑和可溶的活性材料溶 解于極性溶劑中以制備前體溶液；(c)將反膠束溶液與前體溶液結合以提供乳劑和(d)凝 結乳劑中的前體。美國專利申請公布20060210634公開了通過蒸發將生物活性物質吸附至 包含金屬氧化物(例如氧化鈦、氧化錯、氧化鈧、氧化鈰和氧化釔)的陶瓷顆粒上。Kortesuo 等人(2000，Int J Pharm. May 10 ；200 (2) =223-229)公開了一種噴霧干燥方法，用于產生 受控制遞送藥物如枸櫞酸托瑞米芬和右旋美托咪啶HCl的具有窄顆粒大小范圍的球形硅 膠顆粒。Wang 等人(2006，Int J Pharm. 308(1-2) 160-167)描述了通過多孔 CaCO3 微粒 的吸附和通過聚合電解質多層膜的封裝的組合，以用于遞送生物活性物質。3. 3. 3 脂質體可以通過Kim等人(1983，Biochim.Biophys. Acta 728,339-348) ；Liu等人(1992， Biochim. Biophys. Acta 1104,95-101) ；Lee φ 人(1992, Biochim. Biophys. Acta.1103, 185-197)，Brey 等人(U. S. Pat. Appl. Pub. 20020041861)，Hass 等人(U. S. Pat. Appl. Pub. 20050232984) ,Kisak 等人(U. S. Pat. Appl. Pub. 20050260260)和 Smyth-TempIeton 等 人(美國專利申請公布20060204566)報道的那些標準方法制備脂質體。另外，可以參考 Copeland等人(2005，Immunol. Cell Biol. 83 95-105)綜述的用于遞送抗原的基于脂質 的顆粒組成和 Bramwell 等人(2005，Crit Rev TherDrug Carrier Syst. 22(2) :151_214 ； 2006，J Pharm Pharmacol. 58 (6) :717_728)綜述的用于疫苗的顆粒遞送系統，包括制備負 載蛋白的脂質體的方法。使用各種不同脂質成分的許多脂質體組成已經用于各種體外細 胞培養和動物實驗中。已經鑒定了確定脂質體性質的參數并且在文獻中有報道，例如Lee 等人(1"2，Biochim. Biophys. Acta. 1103,185-197) ；Liu 等人(1"2，Biochim. Biophys. Acta, 1104,95-101)；和 Wang 等人(1989，Biochem. 28，9508-951)。簡而言之，將溶解于有機溶劑中的選擇的脂質(和任何有機可溶的生物活性劑) 混合并在真空下干燥在玻璃管底。通過輕柔旋轉并使用含有任何水溶性的待封裝的生物活 性劑的緩沖水溶液將脂質膜再水化。然后，可以通過擠壓進一步處理水化的脂質小囊泡，進 行一系列凍融循環或脫水，然后再水化從而促進生物活性劑的封裝。然后，可以通過離心洗滌脂質體或加載至大小排阻的柱上以從脂質體組成中去除未包入的生物活性劑，并儲存在 40C ο 在 Thierry 等人(1992，Nuc. Acids Res. 20 5691-5698)中更詳細地描述了用于脂質 體制備的基本方法。運送免疫刺激劑的有效負荷的顆粒可以使用Pautot等人(2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，100 (19) 10718-21)中描述的過程制備。通過使用Pautot等人的技術，抗 生物素蛋白鏈菌素包被的脂質(DPPC、DSPC和相似的脂質)可以用于制備脂質體。Needham 等人(2001，Advanced Drug Delivery Reviews, 53 (3) :285_305)描述的藥物封裝技術可以 用于向這些小囊泡中加載一個或多種活性試劑。可以通過將各種脂質混合物的氯仿溶液暴露至高真空并隨后用pH4的緩沖液水 化所得的脂質膜(DSPC/CH0L)，在冷凍和融化過程后將它們從聚碳酸酯膜擠出制備脂質體。 可以使用添加了 DSPC或膽固醇的DPPC增加封裝的效率或增加穩定性等。通過加入堿化試 劑調整膜泡外介質的pH至7. 5而產生跨膜pH梯度。隨后，可以通過在升高的溫度下以小 等份將免疫刺激劑的溶液加入膜泡溶液中封裝Gag免疫刺激劑，從而允許積累脂質體內的 免疫刺激劑。其它適于遞送本發明的免疫刺激劑的基于脂質的顆粒如泡囊在Copeland等人 (2005, Immunol. Cell Biol. 83 :95_105)中有描述。3. 3. 4 彈道顆粒(Ballistic particles)本發明的免疫刺激劑可以連接至(例如通過包被或共軛連接)適用于無針的或 “彈道”(生物導彈)遞送的顆粒或與之結合。用于彈道遞送的說明性顆粒在例如國際公布 WO 02/101412 ；WO 02/100380 ；WO 02/43774 ；WO 02/19989 ；W001/93829；WO 01/83528 ；WO 00/63385 ；WO 00/26385 ；WO 00/19982 ；WO 99/01168 ；WO 98/10750 和 WO 97/48485 中有描 述。但應理解的是，這樣的顆粒不限于與彈道遞送設備一起使用，還可以通過將顆粒遞送至 免疫細胞的任何可選擇的技術(例如注射或纖維針遞送)施與。使用本領域已知的各種技術可以包被免疫刺激劑或將其化學偶聯至載體顆粒上 (例如核心載體)。載體顆粒選自具有通常用于細胞內遞送的顆粒大小范圍的適當密度的 材料。當然，最佳載體顆粒的大小將取決于靶細胞的直徑。說明性的顆粒具有的大小為從 約0. 01至約250 μ m,從約10至約150 μ m,和從約20至約60 μ m ；顆粒的密度為從約0. 1至 約25g/cm3，堆積密度為約0. 5至或約3. Og/cm3或更大。這類非限制性顆粒包括金屬顆粒如 鎢、金、鉬和銥載體顆粒。直徑為0. 5至2. 0 μ m的平均大小的鎢顆粒容易獲得。還可以使用 金顆粒或微晶體金顆粒(例如金粉A1570，可以從Engelhard Corp.，East Newark,N. J.獲 得)。金顆粒提供均勻的大小(從Alpha Chemicals可以獲得，顆粒大小為1-3 μ m，或可以 從Degussa, SouthPlainfield, N. J.獲得，顆粒大小范圍包括0. 95 μ m)和低毒性。微晶體 金提供不同的顆粒大小分布，通常在0. 1-5μπι的范圍。微晶體金的不規則表面面積提供與 本發明的活性試劑的高效包被。用于吸附、偶聯或連接生物活性分子(例如親水性分子如蛋白和核酸)至顆粒如 金或鎢顆粒的許多方法是已知的并已經被描述。在說明性例子中，這樣的方法將預定量的 金或鎢與生物活性分子、CaCl2和亞精胺組合。在其它的例子中，乙醇用于將生物活性分子 沉淀在金或鎢顆粒上(參見例如Jumar等人，2004，Phys Med. Biol. 49 =3603-3612)。在包 被的過程中適當持續地振蕩所得的溶液可以保證反應混合物的均勻。在連接生物活性分子后，可以將顆粒轉移至例如合適的膜并允許在使用前干燥，包被在樣品組件或盒的表面上， 或加載至遞送盒，以用于特定顆粒介導的遞送設備。可以使用標準技術將配置的組合物適當制備為顆粒，如通過簡單蒸發(空氣干 燥)、真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥(凍干)、噴霧冷凍干燥、噴霧包被、沉淀、超臨界流體顆 粒形成等。如果需要，可以使用國際公布WO 97/48485中描述的技術修飾所得的顆粒。3. 3. 5表面活性劑可以加入顆粒的表面活性劑包括磷酸甘油酯。示例的磷酸甘油酯包括磷脂酰膽 堿，如天然存在的表面活性劑、L-α-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(“DPPC”)。表面活性劑有利于 通過例如減少顆粒_顆粒相互作用改善表面性質，并可以使顆粒的表面粘附性變小。使用 對肺是內源性的表面活性劑可以避免使用非生理性表面活性劑的需要。假設在顆粒表面上的表面活性劑可以減少顆粒由于相互作用如靜電相互作用、范 德華力和毛細管作用聚集的傾向。顆粒表面上的表面活性劑的存在可以提供增加的表面粗 造性(糙度)，從而通過減少顆粒_顆粒親密相互作用可用的表面面積增加煙霧化。可以使用本領域已知的表面活性劑，包括任何天然存在的表面活性劑。其它示 例的表面活性劑包括雙磷脂酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪醇如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙 烯-9-十二烷基醚；表面活性脂肪酸，如棕櫚酸或油酸；三油酸山梨坦((Span85)；甘氨膽 酸鹽；表面活性肽(surfactin)；泊洛沙姆(poloxamer)；山梨聚糖脂肪酸酯如三油酸山梨 坦；泰羅沙伯(tyloxapol)和磷脂。3. 4抗原旱.遞細胞
具體實施例方式在一些具體實施方式
中，用于增加受試者中Gag特異性抗原呈遞細胞數目的免疫 刺激劑是抗原呈遞細胞或其前體，其獲自需要治療的受試者(即自體抗原呈遞細胞或前 體)或獲自與受試者的MHC匹配的或不匹配的供體(即異體抗原呈遞細胞)。所希望地，供 體與受試者是組織相容的。在這些具體實施方式
中，通過將抗原呈遞細胞或前體與下列物 質接觸產生Gag特異性抗原呈遞細胞或前體(i)在例如3. 1部分中所述的Gag多肽或Gag 肽，其合適地是例如3. 3部分中所述的可溶的形式或顆粒的形式，或(ii)在例如3. 2部分 中所述的表達Gag的核酸構建體，其合適地是例如3. 3部分中所述的可溶的形式或顆粒的 形式，上述物質的量和接觸的時間足以使抗原呈遞細胞或前體在其表面上呈遞Gag肽。3. 4. 1抗原呈遞細胞和其前體的來源可以通過本領域技術人員已知的方法分離抗原呈遞細胞或其前體。這樣的細胞的 來源將根據調節特異性免疫反應所需的抗原呈遞細胞而變化。在本文中，抗原呈遞細胞可 以選自樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞或其它骨髓系細胞。通常，可以從任何組織中分離抗原呈遞細胞的前體，但是最容易地是從血、臍 帶血或骨髓中分離(Sorg 等人，2001，Exp Hematol 29，1289-1294 ;Zheng 等人，2000，J Hematother Stem Cell Res 9，453-464)。還可能從疾病組織如類風濕滑膜組織或在活組 織檢查或關節帶(joint tap)后的液體(Thomas 等人，1994a，J Immunol 153，4016-4028 ； Thomas等人，1994b，Arthritis Rheum 37(4))。其它例子包括但不限于肝、脾、心、腎、 腸和扁桃體(Lu 等人，1994，J Exp Med 179，1823-1834 ;McIlroy 等人，2001，Blood 97， 3470-3477 ;Vremec 等人，2000，J Immunol 159，565-573 ;Hart 和 Fabre，1981，J Exp Med 154(2)，347-361 ；Hart 和 McKenzie，1988，J Exp Med 168 (1)，157-170 ；Pavli 等人，1990，
