Mmtv抗原的免疫調節組合物及其使用方法

專利名稱：Mmtv抗原的免疫調節組合物及其使用方法
1．引言本發明涉及對有此需要的人體給藥一種免疫調節組合物的方法，該免疫調節組合物至少包含一種小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)抗原，用來誘導針對這種抗原的免疫應答。本發明還涉及由MMTV核酸編碼的重組MMTV抗原和含有這種重組MMTV抗原的免疫調節組合物，以及有效制備這種抗原的方法。本發明還涉及用于被動免疫治療的、含有針對MMTV抗原的抗體的組合物。
2．發明背景乳腺癌本身多種多樣，婦女中乳腺癌的發病在世界范圍內各不相同，Parkin等，1992,Ⅵ IARC Scientific Publications No.120,國際癌癥研究機構。例如，極地附近的因紐特與丹麥、加拿大和康涅狄格相比，只有大約一半的發病率，Miller等，1996,ActaOncologica,35:577-580。膳食中輔因子或促進因子的改變曾被認為是人乳腺癌發病率不同的原因，這包括植物雌激素，Wu等，1996，《癌癥流行病學、生物標記和預防》，5卷，901-906頁；和異雌激素，Davis等，1995，《科學美國人》，10月刊，166-172頁。但是，高脂肪膳食和環境異雌激素引起人乳腺癌增加的證據是不令人信服的，Modan等，1975，《癌癥研究》，35卷，3503-3506頁；Hunter等，1996，《新英格蘭醫學雜志》，334卷，356-361頁；Krieger等，1994,J.Nat.Cancer Inst.86卷，590-599頁。
一個已知的乳腺癌誘導試劑是小鼠乳腺瘤病毒，盡管是在小鼠中。小鼠乳腺瘤病毒是一種B型逆轉錄病毒，它通過插入誘變在易感小鼠中誘導乳腺瘤(乳腺癌)。與其他逆轉錄病毒相似，MMTV基因組編碼三種類型的結構蛋白非糖基化的病毒核心蛋白(gag)、病毒逆轉錄酶(pol)以及病毒包膜糖蛋白(env)。主要的結構蛋白根據它們的分子量進行命名，包括糖蛋白(gp)55、gp34、蛋白(p)28、p18、p14和p12。病毒基因組的3’和5’末端由被稱為病毒長末端重復(LTR)的重復序列組成，LTR的大小約為1300堿基對(bp)。LTR的3’區域內是一個約為1000bp的開放閱讀框(orf)，其蛋白產物被稱為超抗原(SAg)，它對宿主T細胞群體介導深遠的影響。
不像其他致癌逆轉錄病毒，MMTV不攜帶獨特的癌基因。而是通過感染乳腺上皮細胞，將MMTV前病毒插入宿主基因組的int-1或int-2或其他未鑒定的基因區域，通過MMTV LTR中的糖皮質激素應答元件的增強子活性，導致這些基因的活化。
已經證明，不攜帶MMTV的小鼠通常能方便地用MMTV抗原進行免疫，從而對MMTV感染的乳腺瘤組織的移植物攻擊具有較低的易感性或具有完全的抗性，B1air,1971，《以色列醫學科學雜志》7卷，161-186頁；Wei等，1993，《癌癥生物學》，4卷，205-213頁。
通過尋找病毒顆粒、免疫交叉反應或序列同源性以證明病毒在人乳腺癌中存在的努力已得到了相互矛盾的結果。已在以下樣品中發現了可檢測到的MMTV env基因相關的抗原反應乳腺癌組織切片，Mesa-Tejada等，1978，《美國科學院院刊》75卷，1529-1533頁；Levine等，1980《美國癌癥研究協會進展》21卷，170頁；Lloyd等，1983，《癌癥》51卷，654-661頁；培養的乳腺癌細胞，Litvinov和Golovkina,1989,Acta Virologica,33卷，137-142頁；人奶，Zotter等，1980，《歐洲癌癥雜志》16卷，455-467頁；病人血清，Day等，1981，《美國科學院院刊》78卷，2483-2487頁；囊腫液，Witkin等，1981，《臨床探索雜志》67卷，216-222頁；人乳腺癌細胞系產生的顆粒，Keydar等，1984，《美國科學院院刊》81卷，4188-4192頁。已經發現人DNA在低嚴謹條件下與MMTV具有序列同源性，Callahan等，1992，《美國科學院院刊》79卷，5503-5507頁，并且已經在人乳腺癌細胞中檢測到與MMTV有關的RNA,Axel等，1972，《自然》235卷，32-36頁。MMTV相關序列在患有乳腺癌病人的淋巴細胞中存在以及在他們的單核細胞中檢測到逆轉錄酶(RT)活性已由Crepin等人報道，1984，《生物化學生物物理研究通訊》118卷，324-331頁。Al-Sumidaie等，1988，《癌癥研究》49卷3879-3883報道了按串聯重復方式排列的MMTV樣序列僅在來自乳腺癌細胞的DNA中存在。
但是，以相對近一些時候發現的人內源逆轉錄序列(“HERs”)的觀點來看，Westley等，1986，《病毒學雜志》60卷，743-749頁，Ono等，1986，《病毒學雜志》60卷，589-598頁，Faff等，1992，《普通病毒學雜志》73卷，1087-1097頁，國際專利出版物WO97/17470，這些結果很難解釋。可以解釋為證明MMTV相關序列存在的數據更容易用人內源逆轉錄序列進行解釋，Pogo和Holland,1997，《生物痕量元素研究》56卷，131-142頁。更為增加混亂的是，在人蛋白的表位中檢測到了env基因相關的抗原性，Hareuveni等，1990，《國際癌癥雜志》46卷，1134-1135頁。因此，對于乳腺癌的原因，已經有多種相互矛盾的解釋。