27Immunology 70(1), 40-47)。從組織中直接分離的白細胞提供抗原呈遞細胞前體的主要來源。通常，通過在存 在或不存在各種生長因子的情況下培養這些前體才可以使其僅分化成抗原呈遞細胞。根 據本發明的實踐，抗原呈遞細胞可以從粗混合物或從部分或基本上純化的前體制備物中如 此分化。可以通過密度梯度離心，使用例如去除中性粒細胞和紅細胞(外周血單核細胞或 PBMC)的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll Hypaque)，或通過氯化銨裂解紅細胞(白細胞或白血 細胞)從血或骨髓中方便的純化白細胞。許多抗原呈遞細胞的前體作為不繁殖的單核細胞 存在于外周血中，其可以通過在特異性細胞因子存在的情況下培養而分化成特異性的抗原 呈遞細胞，包括巨噬細胞和樹突狀細胞。通常可以通過切碎組織(例如真皮的基底層)和用膠原酶或分散酶消化，接著通 過密度梯度分離或基于細胞表面標記的表達選擇前體，獲得源自組織的前體如組織樹突狀 細胞或朗格漢斯細胞的前體。例如，朗格漢斯細胞前體表達CDl分子以及HLA-DR并且可以 基于此被純化。在一些具體實施方式
中，抗原呈遞細胞前體是巨噬細胞的前體。通常，這些前 體可以從任何來源的單核細胞獲得，并可以通過在存在介質和巨噬細胞集落刺激因子 (M-CSF)的情況下延長孵育而被分化為巨噬細胞(Erickson-Miller等人，1990，Int J Cell Cloning 8，346-356 ；Metcalf 和 Burgess，1982，J Cell Physiol,111，275—283)。在其它的具體實施方式
中，抗原呈遞細胞前體是朗格漢斯細胞的前體。通常，朗 格漢斯細胞可以從人單核細胞或CD34+骨髓前體、在存在粒細胞/巨噬細胞集落刺激因 子(GM-CSF)、IL-4/TNF α 和 TGF β 的情況下產生(Geissmann 等人，1998，J ExpMed, 187, 961-966 ；Strobl 等人，1997a，Blood 90,1425-1434 ；Strobl 等人，1997b，dvExp Med Biol 417，161-165 ;Strobl 等人，1996，J Immunol 157,1499-1507)。還在其它的具體實施方式
中，抗原呈遞細胞是樹突狀細胞的前體。幾個潛在的樹 突狀細胞前體可以從外周血、臍帶血或骨髓中獲得。這些包括單核細胞、CD34+干細胞、粒細 胞、CD33+CDllc+DC前體和定型的骨髓祖細胞-在下面描述。單核細胞可以在存在組織培養基(例如RPMI)和血清(例如人或胎牛血清)的情況下 或在無血清培養基中，通過附著至塑料1-2小時純化單核細胞(Anton等人，1998，Scand J Immunol 47，116-121 ;Araki 等人，2001，Br J Haematol 114，681-689 ;Mackensen 等 人，2000，Int J Cancer 86，385-392 ;Nestle 等人，1998，Nat Med 4，328-332 ;Romani 等 A, 1996, J Immunol Meth 196，137-151 ;Thurner 等人，1999，J Immunol Methods 223， 1-15)。還可以從外周血中淘選單核細胞(Garderet等人，2001，J Hematother Stem Cell Res 10,553-567)。還可以通過免疫親和技術，包括免疫磁性選擇、流式細胞儀分選或淘選 (Araki 等人，2001，上文；Battye 和 Shortman，1991，Curr. Opin. Immunol. 3,238-241)并使 用抗CD14抗體獲得CD14hi細胞而純化單核細胞。可以通過體內使用各種細胞因子，包括 GM-CSF，增加循環的單核細胞的數目(因此增加產量)(Groopman等人，1987，N Engl J Med 317,593-598 ;Hill 等人，1995，J Leukoc Biol 58,634-642) 可以通過在 GM-CSF 和 IL-4 存在下延長孵育使單核細胞分化成樹突狀細胞(Romani等人，1994，J Exp Medl80,83-93 ； Romani等人，1996，上文)。在GM-CSF和IL-4的每個濃度為約200至約2000U/mL之間將
28其組合，更優選地在約500至約1000U/mL之間和甚至更優選地在約800U/mL (GM-CSF)和 1000U/mL(IL-4)之間將其組合，產生顯著量的未成熟樹突狀細胞，即獲取抗原的吞噬性樹 突狀細胞。其它促進單核細胞向獲取抗原的吞噬性樹突狀細胞分化的細胞因子包括例如 IL-13。CD34+干細胞樹突狀細胞還可以在GM-CSF、TNFa 士干細胞因子(SCF、c-kitL)或GM-CSF、 IL-4士flt3L存在的情況下從源自CD34+骨髓的前體中產生(Bai等人，2002，Int JOncol 20，247-53 ;Chen 等人，2001， Clin Immunol 98，280-292 ;Loudovaris 等人，2001， J Hematother Stem Cell Res 10，569-578)。CD34+細胞可以源自骨髓抽吸或源自血，并可以 使用用于單核細胞的方法例如免疫磁性選擇或免疫柱被富集(Davis等人，1994，J Immunol Meth 175,247-257)。可以通過在體內使用各種細胞因子，包括(最常見的)G-CSF，但還 有flt3L和祖細胞生成素(progenipoietin)，增加血中CD34+細胞的比例(Fleming等人， 2001, Exp Hematol 29，943-951 ;Pulendran等人，2000，J Immunol 165,566-572 ；Robinson 等人，2000，J Hematother Stem CellRes 9,711-720)。其它的骨髓祖細胞可以用與⑶34+干細胞相似的方式在存在GM-CSF和IL-4/TNF的情況下從定型 的早期骨髓祖細胞中產生DC。這樣的骨髓前體浸潤許多炎癥中的組織，包括類風濕關節炎 滑膜液(Santiago-Schwarz 等人，2001，J Immunol. 167，1758-1768)。包括循環的樹突狀 細胞前體和單核細胞的總體骨髓細胞的擴增可以使用某些細胞因子，包括flt-3配體、粒 細胞集落刺激因子(G-CSF)或祖細胞生成素(pro-GP)完成(Fleming等人，2001，見上文； Pulendran等人，2000，見上文；Robinson等人，2000，見上文)。向人類或其它哺乳動物施與 這樣的細胞因子數日可以能夠使大量的前體從外周血或骨髓中產生，以用于體外操作。樹 突狀細胞可以在GM-CSF、IL-4和TNFa存在下從外周血中性粒細胞前體中產生(Kelly等 人，2001，Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 47，43-54 ;0ehler 等人，1998，J Exp Med. 187， 1019-1028)。應該注意的是，還可以使用相似的方法從急性骨髓白血病細胞中產生樹突狀 細胞(Oehler 等人，2000，Ann Hematol. 79，355-62)。 組織DC前體和其它來源的APC前體用于產生DC的其它方法來自于例如在IL-3+/-GM-CSF存在下的胸腺前體，在 GM-CSF和膠原基質存在下的肝DC前體。可以使用原癌基因產生經轉化的或永生的樹突狀 細胞系，如例如(Paglia等人，1993)所述的v-myc或(Banyer和Hapel，1999 ；Gonda等人， 1993)所述的myb。循環DC前體這些已經在人類和小鼠的外周血中有描述。還可以利用特定的細胞表面標記用于 鑒定合適的樹突狀細胞前體。特別地，各種樹突狀細胞前體群可以在血中通過表達CDllc 和不表達或低表達 CD14、CD19、CD56 和 CD3 鑒定(0' Doherty 等人，1994，Immunology 82， 487-493 ；0' Doherty 等人，1993，J Exp Med 178,1067-1078)。這些細胞還可以通過細胞 表面標記 CD13 和 CD33 鑒定(Thomas 等人，1993b，J Immunol 151 (12)，6840-6852)。已知是 類漿細胞樹突狀細胞前體的缺少⑶14、⑶19、⑶56和⑶3的第二亞型不表達⑶11c，但表達 0)123(11^-31 鏈)和!11^-01 爾&『1 18等人，2001，六111 J Pathol 159，237-243 ;Grouard 等人，1997, J Exp Med 185，1101-1111 ;Rissoan等人，1999，Science 283，1183-1186)。大多數循 環⑶Ilc+樹突狀細胞前體是HLA-DR+，但一些前體可以是HLA-DR-。已經明確地證明了外周 血樹突狀細胞前體缺少MHC II類的表達(del Hoyo等人，2002，Nature 415，1043-1047)。可選地，上述的⑶33+⑶14_λ°或⑶llc+HLA-DR+、譜系標記陰性的樹突狀細胞前體 可以通過在培養基或在單核細胞條件培養基中孵育18-36小時分化成更多成熟的抗原呈 遞細胞(Thomas 等人，1993b，見上文；Thomas 和 Lipsky，1994，J Immunol 153，4016-4028) (0' Doherty等人，1993，見上文)。或者，在孵育外周血非T細胞或未純化的PBMC后， 通過低密度鑒定成熟的外周血樹突狀細胞并因此可以用密度梯度純化，包括甲泛葡胺 禾口 Nycodenz 純化(Freudenthal 禾口 Steinman，1990，Proc Natl Acad Sci U S A 87， 7698-7702 ；Vremec 和 Shortman，1997，JImmunol 159，565-573)，或通過特異性單克隆抗 體，例如但不限于 CMRF-44mAb 純化(Feamley 等人，1999，Blood 93，728-736 ；Vuckovic 等 人，1998，Exp Hemat0126，1255-1264)。類漿細胞樹突狀細胞可以直接從外周血中基于細 胞表面標記被純化，然后在IL-3存在下孵育(Grouard等人，1997，見上文；Rissoan等人， 1999，見上文)。或者類漿細胞DC可以從上述的密度梯度或經孵育的外周血細胞的CMRF-44 選擇中產生。通常，對于從任何前體產生的樹突狀細胞，當激活因子如源自單核細胞的細胞因 子、脂多糖和含有CpC重復的DNA、細胞因子如TNF-α、IL-6、IFN-α、IL-Ιβ、壞死細胞、 再粘附(re-adherence)、全細菌、膜成分、RNA或polyIC存在下孵育未成熟的樹突狀細胞 時，其將被激活(Clark，2002，J Leukoc Biol，71，388-400 ；Hacker 等人，2002，Immunology 105,245-251 ；Kaisho 和 Akira，2002，BiochimBiophys Acta 1589，1-13 ;Koski 等人，2001， Crit Rev Immunol 21，179-189)。樹突狀細胞激活的這一過程在NF-κ B抑制因子的存在 下被抑制(0' Sullivan 和 Thomas，2002，J Immunol 168,5491-5498)。在一些具體實施方式
中，可以將抗原呈遞細胞或其前體的未培養群體引入受試 者，其未經歷激活條件。抗原呈遞細胞或其前體的未培養群體的說明性例子包括全血、新鮮 血或其組分，如但不限于外周血單核細胞(PMBC)、全血的棕黃層、濃縮紅細胞、經照射的血、 樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、天然殺傷細胞和天然殺傷T細 胞。在特別的具體實施方式
中，抗原呈遞細胞的未培養群體選自新鮮分離的血或PMBC。在 其它具體實施方式
中，抗原呈遞細胞的未培養群體是壞死的或細胞凋亡的群體。因此，細胞 的非培養群體可以與抗原接觸，然后經歷壞死的條件，這導致不可逆的細胞外傷(例如滲 透性沖擊或暴露于化學毒物，如戊二醛)，其中細胞的特征是線粒體和細胞質的明顯膨大， 然后是細胞的破壞和自溶。或者，非培養的細胞群體可以與本發明的生物活性分子接觸， 然后經歷細胞凋亡條件。可以使用本領域中已知的方法，包括但不限于病毒感染、用紫外線 照射、Y照射、類固醇、固定(例如用戊二醛)、細胞因子或通過在細胞培養基中去除供體 細胞的營養素，在體外或體內誘導表達或呈遞抗原的細胞進行細胞凋亡。時程研究可以確 定足以在細胞群體中最佳誘導細胞凋亡的孵育時間。例如，用流行性感冒病毒感染的單核 細胞在感染后6個小時開始表達細胞凋亡的早期標記。細胞凋亡的特異性標記的例子包括 Annexin V、TUNEL+細胞、DNA梯狀條帶和碘化丙啶的攝取。3. 4. 2離體遞送多肽或核酸可以用各種形式(包括核酸和多肽，其可以是可溶的或顆粒的)將本發明的Gag抗原呈遞細胞。需要與抗原呈遞細胞接觸的Gag免疫刺激劑的量可以由 本領域技術人員通過經驗確定。抗原呈遞細胞應該以足以使這些細胞在其表面上呈遞Gag 肽的時間暴露于Gag免疫刺激劑，以調節T細胞。在一些有利的具體實施方式
中，在Gag多 肽或Gag肽存在下孵育抗原呈遞細胞約48、36、24、12、8、7、6、5、4、3或2小時以下或甚至約 60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2分鐘以下)。可以使用脈沖追蹤規程確定細胞 可選地處理和呈遞Gag肽所需的時間和多肽的劑量，其中暴露于Gag抗原，然后清洗和暴露 于讀出系統，例如抗原反應性T細胞。一旦確定了細胞在其表面上表達Gag肽所需的最佳時 間和劑量，可以使用規程制備細胞和用于誘導免疫原反應的Gag抗原。本領域技術人員應 該認識到這一點抗原呈遞細胞在其表面上呈遞抗原所需的時間長短可以取決于抗原或使 用的抗原的形式、其劑量和使用的抗原呈遞細胞以及進行抗原加載的條件而變化。可以使 用常規過程由熟練的技術人員確定這些參數。可以通過在體外分析T細胞細胞毒活性或使 用抗原呈遞細胞作為CTL的靶標確定抗原呈遞細胞的引發效率。本發明還考慮到在暴露于 Gag抗原后可以檢測抗原呈遞細胞表面存在的Gag肽的本領域技術人員已知的其他方法。通常，約0. 1至20 μ g/mL的Gag抗原(例如Gag肽抗原)至約1百萬至1千萬的 抗原呈遞細胞適合于產生預處理的抗原特異性抗原呈遞細胞。通常，抗原呈遞細胞與抗原 在37°C孵育約1至6小時，雖然還可能在與一個或多個生長因子孵育的時期內將抗原呈遞 細胞暴露于Gag抗原。如本發明人以前確定的，肽抗原的成功呈遞可以使用更短的孵育時 間(例如約5、10、15、20、30、40、50分鐘)并使用濃度約10-20 μ g/mL的抗原獲得。如果需要，可以將所有抗原呈遞細胞或其一部分在合適的冷凍保存溶液中冷凍， 直到需要使用它們時。例如，可以將細胞稀釋在合適的培養基中，如含有10%自體血清 +10%磷酸緩沖鹽水中的二甲基亞砜的培養基。在某些具體實施方式
中，細胞以脫水的形式 保存。在一些具體實施方式
中，可以通過本領域技術人員已知的方法增加外源性Gag 抗原向抗原呈遞細胞的遞送。例如，已經開發了幾個不同的策略以將外源性抗原遞送至 抗原呈遞細胞，特別是樹突狀細胞的內源性處理途徑。這些方法包括將抗原插入PH敏感 的脂質體(Zhou和Huang，1994，Immunomethods 4，229-235)、可溶性抗原的胞飲細胞攝 取后的吞飲體的滲透性裂解(Moore等人，1988，Cell 54，777-785)、將抗原偶聯至強的佐 劑(Aichele 等人，1990，J. Exp. Med.，171，1815-1820 ；Gao 等人，1991，J. Immunol.，147， 3268-3273 ；Schulz 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，991-993 ；Kuzu 等 A, 1993, Euro. J. Immunol. 23，1397-1400 ；和 Jondal 等人，1996，Immunity 5，295-302)、外來體 (exosome) (Zitvogel 等人，1998Nat Med. 4,594-600 ；2002, Nat Rev Immunol. 2,569-79) 和抗原的細胞凋亡細胞遞送(Albert等人，1998，Nature 392,86-89 ；Albert等人，1998， Nature Med. 4，1321-1324 和國際公布 WO 99/42564 和 WO 01/85207)。可以將重組的細菌 (例如大腸桿菌)或轉染的宿主哺乳動物細胞脈沖到用于抗原遞送的樹突狀細胞(分別作 為顆粒抗原或凋亡小體)。在邏輯上，這樣的遞送系統可以與用于抑制NF-κ B的物質，如編 碼顯性負性I κ Ba的質粒(Pai等人，2002，J Virol 76，1914-1921)組合。還已經使用重 組嵌合病毒樣顆粒(VLP)作為載體，所述載體用于將外源性異種抗原遞送至樹突狀細胞系 的 MHC I 類處理途徑(Bachmann 等人，1996，Eur. J. Immunol.，26 (11)，2595-2600)。或者，或另外，可以將抗原連接至溶細胞素或與之結合，以增加抗原向本發明的抗
31原呈遞細胞的胞質溶膠的轉移，所述抗原呈遞細胞用于遞送至MHC I類途徑。示例的溶細 胞素包括皂素化合物，如含有皂素的免疫刺激復合物(ISCOM)(參見例如Cox和Coulter， 1997，Vaccine 15 (3)，248-256 和美國專利號 6，352，697)、磷脂酶(參見例如 Camilli 等 人，1991，J.Exp. Med. 173，751-754)、形成孔的毒素(例如α -毒素)、革蘭氏陽性細菌的天 然溶細胞素如李斯特菌素0(LL0，例如Mengaud等人，1988，Infect. Immun. 56，766-772和 Portnoy 等人，1992，Infect. Immun. 60，2710-2717)、鏈球菌溶血素 O (SL0，例如 Palmer 等 人，1998，Biochemistry 37 (8)，2378-2383)和產氣莢膜梭菌溶血素 O (perfringolysin 0， PF0,例如Rossjohn等人，Cell 89 (5)，685-692)。當抗原呈遞細胞是吞噬小體時，可以有利 地使用酸激活的溶細胞素。例如，在微酸性pH(吞噬小體中的pH條件)下李斯特菌素顯示 更大的形成孔的能力，從而促進液泡(包括吞噬小體和內含體)成分遞送至細胞質中(參 見例如 Portnoy 等人，1992，Infect. Immun. 60，2710-2717)。溶細胞素可以與Gag多肽或肽一起以單一組合物的形式提供或可以作為分開的 組合物提供，以用于接觸抗原呈遞細胞。在一個具體實施方式
中，將溶細胞素與Gag多肽 或肽融合或與其連接，其中融合或連接允許將Gag多肽或肽遞送至抗原呈遞細胞的胞質溶 膠中。在另一個具體實施方式
中，溶細胞素和Gag多肽或肽以遞送載體的形式提供，所述 載體例如但不限于脂質體或選自病毒、細菌或酵母的微生物遞送載體。合適地，當遞送載 體是微生物遞送載體時，遞送載體是無毒性的。在這類的優選具體實施方式
中，遞送載體 是無毒性的細菌，如例如Portnoy等人在美國專利號6，287，556中描述的，其包含編碼非 分泌的功能性溶細胞素的第一多核苷酸(其可操作地連接至表達細菌中的溶細胞素的調 控序列)，和編碼Gag多肽或肽的第二多核苷酸。可以通過各種機制提供非分泌的溶細胞 素，例如缺少功能性信號肽、分泌機能不全的微生物如具有遺傳損傷(例如功能性信號序 列突變)的微生物或中毒的微生物等。可以使用廣泛種類的非毒性、非致病性的細菌；優 選的微生物是被相對良好鑒定的株，特別是實驗室大腸桿菌株，如MC4100、MC1061、DH5 α 等。可以為本發明工程化的其它細菌包括良好鑒定的、非毒性的、非致病性的單核細胞增 多性李其j 特菌(Listeria monocytogenes)、弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、分支桿菌 (mycobacterium)、沙門氏菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。在特 定的具體實施方式
中，細菌被減毒為在宿主基因組中是非復制的、非整合的，和/或在細胞 間或細胞內是非運動的。上述遞送載體以及例如在3. 3部分中描述的顆粒載體實質上可以用于將一個或 多個Gag多肽和/或肽遞送至任何能夠內吞所述載體的抗原呈遞細胞，包括吞噬性和非吞 噬性抗原呈遞細胞。在具體實施方式
中，當遞送載體是微生物時，所述方法通常需要靶細胞 攝取微生物并隨后在抗原呈遞細胞液泡(包括吞噬小體和內含體)內將其裂解。4.淋巴細胞
具體實施例方式可以通過任何數目的方法獲得或制備本發明的抗原呈遞細胞，以使其含有和/或 表達Gag抗原，以便抗原或其經處理的形式被這些細胞呈遞，所述這些細胞用于潛在調節 其它免疫細胞，所述其他免疫細胞包括T淋巴細胞和B淋巴細胞，并特別用于產生經預處理 而對Gag抗原反應的T淋巴細胞和B淋巴細胞。經預處理而對Gag抗原反應的淋巴細胞在 本文也稱為Gag預處理的淋巴細胞。在一些具體實施方式
中，Gag特異性抗原呈遞細胞可以用于產生用Gag抗原預
32處理的T淋巴細胞。誘導淋巴細胞(特別是T淋巴細胞)顯示針對Gag抗原的免疫反應 的效率可以通過任何合適的方法確定，所述方法包括但不限于使用例如抗原特異性的抗 原呈遞細胞作為抗原特異性溶細胞T淋巴細胞(CTL)的靶標在體外分析T淋巴細胞的溶 細胞活性的方法；分析抗原特異性T淋巴細胞增殖的方法(參見例如Vollenweider和 Groseurth, 1992，J. Immunol. Meth. 149 :133_135)、使用例如 ELISPOT 分析和 ELISA 分析的 測定B細胞對抗原的反應的方法；探尋細胞因子特征的方法；或通過測試皮膚對特異性抗 原的反應測定遲發型超敏(DTH)反應的方法(參見例如Chang等人(1993，CanCer Res. 53 1043-1050)。本發明還考慮到可以檢測在暴露于Gag抗原后抗原呈遞細胞表面存在Gag肽 的本領域技術人員已知的其他方法。因此，本發明還提供了抗原特異性B或T淋巴細胞，特別是T淋巴細胞，其以抗原 特異性的方式對Gag抗原的呈遞有反應。在一些具體實施方式
中，通過將以上限定的Gag 特異性抗原呈遞細胞與T淋巴細胞群體接觸產生抗原特異性T淋巴細胞，T淋巴細胞可 以從任何合適的來源，如脾或扁桃體/淋巴結中獲得，但優選從外周血中獲得。T淋巴細 胞可以用作粗制備物或作為部分純化的或基本上純化的制備物，其使用標準技術，如例如 “Immunochemical Techniques, Part G :Separationand Characterization of Lymphoid Cells” (Meth. in Enzymo 1. 108，Edited by Di Sabato 等人，1984，Academic Press)中描 述的技術合適地獲得。這包括與羊紅血細胞形成花環、穿過尼龍羊毛柱傳代或塑料粘附以 去除粘附細胞、使用合適的單克隆抗體的免疫磁性或流式細胞儀選擇是本領域已知的。將T淋巴細胞的制備物與本發明的Gag特異性抗原呈遞細胞接觸足夠的時間，以 用Gag抗原或那些抗原呈遞細胞呈遞的抗原預處理T淋巴細胞。該過程將優選為至少約1 天，并多達約5天。在一些具體實施方式