在這里或本申請的任何其他章節引用的參考文獻不應理解為這些參考文獻是本發明的現有技術。
3．發明簡述本發明的方法涉及對人給藥一種免疫調節組合物，該組合物至少包含一種MMTV抗原，用來誘導針對MMTV的細胞或體液免疫應答的增加，預防或治療人體因MMTV感染而引起的疾病或紊亂。本發明部分基于以下發現，MMTV人獸互傳給人的發生以及MMTV感染能在人中引起疾病和紊亂，包括乳腺癌和非霍奇金氏淋巴瘤。本發明的發明者已經確定，乳腺癌在全世界的不同發病率與不同地理區域中小鼠的MMTV流行和病毒載量有關。
本發明的方法還可用于預防或治療人體中由一種能與抗MMTV抗原的抗體反應的生物或化學試劑引起的疾病或紊亂。這種免疫調節組合物至少包含一種MMTV抗原和一種可藥用的載劑。
在本發明的另一個實施方案中，該組合物至少包含一種針對MMTV抗原的抗體，這種組合物可用于被動免疫治療，預防或治療人體中因MMTV感染引起的疾病或紊亂，或者預防或治療人體中由一種能與抗MMTV抗原的抗體反應的生物或化學試劑引起的疾病或紊亂。
本發明還通過測定一種試驗MMTV抗原是否能與一種獲自對MMTV抗原已經顯示免疫應答的個體(即個體如已經接觸或感染MMTV的人或小鼠)的抗體或免疫細胞反應，或者通過測定試驗抗原是否能與一種獲自用MMTV抗原免疫的個體的抗體或免疫細胞反應，來提供選擇能誘導免疫應答的MMTV抗原的方法，以及這種所選抗原在本發明的免疫調節組合物中的應用。
本發明還通過用獲自對MMTV抗原已經顯示免疫應答的個體的抗體或免疫細胞對文庫(例如，包括但不限于組合肽庫、隨機肽庫或噬菌體表達文庫)進行篩選，或者用獲自MMTV抗原免疫的個體的抗體或免疫細胞(例如一種中和性的鼠多克隆或單克隆抗體)進行篩選，來提供獲得一種MMTV的肽模擬物的方法。文庫的反應陽性成員(模擬物)可用于本發明的免疫調節組合物。這種模擬物可代表MMTV抗原的連續或不連續表位。
3.1定義以下詞在這里使用時將含有后面指明的意思。
“MMTV抗原”是指一種肽，它包含一種MMTV編碼肽的全長天然氨基酸序列或其一個部分，例如，包括但不限于包膜肽、逆轉錄酶、核心蛋白或編碼的超抗原。該詞還指肽的類似物，這種類似物是功能上例如抗原性上的等價肽，例如一種肽模擬物。優選的類似物為基本上與相應的天然氨基酸同源的類似物，并且至少包含一種天然MMTV表位，例如一種中和表位。“MMTV抗原”一詞還指編碼一種肽的核酸分子，該肽包含一種MMTV編碼蛋白的全長天然氨基酸序列或其一個部分。該詞還指核酸分子的類似物，這種類似物在功能上是等價的，例如編碼一種MMTV肽的分子。類似物可以是基本上與相應天然核苷酸序列同源的和編碼至少含有一種天然MMTV表位如中和表位的肽的類似物。“MMTV抗原”一詞還指一種肽，這種肽至少含有MMTV的不連續表位，或者是這種肽的類似物。該詞還指編碼一種肽的核酸分子，其中肽至少含有一種MMTV的不連續表位，或者是這種核酸分子的類似物。
“不連續表位”是指這樣一種表位，它含有源自肽原始氨基酸序列中不同位置但在肽的三維結構中彼此相鄰的氨基酸序列。這種不連續表位也被稱為構象表位，它可由包含編碼這些三維上相鄰的氨基酸序列的核酸分子編碼。它與連續表位相對，連續表位被定義為這樣一種表位，其中抗原性殘基存在于一個短的氨基酸序列中，即相互連續。
“有效數量”是指足以在被給藥的受體中誘導可檢測的免疫應答的抗原數量。免疫應答可包括能與抗原反應性抗體產生的誘導或細胞或體液免疫的誘導，但這不是限制。
“免疫調節組合物”是指含有一種MMTV抗原和一種可藥用載劑的組合物，當這種組合物被給藥于受體時能在受體的免疫系統功能中引起一種可檢測的改變，例如免疫特異性抗體的產生或能引發細胞介導的免疫應答的抗體的產生。
“可藥用載劑”是指一種不干擾活性成分的生物活性有效性的載體基質，它在化學特性上是惰性的，并且對給予了給藥數量的病人沒有毒性。
“治療或預防由MMTV引起的疾病或紊亂”是指抑制MMTV病毒的復制，抑制MMTV的轉移，或防止MMTV在其宿主中組裝，或減輕或緩解MMTV感染引起的疾病的癥狀，包括但不限于乳腺癌和非霍奇金氏淋巴瘤。該詞還包括減輕或緩解由一種能與抗MMTV抗原的抗體反應的生物或化學試劑引起的疾病的癥狀。如果存在病毒載量例如血液中病毒的拷貝數減少、致死性和/或致病性降低的情況，該處理就被認為是治療性的。
4．附圖簡述

圖1顯示了一株鼠乳腺瘤病毒的完整前病毒基因組的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
圖2顯示了gag-pol-pro多肽的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
圖3顯示了gag-pro多肽的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
圖4顯示了gag多肽的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
圖5顯示了env多肽的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