中，在T淋巴細胞的異種群體存在下培養Gag特異性抗原呈 遞細胞的群體，所述淋巴細胞與本發明的多個Gag肽一起從外周血中適當地獲得。在足以 使抗原呈遞細胞呈遞肽或其經處理的形式的條件下，和足以使抗原呈遞細胞起始T淋巴細 胞的亞群對Gag抗原反應的條件下培養這些細胞一段時間。5.基于細胞的治療或預防在3. 4部分中描述的Gag特異性抗原呈遞細胞和在4部分中描述的Gag預處理的 淋巴細胞可以單獨或組合施與患者，以調節免疫反應，特別是調節對Gag多肽的免疫反應。 因此，這些基于細胞的組合物可以用于治療或預防慢病毒感染或相關的狀況。可以通過任 意方法(例如注射)將本發明的細胞引入患者，其產生對抗原或抗原組的所需免疫反應。 細胞可以源自患者(即自體細胞)或源自與患者的MHC匹配的或不匹配的(即異體的)個 體。通常，將自體細胞注射回獲得細胞的患者中。注射位點可以是皮下、腹膜內、肌肉內、 真皮內、靜脈內或淋巴內。可以將細胞以治療或預防或減輕疾病或狀況的癥狀的足夠量施 與已經患有疾病或狀況的患者，或易得疾病或狀況的人。注射入需要該治療或預防的患者 中的細胞數目可以根據(尤其)抗原或個體的大小而變化。這一數目可以在例如約IO3至 IO11之間的范圍，通常在約IO5至IO7細胞之間(例如以血、PMBC或純化的樹突狀細胞或T 淋巴細胞的形式)。可以進行單次或多次(2、3、4或5)施與細胞，細胞的數目和方式由治療 醫師選擇。應該在藥學上可接受載體中施與細胞，其對于細胞和個體是非毒性的。這樣的 載體可以是細胞生長的生長培養基，或任何合適的緩沖的介質，如磷酸鹽緩沖鹽水。細胞可以單獨施與或作為輔助治療與本領域已知的其它治療劑結合施與，以治療或預防不良的免 疫反應，所述其他治療劑例如但不限于糖皮質激素、氨甲喋呤、D-青霉胺、羥氯喹、金鹽、柳 氮磺吡啶、TNF-α或白介素-1抑制因子和/或其它形式的特異性免疫治療。6.治療和預防在3. 1部分中描述的Gag多肽和肽，和在3. 2部分中描述的表達Gag的核酸構建 體，以及在3. 3部分中描述的Gag顆粒，和在3. 4部分中描述的Gag特異性抗原呈遞細胞和 在4部分中描述的Gag預處理的淋巴細胞(“免疫刺激劑”或“Gag免疫刺激劑”)可以單 獨使用或一起使用作為活性成分，以治療或預防慢病毒感染，包括治療慢病毒相關的疾病 或狀況，如但不限于獲得性免疫缺陷疾病。這些免疫刺激劑可以單獨或以組合物形式(其 中它們與合適的藥學上可接受的載體和/或稀釋劑或佐劑混合)施與患者。因此，本發明包括治療或預防慢病毒感染的方法，其基本上由向需要這樣的治療 的患者施與有效量的上面廣泛描述的至少一個Gag免疫刺激劑組成。在一些具體實施方式
中，方法基本上由下列步驟組成以有效增加Gag特異性抗體呈遞細胞或其前體數目的量 向具有慢病毒感染的個體或具有慢病毒感染風險的個體施與Gag免疫刺激劑，從而治療或 預防慢病毒感染。因此，本發明的方法適于治療具有慢病毒感染的個體；具有患上慢病毒感染風險 的個體；和曾經治療慢病毒感染但復發的個體。這樣的個體包括但不限于具有健康的完整 免疫系統但有變為HIV感染風險的個體(“危險”個體)。危險個體包括但不限于與變為 HIV感染的一般群體相比有更大可能性的個體。具有變為HIV感染風險的個體包括但不限 于由于與HIV感染個體有性活動而具有HIV感染風險的個體；靜脈內藥物使用者；可能已 經暴露于HIV感染的血、血制品或其他HIV污染的體液的個體；和由HIV感染母親照顧的嬰 兒。適于治療的個體包括被HIV-I和/或HIV-2和/或HIV-3或任何其變體感染或有變為 被HIV-I和/或HIV-2和/或HIV-3或任何其變體感染風險的個體。適于用本發明的方法 治療的個體還包括具有難以用其他抗病毒治療劑治療的慢病毒感染的個體。在特別的具體實施方式
中，該方法用于治療或預防慢病毒相關疾病(例如獲得性 免疫缺陷疾病，如AIDS)，因此本發明還延伸至在受試者中治療或預防慢病毒相關疾病的方 法，其中所述方法通常包括以有效治療或預防疾病的量向受試者施與如上廣泛描述的Gag 免疫刺激劑。使用任何可獲得的方法和適于藥物遞送的途徑，包括體內和離體方法以及全身的 和局部的給藥途徑，向個體施與Gag免疫刺激劑。制劑和給藥的技術可以在“Remington’ s Pharmaceutical Sciences, "Mack Publishing Co. ,Eaton,Pa.的最近版本中找至lj。合適的 途徑可以包括例如腸內(例如口腔或直腸)、跨粘膜或腸內給藥；胃腸外遞送，包括肌肉內、 皮下、髓內注射以及鞘膜內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。為了注射，其組 成本發明的一個希望的具體實施方式
，本發明的免疫刺激劑可以以水溶液的形式配制，通 常以生理上相容的緩沖液，如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或生理鹽水緩沖液的形式。為了 跨粘膜給藥，在制劑中使用適于透過屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在本領域中通常是已知 的。例如，為了施與免疫原組合物、疫苗和DNA疫苗，肌肉內和皮下注射是適當的。在本發 明的某些具體實施方式
中，靜脈內施與免疫刺激劑。可以使用本領域中熟知的藥學上可接受的載體容易地將Gag免疫刺激劑配制成
34適于口服給藥的劑量。這樣的載體使本發明的化合物能配制成劑量形式，如片劑、藥丸、膠 囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等，以用于需要治療的患者的口腔吞咽。這些載體可以選 自糖、淀粉、纖維素和其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、藻朊酸、 磷酸鹽緩沖的溶液、乳化劑、等滲鹽水或無致熱原的水。用于胃腸外給藥的藥物制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化 合物的懸浮液可以制備為適當的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油， 如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質體。水質注射懸浮液可以含 有增加懸浮液粘性的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。可選地，懸浮液還可以含 有適當的穩定劑或增加化合物可溶性的試劑，以允許制備高濃度的溶液。用于口腔使用的藥物制備物可以通過將活性化合物與固體賦形劑組合，可選地在 加入合適的輔助劑(如果需要)后研磨所得混合物并處理顆粒的混合物而獲得片劑或糖 衣片的核心。合適的賦形劑是(特別地)填充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇； 纖維素制備物，如例如玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維 素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如果需要，可以加入 崩解劑，如交聯的聚乙烯吡咯酮、瓊脂或藻朊酸或其鹽，如藻朊酸鈉。可以通過任何藥學方 法制備這樣的組合物，但是所有的方法包括以下的步驟用構成一個或多個必需成分的載 體與上述的一個或多個治療試劑結合。通常，可以以自知的方式制造本發明的藥物組合物， 例如通過常規的混合、溶解、粒化、制作糖衣片、磨細、乳化、裝入膠囊、包入或凍干過程的方 法。糖衣片的核心具有適當的涂層。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，其可選地可以 含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯酮、聚羧乙烯凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和適 當的有機溶劑或溶劑混合物。可以向片劑或糖衣片涂層中加入染料或色素以便識別或鑒別 活性化合物劑量的不同組合。可以口服使用的藥物包括由明膠制成的推入配合的膠囊以及由明膠和增塑劑 (如甘油或山梨醇)制成的軟的密閉的膠囊。推入配合的膠囊可以含有與填充劑如乳糖、 粘合劑如淀粉和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂和可選的穩定劑混合的活性成分。在軟膠囊 中，活性化合物可以溶解或懸浮于合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另 外，可以加入穩定劑。本發明的Gag免疫刺激劑的劑型還可以包括特別為此目的設計的注射或植入控 釋設備，或被修飾而以這一方式另外起作用的其它形式的植入物。本發明的試劑的控釋可 以受下列因素影響例如以疏水性聚合物，包括丙烯酸樹脂、蠟、高級脂肪族醇、聚乳酸和聚 乙醇酸，和某些纖維素衍生物，如羧丙基甲基纖維素包被同一試劑。另外，控釋可以受使用 其它的聚合物基質、脂質體和/或微球影響。本發明的Gag免疫刺激劑(例如Gag多肽和肽)可以與藥學上相容的抗衡離子一 起作為鹽提供。藥學上相容的鹽可以用許多酸形成，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、 酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽傾向于在水質或其它質子溶劑(為相應的游離堿形式)中更 可溶。或者，可以以局部而不是全身的方式施與Gag免疫刺激劑，例如通過將化合物直 接注射至組織中，通常用儲存的或持續釋放的制劑。另外，可以施與定向藥物遞送系統中的如，在用組織特異性抗體包被的脂質體中，如例如3. 3部分中所述的。脂質 體可以靶向組織和有選擇地被組織攝取。適于本發明使用的藥物組合物包括這樣的組合物其中以獲得其預期目的的有效 量含有活性成分。施與患者的試劑的劑量應該足以隨時間影響患者的有益反應，如減少于 狀況相關的癥狀。需要施與的免疫刺激劑的量可以取決于需要治療的受試者，包括其年齡、 性別、體重和一般健康狀況。在這一點上，用于給藥的免疫刺激劑的精確量將取決于執業醫 師的判斷。為了確定在治療或預防所述狀況中施與的免疫刺激劑的有效量，醫生可以評估 靶抗原的組織水平和疾病或狀況的進展。在任何情況下，本領域技術人員可以容易的確定 本發明的免疫刺激劑的合適劑量。對于本發明的方法中使用的任何化合物，有效劑量可以最初從細胞培養分析或動 物模型中估計。本發明的免疫刺激劑的毒性或治療效率可以通過細胞培養或動物實驗中的 標準藥學過程確定，例如用于測定LD50(50%群體致死的劑量)和ED50(50%群體治療有 效的劑量)的藥學過程。在毒性和治療效果之間的劑量比例是治療的指數，其可以表達為 LD50/ED50的比例。優選顯示大的治療指數的化合物。從這些細胞培養分析和動物研究中 獲得的數據可以用于配置一系列用于人的劑量。這樣的化合物的劑量優選處于包括有很少 或沒有毒性的ED50的循環濃度范圍內。所述劑量可以在這一范圍內根據使用的劑量形式 和使用的給藥途徑而變化。準確的制劑、給藥途徑和劑量可以由各個醫生考慮患者的狀況 而選擇(參見例如 Fingl 等人，1975，in“The Pharmacological Basisof Therapeutics，，， Ch. Ip 1)。可以個別地調整劑量量和間隔以提供活性化合物的血漿水平，所述水平足以維持 Gag減少的效應或減輕慢病毒感染或相關疾病或狀況的影響。用于全身給藥的通常患者劑 量的范圍為l_2000mg/天，常見地為l_250mg/天和通常10_150mg/天。根據患者的體重 而定，通常的劑量為0. 02-25mg/kg/天，常見地為0. 02_3mg/kg/天，通常為0. 2-1. 5mg/kg/ 天。根據患者體表面積而定，通常劑量為0. 5-1200mg/m2/天，常見地為0. 5-150mg/m2/天， 通常為5-100mg/m2/天。在一些具體實施方式
中，施與Gag免疫刺激劑的單一劑量。在其它的具體實施方 式中，施與免疫刺激劑的多劑量。當在一段時間內施與多劑量時，在一段時間內每日施與免 疫刺激劑兩次(qid)、每日一次(qd)、每兩天一次(qod)、每三天一次、每周三次(tiw)或每 周兩次(biw)。在說明性例子中，在從一天至約2年或更長的時間內以qid、qd、qod、tiW或 biw施與免疫刺激劑。合適地，以任何上述的頻率施與免疫刺激劑一周、兩周、一個月、兩個 月、六個月、一年或兩年或更長，這取決于各種因素。在一些具體實施方式
中，免疫刺激劑的有效量是這樣的量相對于沒有用免疫刺 激劑治療的個體的慢病毒載量，在經治療的個體中減少慢病毒載量至少約10%、至少約 20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少 約90%、至少約95%或更多。在一些具體實施方式
中，Gag免疫刺激劑的有效量是這樣的量相對于沒有用免 疫刺激劑治療的個體的CD4+T細胞計數，增加個體中的CD4+T細胞計數至少約10%、至少約 20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少 約90%、至少約100%、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約3. 5倍，至少約4倍，至少約5倍
36或至少約10倍或更多。在一些具體實施方式
中，Gag免疫刺激劑的有效量是恢復CD4+T細胞計數至正常范 圍內的量。在人血中，被認為是在正常范圍的⑶4+T細胞數目是從約600至約1500個⑶4+-T 細胞/mm3血。治療或預防慢病毒感染包括但不限于降低慢病毒感染的可能性、減少來自受感染 的細胞的慢病毒向易感染細胞的擴散、減少慢病毒感染個體中的病毒載量、減少慢病毒感 染個體中病毒編碼的多肽量和增加慢病毒感染個體中CD4+T細胞計數。各種方法中的任一個可以用于確定治療/預防方法是否有效。例如，確定本發明 的方法是否可以有效減少慢病毒載量和/或治療慢病毒感染的方法是任意已知的用于慢 病毒感染指征的測試，包括但不限于通過下列方式測定病毒載量例如通過測量生物樣品 中慢病毒的量(例如使用對慢病毒多核苷酸序列特異性的引物進行聚合酶鏈反應(PCR))； 檢測和/或測定慢病毒編碼的多肽，例如p24、gpl20、逆轉錄酶(使用例如對多肽特異的抗 體進行酶聯免疫吸附法(ELISA)的免疫測定方法)；和測定個體中的CD4. sup.+T細胞計 數。分析慢病毒感染(或任何與慢病毒感染相關的指征)的方法是本領域中已知的，并在 許多出版物，如 HIV 規程(Methods in Molecular Medicine，17)N. L. Michael 和 J. H. Kim， eds. (1999)HumanaPress 中有描述。根據上文，應該理解的是，本發明的試劑可以用作治療的或預防的免疫調節組合 物或疫苗。因此，本發明延伸至含有一個或多個本發明的Gag免疫刺激劑作為活性化合物 的免疫調節組合物的制備。考慮到任何合適的用于制備這樣的疫苗的過程。示例的過程包 括例如那些New Generation Vaccines (1997，Levine 等人，Marcel Dekker, Inc. New York, Basel Hong Kong)中描述的過程。根據本發明的免疫調節組合物可以含有生理上可接受的稀釋劑或賦形劑，如水、 磷酸鹽緩沖的鹽水和鹽水。它們還可以包括本領域中熟知的佐劑。合適的佐劑包括但不限 于表面活性物質，如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、雙十八烷 基二甲基溴化銨、N，N-雙十八烷基-N’，N’雙(2-羥乙基丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和 復合多元醇；聚胺，如吡喃、右旋糖酐硫酸酯、poly IC卡波姆(carbopol)；肽，如胞壁酰二 肽和衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬肽(tuftsin)；油乳劑；和礦物膠，如磷酸鋁、氫氧化鋁 或明礬；淋巴因子、QuilA和免疫刺激復合物(ISCOMS)。本發明的Gag特異性抗原呈遞細胞或前體和用Gag特異性抗原呈遞細胞產生 的Gag處理的T淋巴細胞(如上述)可以用作用于預防或治療應用的免疫調節組合物中 的免疫刺激劑。在一些具體實施方式
中，本發明的抗原特異性抗原呈遞細胞用于產生大 量的CD8+或CD4+CTL，用于過繼轉移至不能進行正常免疫反應的免疫抑制的個體。例如， 可以過繼轉移Gag處理的CD8+CTL，用于受到慢病毒感染個體中的治療目的(Koup等人， 1991，J. Exp. Med.，174 1593-1600 ；Carmichael 等人，1993，J. Exp. Med.，177 :249_256 ；和 Johnson 等人，1992，J. Exp. Med.，175 :961_971)。7.組合治療Gag免疫刺激劑可以與至少一個第二治療試劑組合(例如在同一個制劑中或在分 開的制劑中)施與個體(“組合治療”)。可以將免疫刺激劑與第二治療試劑混合施與或可 以在分開的制劑中施與。當在分開的制劑中施與時，可以基本上同時施與Gag免疫刺激劑和第二治療試劑(例如相互在約60分鐘、約50分鐘、約40分鐘、約30分鐘、約20分鐘、約 10分鐘、約5分鐘或約1分鐘內)或時間間隔約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約 10小時、約12小時、約24小時、約36小時、約72小時或更長。治療試劑的有效量如上所述。治療試劑可以與例如抗炎癥性、抗病毒、抗真菌、抗分枝桿菌、抗生素、殺阿米巴 (amoebicidal)、殺毛滴蟲(trichomonacidal)、止痛劑、抗腫瘤、抗高血壓、抗微生物和/ 或類固醇藥物在組合治療中施與，以治療抗病毒感染。在一些具體實施方式
中，用一個或 多個Gag免疫刺激劑與一個或多個下列物質組合治療具有病毒或細菌感染的患者β _內 酰胺抗生素、四環素、氯霉素、新霉素、短桿菌肽、桿菌肽、磺胺類、呋喃西林、萘啶酸、可的 松、氫化可的松、倍他米松、地塞米松、氟可龍、強的松龍、曲安奈德、吲哚美辛、舒林酸、阿 昔洛韋、金剛烷胺、金剛乙胺、重組可溶⑶4 (rs⑶4)、抗受體抗體(例如對抗鼻病毒)、奈 韋拉平、西多福韋(Vistide )、膦甲酸鈉(Foscarnet )、泛昔洛韋(famcyclovir)，更昔 洛韋(pencyclovir)、萬乃洛韋(valacyclovir)、核酸/復制抑制劑、干擾素、齊多夫定 (zidovudine) (AZT，Retrovir )、齊多夫定 / 拉米夫定(Iamivudine) (Combivir)、去羥肌苷 (didanosine(雙脫氧肌苷，ddl，Videx ))、司他夫定(stavudine (d4T, Zerit ))、扎西他 濱(zalcitabine (雙脫氧胞嘧啶，ddC，Hivid ))、奈韋拉平(nevirapine (Viramune ))、拉 米夫定(lamivudine (Epivir , 3TC))、蛋白酶抑制劑、沙奎那韋(saquinavir (Invirase , Fortovase ))、利托那韋(ritonavir (Norvir ))、奈非那韋(nelf inavir (Viracept ))、 依非韋倫(efavirenz (Sustiva )),阿巴卡韋(abacavir (Ziagen ))、氨普那 韋(amprenavir(Agenerase ))茚地那韋(indinavir(Crixivan )),更昔洛韋 (ganciclovir)、AzDU、地拉韋啶(delavirdine (Rescriptor ))、洛匹那韋 / 利托那韋 (lopinavir/ritonavir (Kaletra))、三協韋(trizivir)、利福平(rifampin)、克拉霉素、促 紅細胞生成素、集落刺激因子(G-CSF和GM-CSF)、非核苷逆轉錄酶抑制劑、核苷抑制劑、阿 霉素、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、天冬酰胺酶和其組合。抗HIV試劑是那些在前述名單中特異性 靶向一個或多個HIV蛋白功能的試劑。在一些具體實施方式
中，Gag免疫刺激劑與二個或多個抗HIV試劑一起在組合 治療中施與。例如，所述試劑可以與一個、兩個或三個核苷逆轉錄酶抑制劑一起在組合 治療中施與(例如可比韋(Combivir)、益平維(Epivir)、扎西他濱(Hivid)、疊氮胸苷 (Retrovir)、去羥肌苷(Videx)、賽瑞特(Zefit)、阿波卡偉(Ziagen)等)。本發明的免疫 刺激劑可以與一個或兩個非核苷逆轉錄酶抑制劑(例如地拉韋定(Rescriptor)、依法韋侖 (Sustiva)、奈韋拉平(Viramune)等)一起在組合治療中施與。Gag免疫刺激劑可以與一個 或兩個蛋白酶抑制劑(例如安普那韋(Agenerase)、硫酸茚地那韋膠囊(Crixivan)、沙奎那 韋軟凝膠劑(Fortovase)、沙奎那韋(Invirase)、快利佳(Kaletra)、利托那韋(Norvir)、奈 非那韋(Viracept)等)一起在組合治療中施與。Gag免疫刺激劑可以與蛋白酶抑制劑和核 苷逆轉錄酶抑制劑一起在組合治療中使用。Gag免疫刺激劑可以與蛋白酶抑制劑、核苷逆轉 錄酶抑制劑和非核苷逆轉錄酶抑制劑一起在組合治療中使用。Gag免疫刺激劑可以與蛋白 酶抑制劑和非核苷逆轉錄酶抑制劑一起在組合治療中使用。考慮到所述抑制劑與一個或多 個蛋白酶抑制劑、核苷逆轉錄酶抑制劑和非核苷逆轉錄酶抑制劑的其他組合。8.用于評估免疫調節的方法