圖6顯示了超抗原(SAg)多肽的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
5．發明詳述本發明的方法涉及對人給藥一種免疫調節組合物，該組合物至少含有一種MMTV抗原，用于誘導抗MMTV的細胞或體液免疫應答的增加，來預防或治療人體中因MMTV感染引起的疾病或紊亂。本發明的方法還可用于預防或治療人體中由一種能與抗MMTV抗原的抗體反應的生物或化學試劑引起的疾病或紊亂。該免疫調節組合物至少含有一種MMTV抗原和一種可藥用的載劑。如同上文所定義的，MMTV抗原可特別地是一種肽、肽類似物或編碼這種肽或肽類似物的核酸分子。這種肽可包括MMTV的gag、pol和包膜蛋白及其部分。本發明進一步涉及表達MMTV抗原的方法，包括表達載體和細胞系(真核、原核以及病毒表達載體)，以及這種表達抗原在本發明的免疫調節組合物中的應用。
在本發明的另一個實施方案中，組合物至少含有一種針對MMTV抗原的抗體，該組合物可用于被動免疫治療，用來預防或治療人體中因MMTV感染引起的疾病或紊亂，或者用來預防或治療人體中由一種能與抗MMTV抗原的抗體反應的生物或化學試劑引起的疾病或紊亂。
本發明還通過測定一種試驗MMTV抗原是否能與一種獲自對MMTV抗原已經顯示免疫應答的個體(即個體例如已經接觸或感染MMTV的人或小鼠)的抗體或免疫細胞反應，或者通過測定試驗抗原是否能與一種獲自用本發明的免疫調節組合物免疫的個體的抗體或免疫細胞反應，來提供選擇能誘導免疫應答的MMTV抗原的方法，以及這種所選抗原在本發明的免疫調節組合物中的應用。例如，抗體可以是一種中和性的鼠多克隆或單克隆抗體。
本發明還通過用獲自對MMTV抗原已經顯示免疫應答的個體的抗體或免疫細胞對文庫(例如，包括但不限于組合肽庫、隨機肽庫或噬菌體表達文庫)進行篩選，或者用獲自用本發明的免疫調節組合物免疫的個體的抗體或免疫細胞(例如一種中和性的鼠多克隆或單克隆抗體)進行篩選，來提供獲得一種MMTV抗原的肽模擬物的方法。文庫的反應陽性成員(模擬物)可用于本發明的免疫調節組合物。
在本發明的一個實施方案中，至少一種抗原性或免疫原性的MMTV肽被用于本發明的免疫調節組合物中。在本發明的另一個實施方案中，至少有一種MMTV核苷酸序列被用于本發明的免疫調節組合物中，該核苷酸序列在表達于一種合適的宿主細胞時，至少產生一種抗原性或免疫原性的MMTV肽。一種抗原性的肽能被針對該肽的抗體免疫特異性地結合。一種免疫原性的肽能夠激發針對該肽的免疫應答，例如產生能免疫特異性地結合該肽的抗體或引發針對該肽的細胞介導的免疫應答。
這種免疫調節組合物可單獨以預防的方式用于那些沒有接觸MMTV或者MMTV抗體反應性生物或化學試劑的受體，或在受體已經感染或接觸了MMTV或接觸了MMTV抗體反應性生物或化學試劑或者同時接觸了上述兩種物質后用于治療程序。本發明的MMTV抗原還可用于診斷免疫試驗、被動免疫治療和產生抗獨特型抗體。
5.1．MMTV肽本發明包括MMTV肽及其免疫原性或抗原性部分，以及這種肽或部分的類似物，具有至少代表一種MMTV的不連續表位的氨基酸序列的肽，和它們在本發明的免疫調節組合物中的應用。本發明的肽包括以下(1)任何具有一個能與抗MMTV抗體免疫反應的氨基酸序列的肽；(2)任何具有一個包含如圖2-6中所示的任一氨基酸序列(SEQ IDNO:2-6)或其至少6個連續氨基酸的免疫原性或抗原性部分的氨基酸序列的肽；以及(3)任何具有一個代表MMTV抗原的不連續表位的氨基酸序列并能與一種MMTV肽反應性抗體反應的肽。例如，圖2中所示的、可用于本發明的組合物的、一種肽的抗原性部分具有選自大約aax至大約aay的氨基酸序列，其中aax表示大約從SEQ ID NO:2的1號氨基酸至大約1746號氨基酸，aay是SEQ ID NO:2的約x+9號氨基酸，即一個選自含有如下氨基酸序列的氨基酸序列從SEQ ID NO:2的大約aa1至大約aa10，大約aa2至大約 aa11，大約aa3至大約 aa12，大約 aa4至大約aa13， 大約 aa5至大約aa14， 大約aa6至大約aa15，大約aa7至大約 aa16，大約aa8至大約 aa17，大約 aa9至大約aa18， 大約 aa10至大約aa19， 大約aa11至大約aa20，大約aa12至大約 aa21，大約aa13至大約 aa22，大約 aa14至大約aa23， 大約 aa15至大約aa24， 大約aa16至大約aa25，大約aa17至大約 aa26，大約aa18至大約 aa27，大約 aa19至大約aa28， 大約 aa20至大約aa29， 大約aa21至大約aa30，大約aa22至大約 aa11，大約aa23至大約 aa32，大約 aa24至大約aa33， 大約 aa25至大約aa34， 大約aa26至大約aa35，大約aa27至大約 aa36，大約aa28至大約 aa37，大約 aa29至大約aa38， 大約 aa30至大約aa39， 大約aa31至大約aa40，大約aa32至大約 aa41，大約aa33至大約 aa42，大約 aa34至大約aa43， 大約 aa35至大約aa44， 大約aa36至大約aa45， 大約aa37至大約aa46，大約aa38至大約aa47，大約 aa39至大約aa48，大約 aa40至大約aa49，大約 aa41至大約aa50， 大約aa42至大約aa51，大約aa43至大約aa52，大約 