可以使用任何合適的技術評估免疫的有效性。可以通過評估經預處理而對Gag 反應的那些細胞是否增加數目、活性和檢測和破壞該抗原或呈遞該抗原的細胞的能力而 確定個體對Gag反應的能力。通過標準的測試測量免疫反應的強度，所述測試包括通過 本領域中的已知方法直接測量外周血淋巴細胞(參見例如Provinciali M.等人(1992， J. Immunol. Meth. 155 19-24)、細胞增殖分析(參見例如 VolIenweider，I.和 Groseurth， P.J. (1992，J. Immunol. Meth. 149 133-135)、免疫細胞和亞型的免疫分析(參見例如 Loeffler,D. A.等人(1992,Cytom. 13 169-174) ；Rivoltini,L.，等人(1992,Can. Immunol. Immunother. 34 241-251)；或用于細胞介導的免疫性的皮膚測試(參見例如Chang， Α. Ε.等人(1993，CancerRes. 53 1043-1050)。或者，可以使用一個或多個技術監測免疫 的效率，所述技術包括但不限于新鮮的和經刺激的PBMC的HLA I類四聚體染色(參見例 如 Alien 等人，2000，J. Immunol. 164(9) :4968_4978)、增殖分析(Allen 等人，見上文)、 ELISP0T分析和細胞內細胞因子染色(Allen等人，見上文)、線性B細胞反應的ELISA分析 和表達合成多核苷酸的細胞樣品的Western印跡。特別相關的是被抗原激活的T細胞的細 胞因子特征，更特別地是正^^、11^-2、11^-4、11^-5、11^-1036卩3和TNF α的產生和分泌。可以通過本領域技術人員已知的任何合適技術評估T淋巴細胞的細胞毒活性，特 別是需要通過抗原呈遞細胞誘導的細胞毒T淋巴細胞的能力。例如，獲得含有需要被分析 細胞毒活性的T淋巴細胞的樣品，然后將T淋巴細胞暴露于抗原預處理的抗原呈遞細胞 (已經使其呈遞抗原)。在適當的時間后(其可以通過評估已知能夠被誘導為細胞毒細胞 的T淋巴細胞的對照群體的細胞毒活性而確定)，在標準的細胞毒分析中測試需要評估的T 淋巴細胞的細胞毒活性。評估CTL活性的方法特別用于評估個體對表達腫瘤或病毒抗原的細胞產生細胞 毒反應的能力。因此，該方法用于評估個體對癌癥或病毒產生免疫反應的能力。例如，通過 使用51Cr標記的靶細胞并通過使用在肽包被的或重組病毒感染的細胞上的經刺激的脾細 胞或外周血單核細胞(PBMC)而使用CTL裂解分析。可以使用例如靈長類、小鼠或人類細胞 進行這樣的分析(Allen等人見上文)。另外，可以使用體內檢測方法測定遠親繁殖的靈長 類中的CTL活性，上述方法包括用可視檢測的標記(例如熒光、化學發光或磷光或可視標記 或染料)標記自體細胞(例如PMBC)并使其接觸本文公開的一個或多個Gag肽。選擇它們 以便它們對應于在受試者的測試下是CTL反應目標的抗原。將自體細胞注入受試者，在適 當的時間后收集來自受試者的淋巴細胞，以允許受試者的免疫系統有足夠的時間對自體細 胞反應(例如注入后10分鐘至24小時)。然后分析收集的淋巴細胞以鑒定含有或載有可 視檢測標記的淋巴細胞的數目或比例，其代表對受試者中抗原的體內CTL反應的測量。為了容易地理解本發明并付諸實施，現在利用下列非限制性實施例描述特別優選 的具體實施方式
。實施例在用肽脈沖的血免疫治療SIV感染的獼猴后病毒血癥的控制在接受了 ART的STV感染的短尾獼猴中研究了 OPAL免疫治療。與可選的恒 河猴(rhesus macaque)模型相比，短尾獼猴具有至少相等的SIV感染致病過程9a°。用 SIVfflac251感染36只獼猴，3周后開始用抗逆轉錄病毒藥物替諾福韋(tenofovir)和恩曲他 濱(emtricitabine)治療數周。動物被隨機地分配至通過血漿SIV病毒載量峰值(VL)、
39Mane-A^lO狀態(在SIV感染的短尾獼猴中增加VL的MHC I類基因“)、重量和性別分成的 3組。用單獨10 μ g/mL/肽的125重疊的SIV Gag 15mer肽(OPAL-Gag)或跨越所有9個 SIV蛋白的823SIV 15mer肽(OPAL-All)離體混合1小時的自體新鮮PBMC，在抗逆轉錄病 毒治療的覆蓋下(第4、6、8、10周)免疫4次獼猴，或不免疫。在第10周停止ART后跟蹤 獼猴26周。所有36只獼猴都在暴露于SIVmae251后被感染并具有7. Ilog10拷貝/mL的VL平均 峰值。在接種前，4只動物在急性SIV感染過程中死亡，具有腹瀉、脫水、嗜睡、厭食和體重減 輕的癥狀。可以很好地耐受接種，相對于對照，OPAL免疫的動物的平均體重、血液學參數或 臨床觀察無差別。在接種的過程后，OPAL免疫的動物中具有顯著的SIV特異性⑶4+和⑶8+T細胞免 疫原性。在OPAL-Gag組中最后免疫后2周的平均Gag特異性⑶4和⑶8T細胞反應分別是 所有⑶4和⑶8T細胞的3. 0%和1. 9%。在OPAL-All組中最后免疫后2周的平均Gag特 異性CD4和CD8T細胞反應是0. 84%和0. 37%，在對照中是0. 15%和0.29% (圖la、b)。 OPAL-All免疫動物中的Gag特異性T細胞，而不是對照或單獨OPAL-Gag免疫的動物，還具 有升高的對所有其它SIV蛋白的T細胞反應。相對于在對照和OPAL-Gag組中對非Gag抗 原的所有⑶4/8反應的彡0. 4%，在OPAL-All組中的平均Εην、Ρο1和組合的調控蛋白特異 性的 CD4/CD8 反應分別是 2. 5% /11. 8%,0. 8% /0. 3%和 1. 5% /2. 4% (圖 lc、d 和圖 3)。 較強的對非Gag蛋白的CD8+T細胞反應與對Gag的CD8+T細胞反應的減小相關(圖Ie)。因 此，雖然大量的SIV蛋白在OPAL-ALL免疫動物中被識別，與只用Gag肽免疫相比，Gag反應 減少。雖然在SIV感染后所有的動物都血清轉化，用OPAL接種未發生抗體反應的顯著增強。截止到第10周，在剩余的32只動物中的26只中，7周時間的ART控制的VL在 3. IloglO拷貝/mL以下。在ART上未能控制病毒血癥的6只動物在第2周有較高的VL峰 值(相對于在ART上控制了病毒血癥的動物的6. 94士0.52，平均值士SD為7. 74士0. 33，ρ < 0. 001)，在撤除 ART 后有較高的 VL (5. 98士0. 53 對 4. 28士0. 90, ρ < 0. 001)。對 VL 的控 制似乎對于被感染的獼猴7、12的免疫治療中獲得最佳結果是重要的。在ART上控制了病毒 血癥的動物上(26只動物)進行了預定義的(每個規程)靈長類VL的端點分析(endpoint analyses)，雖然本發明人還通過調整在ART上的VL控制分析了所有的32只剩余的動物。在撤除ART后的10周中，在組合的0PAL-A11與OPAL-Gag治療組之間的VL初級 端點比較比對照低0. 51og10拷貝/mL(p = 0. 084，圖2，表7)。每個接種的組(0PAL-A11和 OPAL-Gag)有非常相似的VL降低。與對照相比，對調整了 ART上控制VL和Mane-A*10狀態 的控制的所有動物的分析證明了 OPAL免疫的動物中VL的顯著降低(表7)。截至撤除ART 后的6個月，對照和OPAL免疫組之間的平均差異是0. 931og10拷貝/mL 6個月(ρ = 0. 02， 表7)。為了使用靈敏的獨立VL分析確認病毒學發現，將第32周研究中的冷凍血漿(ImL) 運至美國馬里蘭的國家癌癥研究所(NCI)。M Piatak和J Lifson博士使用具有1. 51og1(1 拷貝/mL定量限的分析方法友善地盲(blindly)分析了樣品的SIVRNA。Melbourne大學和 NCI的分析緊密相關(r = 0. 97,ρ < 0. 001)，并且在這一時間相對于對照，在已接種疫苗者 中顯示幾乎相同的平均病毒血癥減少(分別為0. 82對0. 881ogl0拷貝/mL)。為了進一步評估SIV控制的持久性并用OPAL免疫治療預防疾病，我們在沒有ART的覆蓋下用相同的過程(在第36、39、42周)再次激發相同隨機組中的所有32只動物3次， 并追蹤動物另外6個月。在免疫的動物中增強了 SIV特異性的T細胞免疫，與最初接種相 似(圖1)。在撤除ART的正好1年的追蹤時間內病毒控制得到維持(圖2，表7)。剩余32只動物中的12只發生了早期AIDS，在延長的追蹤過程中被安樂死，包括所 有未在ART上控制病毒血癥的6個動物。在ART上控制了病毒血癥的6只被安樂死的動物 中，5只在對照組中，1只在OPAL-Gag組中(圖2)。通過分析在ART上控制了病毒血癥的 26只動物(p = 0. 053)或所有32只動物(調整Mane-A*10狀態和在ART上病毒血癥的控 制(p = 0. 02，Table 7))，OPAL免疫治療產生存活益處。本發明人還比較了 Env和Gag CTL反應者中的VL和外周⑶40水平。在疫苗組 的動物上進行最初的分析，從而評估治療性免疫增強Env或Gag特異性T細胞的效果。鑒 于Mane-A*10陽性的動物都具有有益的對KP9抗原決定部位的Gag特異性CTL反應，排除 這些動物。事實上，相對于Mane-A*10陰性對照的5. 49士0. 351og10拷貝/mL，在該試驗中 的Mane-A*10陽性對照在感染后的12-64周內有4. 06士0. 421og1(1拷貝/mL的平均VL(P = 0. 024，時間權重的曲線下面積分析)。與排除了Mane_A*10+動物的只具有Gag CD8+T細胞反應的動物相比，只有Env CTL 反應者在感染后的12-64周之間維持了顯著高的平均VL(分別為5. 05士0. 381og10拷貝/ mL對3. 65士0. 241og1(1拷貝/mL。P = 0. 039，圖4)。在感染后12-64周之間的6個只是 Env的反應者與7個Mane-A*10陰性的未接種的對照動物之間的平均VL有差異(分別為 5. 05士0. 381ogl。拷貝 /mL 和 5. 49士0. 351og1(l 拷貝 /mL,；圖 4)。為了論述廣泛的多蛋白的反應將是有益的推測，然后在這一分析中包括了那些對 Env和Gag都有反應的⑶8+T細胞的動物。具有Env和Gag特異性反應二者的3只動物的 平均VL在感染后12-64周之間為5. 01 士0. 561og10拷貝/mL。這比只有Gag的反應者顯著 高(P = 0. 049)，但不比只有Env的反應者好。在最后接種和撤除ART后的正好1年中追蹤在這一試驗中的動物。這使得能夠 分析外周⑶4+T細胞的去除和只對Env或Gag反應的動物的存活，那些對Env和Gag都反 應的動物的存活和未接種的對照的存活。在感染后12-64周之間，相對于6只只有Env的 反應者，只有Gag的3只反應者沒有顯著高的平均外周CD4水平(分別為23. 42% 士4. 22 和27. 44% 士3. 92，P = 0. 547圖4)。與未接種的對照相比，具有Env和Gag特異性二者的 CD8+T細胞反應的3只動物在相同的時間內有不顯著的但較低的平均外周CD4水平(分別 為 18. 59% 士3. 23 和 21. 19% 士3. 01 ；圖 4)。在追蹤過程中，32只動物中具有早期AIDS，包括體重減輕、⑶4+T細胞耗竭和血小 板減少癥的總共6只接種的動物和6只對照被安樂死。相對于具有只對Gag反應的CTL的 動物，只對Env CD8+T細胞抗原決定部位反應的動物發展為AIDS的頻率更高(圖4)。總之，相對于未接種的對照，使用重疊的Gag SIV肽或跨越整個SIV基因組的肽的 OPAL免疫治療是高度免疫原性的并產生顯著低的病毒載量和存活益處。OPAL免疫的獼猴 中的病毒學效應在ART停止后持續12個月。不考慮研究的毒性SIVma。251-短尾獼猴模型9， 觀察到OPAL免疫治療上的本發現，并提供這一免疫治療技術前景的有力原理驗證。0PAL免疫治療方法比許多其它細胞免疫治療，特別是使用樹突狀細胞更簡單。使 用DNA、CTLA-4封閉和基于病毒載體的方法現在還顯示出在獼猴研究中的某些前景14,15，雖
41然這樣的方法還未進入人類研究。這一研究向PBMC中加入肽，但是本發明人顯示了甚至更 簡單的技術將肽加入全血也是高度免疫原性的，這個技術將有更廣的應用7。病毒特異性的CD4+T細胞通常在HIV感染的人類或SIV感染的獼猴中是非常弱的； 這些細胞的明顯增加是通過OPAL免疫治療誘導的，這可以成為其效率的基礎16。雖然本發 明人最初在本研究中測量了產生IFN- γ的T細胞，近期的多功能ICS分析揭示OPAL免疫 治療還可誘導還能夠表達細胞因子TNF-α和11^-2、趨化因子肌？10和脫粒標記⑶107a的 T細胞。早期(感染后3周)用ART治療對照和接種的獼猴，單獨ART治療與人類中短暫改 善的結果相關。盡管如此，在感染2周內的腸道中有大量的CD4+T細胞丟失17，并且，雖然在 感染后這樣早的時間鑒定人類可能是挑戰性的，這是HIV-I受試者出現急性感染的大約時 間。如果這些發現在人類試驗中被確認，VL的 LOlogltl的降低將引起人類進行性HIV疾 病的重大延遲并允許合理的無需再引入ART的時間18。接種動物顯示的對病毒血癥的持續 控制是有趣的，并與其它近期的獼猴研究一致14，這揭示再免疫的需要可能是不重要的。OPAL-Gag和0PAL-A11組的對病毒血癥的控制是相似的。雖然Gag重疊肽的劑量 相同，OPAL-Gag動物中的Gag特異性⑶4和CD8+T細胞反應比0PAL-A11動物中的高5. 1和 3.5倍。這揭示來自Gag和其它SIV蛋白的肽之間的抗原競爭。鑒定的Env特異性⑶8T細 胞反應不能顯著影響病毒復制或疾病的進展。Env (或其它非Gag的蛋白)反應可能潛在地 抑制更有效的CD8+T細胞反應。與控制病毒血癥相關的Gag特異性CTL反應的觀察突出顯 示了這一現象，然而具有Env和Gag特異性CD8+T細胞反應二者的動物在控制病毒血癥和預 防疾病中不比只有Env的反應者或未接種的對照進行得更好。通過多蛋白HIV疫苗誘導免 疫顯性非Gag T細胞反應可以限制Gag特異性T細胞反應的發展19。大量的人類研究證明 Gag特異性T細胞反在控制HIV病毒血癥中是最有效的2°。總之，這些研究揭示治療性HIV 疫苗可以不需要以最寬的多蛋白HIV特異性免疫為目的。用Gag肽的OPAL免疫治療正在 進入被HIV感染的人類的初期試驗中。材料和方法在動物倫理委員會批準的規程中研究沒有猴逆轉錄病毒D型的年輕短尾獼猴 (Macaca nemestrina)，并根據澳大利亞國家健康和醫學研究理事會的指導方針照顧它們。 通過參考鏈介導的構象分析和通過如所述的序列特異性引物PCR證實的Mane-A*10的存 在21’22 36用MHC I類等位基因對所有的短尾獼猴進行分類，用40個組織培養感染劑量的 SIVmac251 (由 R. Pal ,Advanced Biosciences，Kensington，MD 惠贈)靜脈內注射獼猴，方法如 前面所述9’11，并在3周后隨機分成12只動物的3組(0PAL-Gag、0PAL-All、對照)。對第2 周的SIV病毒載量峰值、體重、性別和MHC I基因Mane-A*10(已知其可以增強對SIV的免 疫控制)進行隨機分類“。從第3周起的7周內動物接受用替諾福韋(tenofovir)和恩曲 他濱(emtricitibine)(由 Gilead，Foster City, CA 惠贈；兩者都為 30mg/kg/ 動物)進行 的雙抗逆轉錄病毒治療的皮下注射從感染后的3-5周每日注射，從6-10周每周注射三次。 這一雙ART控制了大多數被SIV感染的獼猴中的病毒血癥12’15’23_25。 使用如前所述的PBMC用OPAL免疫治療免疫兩組動物(OPAL-Gag和0PAL-A11)7。 簡單地說，從18mL血利用淋巴細胞分類液(FicolΙ-paque)分離外周血單核細胞(PBMC)
42(用肝素鈉抗凝)。將所有分離的PBMC(平均2400萬個細胞)懸浮于0. 5mL的正常鹽水 中，其中以每個肽的在集合中為10iig/mL的濃度向正常鹽水中加入125個SIVma。239Gag肽 的集合或 823 個跨越所有 SIVmac239 蛋白(Gag、Pol、Env、Nef、Vif、Tat、Rev、Vpr、Vpx)的 肽。15-mer的有11個氨基酸重疊的肽(純度為> 80% )由NIHAIDS試劑儲藏項目友善提 供(目錄號為 6204、6443、6883、6448-50、6407、8762、6205)。為了集合肽，將每 lmg 管的凍 干的15mer肽溶于10-50 u L純的DMS0并加在一起。SIV Gag和所有肽的集合的濃度分別 為629和72 u g/mL/肽。將肽脈沖的PBMC在37°C水浴中維持1小時，每15分鐘輕柔振蕩， 然后無需洗滌，再靜脈內注入自體動物中。對照的獼猴不接受疫苗的治療。免疫分析如前所述，通過表達細胞內IFN-Y分析SIV特異性⑶4和⑶8T細胞免疫反應19。簡 單地說，將200 ii L全血與1 ii g/mL/肽重疊的15mer SIV肽集合(如上所述)或單獨和DMS0 和共刺激的抗體抗CD28和抗CD49d (BDBiosciences/Pharmingen San Diego CA)和布雷菲 爾得菌素(Brefeldin)A(lOii g/mL，Sigma)在 37°C 孵育 6 小時。加入抗 CD3-PE、抗 CD4-FITC 和抗CD8-PerCP (BD,分別為克隆SP34、M_T477和SK1)抗體30分鐘。裂解紅血細胞(FACS裂 解溶液，BD)，透化處理剩余的白細胞(FACS透化溶液2，BD)并在固定和采集(LSRII，BD)前 用抗人 IFN-y-APC 抗體(BD，克隆 B27)孵育。使用 Flow jo 版本 6. 3. 2 (TreeStar, Ashland, OR)分析采集數據。在⑶3+⑶4+和⑶3+CD8+淋巴細胞亞型二者中評估表達IFNy的抗原特 異性門控淋巴細胞的百分比。如所述，通過Mane-A* 10/KP9四聚體評估Mane-A* 10+動物中 的對免疫顯性SIV Gag⑶8T細胞抗原決定部位KP9的反應22。通過新鮮血的流式細胞術 測量總的外周CD4T細胞占淋巴細胞的比例。病毒分析在墨爾本大學使用前述的TaqMan 探針19’26在所有的時間點上通過140 u L血漿 的實時PCR定量血漿SIV RNA(較低的定量限為3. llog10拷貝/mL)，為了用更靈敏的分析 方法證實這些結果，如前所述，在來自國立癌癥研究所的1. OmL血漿中的沉積的病毒體上 進行實時PCR定量血漿SIV RNA(較低定量限為1.51og1(l拷貝/mL)13。為了鑒定突變逃逸 是否發生在KP9抗原決定部位上，我們進行了 RT-PCR克隆，并對Gag中覆蓋KP9的抽提的 血漿病毒cDNA進行測序，所述步驟如前所述21。端點/統計學分析去除ART后10周(即從12至20周的樣品)，通過時間權重的曲線下面積(TWAUC)， 與對照相比，最初端點為0PAL免疫的動物的血漿SIV RNA中的減少。這一總結的統計學方 法被推薦用于研究，例如包括一系列測定的這些研究28。本發明人分別和一起將活性治療組 (OPAL-Gag和0PAL-A11)與對照進行了比較。最初分析限定為在第10周在ART上控制了病 毒血癥的動物(VL < 3. lloglO拷貝/mL)，因為對VL的控制是動物對免疫治療反應能力的 重要預測因素7’29。在所有活的在ART后期(第10周)調整了 VL和Mane-A*10狀態的動 物中研究了預先計劃的第二病毒學端點。對于連續的數據使用兩樣本t檢驗(two-sample t-tests)進行組比較，對于二進制數據(binary data)使用Fisher確切檢驗(Fisher，s exact test)。存活分析使用Cox回歸分析。功效計算本發明人估計治療中斷后回復VL的標準誤差將是0. SloglO拷貝的SIVRNA/mL血漿5’12’15’23—25。在這一徹底的研究中，估計組中12只猴中的2只可能遇到一些問題，如對 ART的不完全反應或死于急性SIV感染。10只對照對10只活性治療的比較產生80%的效 力(P = 0. 05)，以在第一個10周的過程在TWAUC VL中檢測1. OloglO的差異。10只對照 對所有20只活性治療的動物(OPAL-Gag加OPAL-Al 1)的估計比較給出80%的效力，以檢測 0. 871ogl0拷貝/mLVL減少的差異。研究指導本研究根據預先寫好的規程使用來自澳大利亞治療物品管理局 (theAustralianTherapeutic Goods Administration) W ^M^^tM ff M fe M (Good Laboratory PracticeStandards)作為指導進行。規程的偏離很小，不影響研究的結果。在 研究過程中的部分數據審查沒有引起任何關于研究指導的關注。對本文引用的每個專利、專利申請和公布的公開在此通過參考以其全部并入本文。本文對任何參考的引用不應該被解釋為承認這樣的參考可以作為本申請的“已有 技術”而獲得。貫穿本說明書，目的是公開本發明的優選具體實施方式
而不將本發明限制為任何 一個具體實施方式
或特征的特定收集。因此，本領域技術人員理解，根據本公開，可以在示 例的特定具體實施方式
中作出各種修改和變化而不脫離本發明的范圍。所有這樣的修改和 變化都包括在隨附的權利要求的范圍內。表格魁保守的氨基酸置換
權利要求
一種治療或預防受試者中慢病毒感染的方法，所述方法包括增加受試者中Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特異性抗原呈遞細胞前體的數目，所述Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特異性抗原呈遞細胞前體在其表面呈遞包含對應于Gag多肽一部分的氨基酸序列的至少一個肽，其中以足以使抗原呈遞細胞或前體在其表面呈遞肽或肽的經處理形式的條件將抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體與基本上由多個肽組成的組合物接觸一段時間而產生Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特異性抗原呈遞細胞前體，其中組合物的各個肽包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可選地，與多個肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性。
2.根據權利要求1所述的方法，其中向受試者施與Gag特異性抗原呈遞細胞或Gag特 異性抗原呈遞細胞前體。
3.根據權利要求1所述的方法，其中向受試者施與組合物。
4.根據權利要求3所述的方法，其中顆粒含有肽或肽與顆粒結合。
5.根據權利要求4所述的方法，其中顆粒選自脂質體、微粒、脂質顆粒、陶瓷/無機顆粒 或聚合物顆粒。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法不包括向受試者施與(1)包含對應于非 Gag慢病毒多肽的一部分的氨基酸序列的肽，或(2)已經與根據(1)所述的肽接觸的抗原呈 遞細胞。
7.根據權利要求1所述的方法，其中抗原呈遞細胞選自樹突狀細胞、巨噬細胞或朗格 漢斯細胞。
8.根據權利要求2或3所述的方法，其中抗原呈遞細胞或組合物與藥學上可接受的載 體和/或稀釋劑一起施與。
9.根據權利要求2或3所述的方法，其中抗原呈遞細胞或組合物與佐劑一起施與。
10.根據權利要求3所述的方法，其中組合物與穩定穩定肽的化合物一起施與。
11.根據權利要求1所述的方法，其中慢病毒選自人免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺 陷病毒(SIV)。
12.根據權利要求1所述的方法，其中在單個肽的一端或兩端含有部分序列同一性或 相似性。
13.根據權利要求12所述的方法，其中至少4個連續的氨基酸殘基存在于這些末端的 一個或兩個之中，其序列與至少一個其它肽內含有的氨基酸序列是相同的或相似的。
14.根據權利要求12所述的方法，其中肽的長度為至少6個氨基酸殘基。
15.根據權利要求12所述的方法，其中肽的長度不超過約500個氨基酸殘基。
16.根據權利要求12所述的方法，其中選擇肽的長度以增加細胞毒T淋巴細胞反應的 產生。
17.根據權利要求16所述的方法，其中肽的長度為約8至約10個氨基酸。
18.根據權利要求12所述的方法，其中選擇肽的長度以增加T輔助淋巴細胞反應的產生。