aa44至大約aa53，大約 aa45至大約aa54，大約 aa46至大約aa55， 大約aa47至大約aa56，大約aa48至大約aa57，大約 aa49至大約aa58，大約 aa50至大約aa59，大約 aa51至大約aa60， 大約aa52至大約aa61，大約aa53至大約aa62，大約 aa54至大約aa63，大約 aa55至大約aa64，大約 aa56至大約aa65， 大約aa57至大約aa66，大約aa58至大約aa67，大約 aa59至大約aa68，大約 aa60至大約aa69，大約 aa61至大約aa70， 大約aa62至大約aa71，大約aa63至大約aa72，大約 aa64至大約aa73，大約 aa65至大約aa74，大約 aa66至大約aa75， 大約aa67至大約aa76，大約aa68至大約aa77，大約 aa69至大約aa78，大約 aa70至大約aa79，大約 aa71至大約aa80， 大約aa72至大約aa81，大約aa73至大約aa82，大約 aa74至大約aa83，大約 aa75至大約aa84，大約 aa76至大約aa85， 大約aa77至大約aa86，大約aa78至大約aa87，大約 aa79至大約aa88，大約 aa80至大約aa89，大約 aa81至大約aa90， 大約aa82至大約aa91，大約aa83至大約aa92，大約 aa64至大約aa93，大約 aa85至大約aa94，大約 aa86至大約aa95， 大約aa87至大約aa96，大約aa88至大約aa97，大約 aa89至大約aa98，大約 aa90至大約aa99，大約 aa91至大約aa100，大約aa92至大約aa101，大約 aa93至大約aa102，大約 aa94至大約aa103，大約 aa95至大約aa104，大約 aa96至大約aa105，大約 aa97至大約aa106，大約 aa98至大約aa107，大約 aa99至大約aa108，大約 aa100至大約aa109，大約aa101至大約aa110，大約 aa102至大約aa111，大約 aa103至大約aa112，大約 aa104至大約aa113，大約 aa105至大約aa114，大約 aa106至大約aa115，大約 aa107至大約aa116，大約 aa108至大約aa117，大約 aa109至大約aa118，大約 aa110至大約aa119，大約 aa111至大約aa120，大約 aa111至大約aa121，大約 aa113至大約aa122，大約 aa114至大約aa123，大約 aa115至大約aa124，大約 aa116至大約aa125，大約 aa117至大約aa126，大約 aa118至大約aa127，大約 aa119至大約aa128，大約 aa120至大約aa129，大約 aa121至大約aa130，大約 aa122至大約aa131，大約 aa123至大約aa132，大約 aa124至大約aa133，大約 aa125至大約aa134，大約 aa126至大約aa135，大約 aa127至大約aa136，大約 aa128至大約aa137，大約 aa129至大約aa138，大約 aa130至大約aa139，大約 aa131至大約aa140，大約 aa132至大約aa141，大約 aa133至大約aa142，大約 aa134至大約aa143，大約 aa135至大約aa144，大約 aa136至大約aa145，大約 aa137至大約aa146，大約 aa138至大約aa147，大約 aa139至大約aa148，大約 aa140至大約aa149，大約 aa141至大約aa150，大約 aa142至大約aa151，大約 aa143至大約aa152，大約 aa144至大約aa153，大約 aa145至大約aa154，大約 aa146至大約aa155，大約 aa147至大約aa156，大約 aa148至大約aa157，大約 aa149至大約aa158，大約 aa150至大約aa159，大約 aa151至大約aa160，大約 aa152至大約aa161，大約 aa153至大約aa162，大約 aa154至大約aa163，大約 aa155至大約aa164，大約 aa156至大約aa165，大約 aa157至大約aa166，大約 aa158至大約aa167，大約 aa159至大約aa168，大約 aa160至大約aa169，大約 aa161至大約aa170，大約 aa162至大約aa171，大約 aa163至大約aa172，大約 aa164至大約aa173，大約 aa165至大約aa174，大約 aa166至大約aa175，大約 aa167至大約aa176，大約 aa168至大約aa177，大約 aa169至大約aa178，大約 aa170至大約aa179，大約 aa171至大約aa180，大約 aa172至大約aa181，大約 aa173至大約aa182，大約 aa174至大約aa183，大約 aa175至大約aa184，大約 aa176至大約aa185，大約 aa177至大約aa186，大約 aa178至大約aa187，大約 aa179至大約aa188，大約 aa180至大約aa189，大約 aa181至大約aa190，大約 aa182至大約aa191，大約 aa183至大約aa192，大約 aa184至大約aa193，大約 aa185至大約aa194，大約 aa186至大約aa195，大約 aa187至大約aa196，大約 aa188至大約aa197，大約 aa189至大約aa198，大約 aa190至大約aa199，大約 aa191至大約aa200，大約 aa192至大約aa201，大約 aa193至大約aa202，大約 aa194至大約aa203，大約 aa195至大約aa204，大約 aa196至大約aa205，大約 aa197至大約aa206，大約 aa198至大約aa207，大約 aa199至大約aa208，大約 aa200至大約aa209，大約 aa201至大約aa210，大約 aa202至大約aa211，大約 aa203至大約aa212，大約 aa204至大約aa213，大約 aa205至大約aa214，大約 aa206至大約aa215，大約 aa207至大約aa216，大約 aa208至大約aa217，大約 aa209至大約aa218，大約 aa210至大約aa219，大約 aa211至大約aa220，大約 aa212至大約aa221，大約 aa213至大約aa222，大約 aa214至大約aa223，大約 aa215至大約aa224，大約 aa216至大約aa225，大約 aa217至大約aa226，大約 aa218至大約aa227，大約 aa219至大約aa228，大約 aa220至大約aa229，大約 aa221至大約aa230，大約 aa222至大約aa231，大約 aa223至大約aa232，大約 aa224至大約aa233，大約 aa225至大約aa234，大約 aa226至大約aa235，大約 aa227至大約aa236，大約 aa228至大約aa237，大約aa229至大約aa238，大約 aa230至大約aa239，大約 aa231至大約aa240，大約 aa232至大約aa241，大約 aa233至大約aa242，大約 aa234至大約aa243，大約 aa235至大約aa244，大約 aa236至大約aa245，大約 aa237至大約aa246，大約 aa238至大約aa247，大約 aa239至大約aa248，大約 aa240至大約aa249，大約 aa241至大約aa250，大約 aa242至大約aa251，大約 aa243至大約aa252，大約 aa244至大約aa253，大約 aa245至大約aa254，大約 aa246至大約aa255，大約 aa247至大約aa256，大約 aa248至大約aa257，大約 aa249至大約aa258，大約 aa250至大約aa259，大約 aa251至大約aa260，大約 aa252至大約aa261，大約 aa253至大約aa262，大約 aa254至大約aa263，大約 aa255至大約aa264，大約 aa256至大約aa265，大約 aa257至大約aa266，大約 aa258至大約aa267，大約 aa259至大約aa268，大約 aa260至大約aa269，大約 aa261至大約aa270，大約 aa262至大約aa271，大約 aa263至大約aa272，大約 aa264至大約aa273，大約 aa265至大約aa274，大約 aa266至大約aa275，大約 aa267至大約aa276，大約 aa268至大約aa277，大約 aa269至大約aa278，大約 aa270至大約aa279，大約 aa271至大約aa280，大約 aa272至大約aa281，大約 aa273至大約aa282，大約 aa274至大約aa283，大約 aa275至大約aa284，大約 aa276至大約aa285，大約 aa277至大約aa286，大約 aa278
至大約aa287，大約 aa279至大約aa288，大約 aa280至大約aa289，大約 aa281至大約aa290，大約 aa282至大約aa291，大約 aa283至大約aa292，大約 aa284至大約aa293，大約 aa285至大約aa294，大約 aa286至大約aa295，大約 aa287至大約aa296，大約 aa288至大約aa297，大約 aa289至大約aa298，大約 aa290至大約aa299，大約 aa291至大約aa300，大約 aa292至大約aa301，大約 aa293至大約aa302，大約 aa294至大約aa303，大約 aa295至大約aa304，大約 aa296至大約aa305，大約 aa297至大約aa306，大約 aa298至大約aa307，大約aa299至大約aa308，大約 aa300至大約aa309，大約 aa301至大約aa310，大約 aa302至大約aa311，大約 aa303至大約aa312，大約 aa304至大約aa313，大約 aa305至大約aa314，大約 aa306至大約aa315，大約 aa307至大約aa316，大約 aa308至大約aa317，大約 aa309至大約aa318，大約 aa310至大約aa319，大約 aa311至大約aa320，大約 aa312至大約aa321，大約 aa313至大約aa322，大約 aa314至大約aa323，大約aa315至大約aa324，大約 aa316至大約aa325，大約 aa317至大約aa326，大約 