19.根據權利要求18所述的方法，其中肽的長度為約12至約20個氨基酸。
20.根據權利要求12所述的方法，其中肽序列源自對應于Gag多肽的至少約30%的序列。
21.根據權利要求12所述的方法，其中多個肽包含來自2個或多個不同Gag多肽的肽。
22.—種產生用于治療或預防慢病毒感染的抗原呈遞細胞的過程，所述過程包括以足 以使抗原呈遞細胞或前體在其表面呈遞肽或肽的經處理形式的條件將抗原呈遞細胞或抗 原呈遞細胞前體與基本上由多個肽組成的組合物接觸一段時間，其中組合物的各個肽包含 對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可選地，與多個肽的至少一個其它肽顯示部分 序列同一性或相似性。
23.根據權利要求22所述的過程，其中以足以從前體分化抗原呈遞細胞的條件培養前 體一段時間。
24.根據權利要求22所述的過程，其中將肽與基本上純化的抗原呈遞細胞或其前體的 群體接觸。
25.根據權利要求22所述的過程，其中將肽與抗原呈遞細胞或其前體的異種群體接觸。
26.根據權利要求25所述的過程，其中細胞的異種群體選自血或外周血單核細胞。
27.根據權利要求22所述的過程，其中抗原呈遞細胞或其前體選自單核細胞、巨噬細 胞、骨髓系的細胞、B細胞、樹突狀細胞或朗格漢斯細胞。
28.根據權利要求22所述的過程，其中將肽與抗原呈遞細胞或其前體的非培養群體接觸。
29.根據權利要求28所述的過程，其中群體是同種的。
30.根據權利要求28所述的過程，其中群體是異種的。
31.根據權利要求28所述的過程，其中群體選自全血、新鮮血或其組分、外周血單核細 胞、全血的棕黃層組分、沉積的紅細胞、經輻射的血、樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性 粒細胞、淋巴細胞、天然殺傷細胞或天然殺傷T細胞。
32.根據權利要求28所述的過程，其中群體未經歷激活條件。
33.一種產生Gag預處理的淋巴細胞的方法，其中所述方法包括以足以起始淋巴細胞 對Gag多肽反應的條件將淋巴細胞或其前體的群體與通過權利要求22所述的過程產生的 Gag特異性抗原呈遞細胞接觸一段時間。
34.一種治療或預防受試者中慢病毒感染的方法，所述方法包括向受試者施與選自下 列物質的免疫調節劑(1)抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體，其已經以足以使抗原呈遞 細胞或前體在其表面呈遞肽或肽的經處理形式的條件與基本上由多個肽組成的組合物接 觸一段時間，其中組合物的各個肽包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可選 地，與多個肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性；或(2)基本上由多個肽組 成的組合物，其中各個肽包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可選地，與多個 肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性；或(3)淋巴細胞或其前體的群體，其 已經以足以起始淋巴細胞對Gag多肽反應的條件與根據(1)所述的抗原呈遞細胞接觸一段 時間，其中以有效治療或預防慢病毒感染的量施與免疫調節劑。
35.根據權利要求34所述的方法，其中全身施與免疫調節劑。
36.根據權利要求34所述的方法，其中通過注射施與免疫調節劑。
37.一種用于治療或預防受試者中獲得性免疫缺陷疾病的方法，所述方法包括向受試者施與選自下列物質的免疫調節劑(1)抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體，其已經以足 以使抗原呈遞細胞或前體在其表面呈遞肽或肽的經處理形式的條件與基本上由多個肽組 成的組合物接觸一段時間，其中組合物的各個肽包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同 部分和可選地，與多個肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性；或(2)基本上 由多個肽組成的組合物，其中各個肽包含對應于對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分 和可選地，與多個肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性；或(3)淋巴細胞或 其前體的群體，其已經以足以起始淋巴細胞對Gag多肽反應的條件與根據(1)所述的抗原 呈遞細胞接觸一段時間，其中以有效治療或預防疾病的量施與免疫調節劑。
38.選自下列物質的免疫調節劑用于治療或預防選自慢病毒感染或獲得性免疫缺陷疾 病的狀況的用途(1)抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體，其已經以足以使抗原呈遞細胞 或前體在其表面呈遞肽或肽的經處理形式的條件與基本上由多個肽組成的組合物接觸一 段時間，其中組合物的各個肽包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可選地，與 多個肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性；或(2)基本上由多個肽組成的組 合物，其中各個肽包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可選地，與多個肽的至 少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性；或(3)淋巴細胞或其前體的群體，其已經以 足以起始淋巴細胞對Gag多肽反應的條件與根據(1)所述的抗原呈遞細胞接觸一段時間。
39.一種基本上由抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體組成的組合物，其已經以足以使 抗原呈遞細胞或前體在其表面呈遞肽或肽的經處理形式的條件與基本上由多個肽組成的 組合物接觸一段時間，其中組合物的各個肽包含對應于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分 和可選地，與多個肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性。
40.根據權利要求39所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體是基本上 純化的抗原呈遞細胞或前體的群體的形式。
41.根據權利要求39所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體是抗原呈 遞細胞或前體的異種群體的形式。
42.根據權利要求41所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或其前體的異種群體選自血或 外周血單核細胞。
43.根據權利要求39所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或其前體選自單核細胞、巨噬 細胞、骨髓系的細胞、B細胞、樹突狀或朗格漢斯細胞。
44.根據權利要求39所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或其前體是抗原呈遞細胞或其 前體的非培養群體的形式。
45.根據權利要求44所述的組合物，其中群體是同種的。
46.根據權利要求44所述的組合物，其中群體是異種的。
47.根據權利要求44所述的組合物，其中群體選自全血、新鮮血或其組分、外周血單核 細胞、全血的棕黃層組分、沉積的紅細胞、經輻射的血、樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、中 性粒細胞、淋巴細胞、天然殺傷細胞或天然殺傷T細胞。
48.根據權利要求44所述的組合物，其中群體未經歷激活條件。
49.根據權利要求39所述的組合物，不包括在其表面呈遞包含對應于非Gag多肽部分 的氨基酸序列的肽的抗原呈遞細胞。
50.一種基本上由多個肽組成的組合物，其中各個肽包含對應Gag多肽的氨基酸序列 的不同部分和可選地，與多個肽的至少一個其它肽顯示部分序列同一性或相似性。
51.根據權利要求50所述的組合物，其中顆粒含有肽或肽與顆粒結合。
52.根據權利要求51所述組合物，其中顆粒選自脂質體、微粒、脂質顆粒、陶瓷/無機顆 粒或聚合物顆粒。
53.根據權利要求50所述的組合物，進一步包含抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體。
54.根據權利要求53所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體是基本上 純化的抗原呈遞細胞或前體的群體的形式。
55.根據權利要求53所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或抗原呈遞細胞前體是抗原呈 遞細胞或其前體的異種群體的形式。
56.根據權利要求55所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或前體的異種群體選自血或外 周血單核細胞。
57.根據權利要求53所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或其前體選自單核細胞、巨噬 細胞、骨髓系的細胞、B細胞、樹突狀細胞或朗格漢斯細胞。
58.根據權利要求53所述的組合物，其中抗原呈遞細胞或其前體是抗原呈遞細胞或其 前體的非培養群體的形式。
59.根據權利要求58所述的組合物，其中群體是同種的。
60.根據權利要求58所述的組合物，其中群體是異種的。
61.根據權利要求60所述的組合物，其中群體選自全血、新鮮血或其組分、外周血單核 細胞、全血的棕黃層組分、沉積的紅細胞、經輻射的血、樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、中 性粒細胞、淋巴細胞、天然殺傷細胞或天然殺傷T細胞。
62.根據權利要求58所述的組合物，其中群體未經歷激活條件。
63.根據權利要求51所述的組合物，不包括在其表面呈遞包含對應于非Gag多肽部分 的氨基酸序列的肽的抗原呈遞細胞。
64.根據權利要求50所述的組合物，不包括包含對應于非Gag慢病毒多肽一部分的氨 基酸序列的肽。
65.根據權利要求39或權利要求50所述的組合物在治療或預防選自慢病毒感染或獲 得性免疫缺陷疾病的狀況中的用途。
66.根據權利要求39或權利要求50所述的組合物在制備用于治療或預防選自慢病毒 感染或獲得性免疫缺陷疾病的狀況的藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了基本上由Gag多肽或其至少一部分，和可選的抗原呈遞細胞或其前體組成的組合物，用于治療或預防慢性病毒感染，包括治療或預防相關的獲得性免疫缺陷疾病。在一些具體實施方式
中，所述組合物基本上由源自單一Gag多肽或源自不同Gag多肽的多個重疊的和/或不重疊的肽組成。
文檔編號A61P37/00GK101951931SQ200880125009
公開日2011年1月19日 申請日期2008年1月16日 優先權日2008年1月16日
發明者R·德羅斯, S·肯特, V·伯特 申請人:歐寶治療私人有限公司