aa318至大約aa327，大約 aa319至大約aa328，大約 aa320至大約aa329，大約 aa321至大約aa330，大約 aa322至大約aa331，大約aa323至大約aa332，大約 aa324至大約aa333，大約 aa325至大約aa334，大約 aa325至大約aa335，大約 aa327至大約aa336，大約 aa328至大約aa337，大約 aa329至大約aa338，大約 aa330至大約aa339，大約 aa331至大約aa340，大約 aa332至大約aa341，大約 aa333至大約aa342，大約 aa334至大約aa343，大約 aa335至大約aa344，大約 aa336至大約aa345，大約 aa337至大約aa346，大約 aa338至大約aa347，大約 aa339至大約aa348，大約 aa340至大約aa349，大約 aa341至大約aa350，大約 aa342至大約aa351，大約 aa343至大約aa352，大約 aa344至大約aa353，大約 aa345至大約aa354，大約 aa346至大約aa355，大約 aa347至大約aa356，大約 aa348至大約aa357，大約 aa349至大約aa358，大約 aa350至大約aa359，大約 aa351至大約aa360，大約 aa352至大約aa361，大約 aa353至大約aa362，大約 aa354至大約aa363，大約 aa355至大約aa364，大約 aa356至大約aa365，大約 aa357至大約aa366，大約 aa358至大約aa367，大約 aa359至大約aa368，大約 aa360至大約aa369，大約 aa361至大約 aa370，大約 aa362至大約aa371，大約 aa363至大約aa372，大約 aa364至大約aa373，大約 aa365至大約aa374，大約 aa366至大約aa375，大約 aa367至大約aa376，大約 aa368至大約aa377，大約 aa369至大約aa378，大約 aa370至大約aa379，大約 aa371至大約aa380，大約 aa372至大約aa381，大約 aa373至大約aa382，大約 aa374至大約aa383，大約 aa375至大約aa384，大約 aa376至大約aa385，大約 aa377至大約aa386，大約 aa378至大約aa387，大約 aa379至大約aa388，大約 aa380至大約aa389，大約 aa381至大約aa390，大約 aa382至大約aa391，大約 aa383至大約aa392，大約 aa384至大約aa393，大約 aa385至大約aa394，大約 aa386至大約aa395，大約 aa387至大約aa396，大約 aa388至大約aa397，大約 aa389至大約aa398，大約 aa390至大約aa399，大約 aa391至大約aa400，大約 aa392至大約aa401，大約aa393至大約aa402，大約 aa394至大約aa403，大約 aa395至大約aa404，大約aa396至大約aa405，大約 aa397至大約aa406，大約 aa398至大約aa407，大約 aa399至大約aa408，大約 aa400至大約aa409，大約 aa401至大約aa410，大約 aa402至大約aa411，大約 aa403至大約aa412，大約 aa404至大約aa413，大約 aa405至大約aa414，大約 aa406至大約aa415，大約 aa407至大約aa416，大約 aa408至大約aa417，大約 aa409至大約aa418，大約 aa410至大約aa419，大約 aa411至大約aa420，大約aa412至大約aa421，大約 aa413至大約aa422，大約 aa414至大約aa423，大約 aa415至大約aa424，大約 aa416至大約aa425，大約 aa417至大約aa426，大約 aa418至大約aa427，大約 aa419至大約aa428，大約 aa420至大約aa429，大約 aa421至大約aa430，大約 aa422至大約aa431，大約 aa423至大約aa432，大約 aa424至大約aa433，大約 aa425至大約aa434，大約 aa426至大約aa435，大約 aa427至大約aa436，大約 aa428至大約aa437，大約 aa429至大約aa438，大約 aa430至大約aa439，大約 aa431至大約aa440，大約 aa432至大約aa441，大約 aa433至大約aa442，大約 aa434至大約aa443，大約 aa435至大約aa444，大約 aa436至大約aa445，大約 aa437至大約aa446，大約 aa438至大約aa447，大約 aa439至大約aa448，大約 aa440至大約aa449，大約 aa441至大約aa450，大約 aa442至大約aa451，大約 aa443至大約aa452，大約 aa444至大約aa453，大約 aa445至大約aa454，大約 aa446至大約aa455，大約 aa447至大約aa456，大約 aa448至大約aa457，大約 aa449至大約aa458，大約 aa450至大約aa459，大約 aa451至大約aa460，大約 aa452至大約aa461，大約 aa453至大約aa462，大約 aa454至大約aa463，大約 aa455至大約aa464，大約 aa456至大約aa465，大約 aa457至大約aa466，大約 aa468至大約aa467，大約 aa459至大約aa468，大約 aa460至大約aa469，大約 aa461至大約aa470，大約 aa462至大約aa471，大約 aa463至大約aa472，大約 aa464至大約aa473，大約 aa465至大約aa474，大約 aa466至大約aa475，大約 aa467至大約aa476，大約 aa468至大約aa477，大約 aa469至大約aa478，大約 aa470至大約aa479，大約 aa471至大約aa480，大約 aa472至大約aa481，大約 aa473至大約aa482，大約 aa474至大約aa483，大約 aa475至大約aa484，大約 aa476至大約aa485，大約 aa477至大約aa486，大約 aa478至大約aa487，大約 aa479至大約aa488，大約 aa480至大約aa489，大約 aa481至大約aa490，大約 aa482至大約aa491，大約 aa483至大約aa492，大約 aa484至大約aa493，大約 aa485至大約aa494，大約 aa486至大約aa495，大約 aa487至大約aa496，大約 aa488至大約aa497，大約 aa489至大約aa498，大約 aa490至大約aa499，大約 aa491至大約aa500，大約 aa492至大約aa501，大約 aa493至大約aa502，大約 aa494至大約aa503，大約 aa495至大約aa504，大約 aa496至大約aa505，大約 aa497至大約aa506，大約 aa498至大約aa507，大約 aa499至大約aa508，大約 aa500至大約aa509，大約 aa501至大約aa510，大約 aa502至大約aa511，大約 aa503至大約aa512，大約 aa504至大約aa513，大約 aa505至大約aa514，大約 aa506至大約aa515，大約 aa507至大約aa516，大約 aa508至大約aa517，大約 aa509至大約aa518，大約 aa510至大約aa519，大約 aa511至大約aa520，大約 aa512至大約aa521，大約 aa513至大約aa522，大約 aa514至大約aa523，大約 aa515至大約aa524，大約 aa516
至大約aa525，大約 aa517至大約aa526，大約 aa518至大約aa527，大約 aa519至大約aa528，大約 aa520至大約aa529，大約 aa521至大約aa530，大約 aa522至大約aa531，大約 aa523至大約aa532，大約 aa524至大約aa533，大約 aa525至大約aa534，大約 aa526至大約aa535，大約 aa527至大約aa536，大約 aa528至大約aa537，大約 aa529至大約aa538，大約 aa530至大約aa539，大約 aa531至大約aa540，大約 aa532至大約aa541，大約 aa533至大約aa542，大約 aa534至大約aa543，大約 aa535至大約aa544，大約 aa536至大約aa545，大約 aa537至大約aa546，大約 aa538至大約aa547，大約 aa539至大約aa548，大約 aaa540至大約aa549，大約 aa541至大約aa550，大約 aa542至大約aa551，大約 aa543至大約aa552，大約 aa544至大約aa553，大約 aa545至大約aa554，大約 aa546至大約aa555，大約 aa547至大約aa556，大約 aa548至大約aa557，大約 aa549至大約aa558，大約 aa550至大約aa559，大約 aa551至大約aa560，大約 aa552至大約aa561，大約 aa553至大約aa562，大約 aa554至大約aa563，大約 aa555至大約aa564，大約 aa556至大約aa565，大約 aa557至大約aa566，大約 aa558至大約aa567，大約 aa559至大約aa568，大約 aa560至大約aa569，大約 aa561至大約aa570，大約 aa562至大約aa571，大約 aa563至大約aa572，大約 aa564至大約aa573，大約 aa565至大約aa574，大約 aa566至大約aa575，大約 aa567至大約aa576，大約 aa568至大約aa577，大約 aa569至大約aa578，大約 aa570至大約aa579，大約 aa571至大約aa580，大約 aa572至大約aa581，大約 aa573至大約aa582，大約 aa574至大約aa583，大約 aa575至大約aa584，大約 aa576至大約aa585，大約aa577至大約aa586，大約 aa578至大約aa587，大約 aa579至大約aa588，大約 aa580至大約aa589，大約 aa581至大約aa590，大約 aa582至大約aa591，大約 aa583至大約aa592，大約 aa584至大約aa593， 大約 aa585至大約aa594，大約 aa586至大約aa595，大約 aa587至大約aa596，大約 aa588至大約aa597，大約 aa589至大約aa598，大約 aa590至大約aa599，大約aa591至大約aa600，大約 aa592至大約aa601，大約 aa593至大約aa602，大約 aa594至大約aa603，大約 aa595至大約aa604，大約 aa596至大約aa605，大約 aa597至大約aa606，大約 aa598至大約aa607，大約 aa599至大約aa608，大約 aa600至大約aa609，大約 aa601至大約aa610，大約 aa602至大約aa611，大約 aa603至大約aa612，大約 aa604至大約aa613，大約 aa605至大約aa614，大約 aa606至大約aa615，大約 aa607至大約aa616，大約 aa608至大約aa617，大約 aa609至大約aa618，大約 aa610至大約aa619，大約 aa611至大約aa620，大約 aa612至大約aa621，大約 aa613至大約aa622，大約 aa614至大約aa623，大約 aa615至大約aa624，大約 aa616至大約aa625，大約 aa617至大約aa626，大約 aa618至大約aa627，大約 aa619至大約aa628，大約 aa620至大約aa629，大約 aa621至大約aa630，大約 aa622至大約aa631，大約 aa623至大約aa632，大約 aa624至大約aa633，大約 aa625至大約aa634，大約 aa626至大約aa635，大約 aa627至大約aa636，大約 aa628至大約aa637，大約 aa629至大約aa638，大約 aa630至大約aa639，大約 aa631至大約aa640，大約 aa632至大約aa641，大約 aa633至大約aa642，大約 aa634至大約aa643，大約 aa635至大約aa644，大約 aa636至大約aa645，大約 aa637至大約aa646，大約 aa638至大約aa647，大約 aa639至大約aa648，大約 aa640至大約aa649，大約 aa641至大約aa650，大約 aa642至大約aa651，大約 aa643至大約aa652，大約 aa644至大約aa653，大約 aa645至大約aa654，大約 aa646至大約aa655，大約 aa647至大約aa656，大約 aa648至大約aa657，大約 aa649至大約aa658，大約 aa650至大約aa659，大約 aa651至大約aa660，大約 aa652至大約aa661，大約 aa653至大約aa662，大約 aa654至大約aa663，大約 aa655至大約aa664，大約 aa656至大約aa665，大約 aa657至大約aa666，大約 aa658至大約aa667，大約 aa659至大約aa668，大約 aa660至大約aa669，大約 aa661至大約aa670，大約 aa662至大約aa671，大約 aa663至大約aa642，大約 aa664至大約aa673，大約 aa665至大約aa674，大約 aa666至大約aa675，大約 aa667至大約aa676，大約 aa668至大約aa677，大約 aa669至大約aa678，大約 aa670至大約aa679，大約 aa671至大約aa680，大約 aa672至大約aa681，大約 aa673至大約aa682，大約 aa674至大約aa683，大約 aa675至大約aa684，大約 aa676至大約aa685，大約 aa677至大約aa686，大約 aa678至大約aa687，大約 aa679至大約aa688，大約 aa680至大約aa689，大約 aa681至大約aa690，大約 aa682至大約aa691，大約 aa683至大約aa692，大約 aa684至大約aa693，大約 aa685至大約aa694，大約 aa686至大約aa695，大約 aa687至大約aa696，大約 aa688至大約aa697，大約 aa689至大約aa698，大約 aa690至大約aa699，大約 aa691至大約aa700，大約 aa692至大約aa701，大約 aa693至大約aa702，大約 aa694至大約aa703，大約 aa695至大約aa704，大約 aa696至大約aa705，大約 aa697至大約aa706，大約 aa698至大約aa707，大約 aa699至大約aa708，大約 aa700至大約aa709，大約 aa701至大約aa710，大約 aa702至大約aa711，大約 aa703至大約aa712，大約 aa704至大約aa713，大約 aa705至大約aa714，大約 aa706至大約aa715，大約 aa707至大約aa716，大約 aa708至大約aa717，大約 aa709至大約aa718，大約 aa710至大約aa719，大約 aa711至大約aa720，大約 aa712至大約aa721，大約 aa713至大約aa722，大約 aa714至大約aa723，大約 aa715至大約aa724，大約 aa716至大約aa725，大約 aa717至大約aa726，大約 aa718至大約aa727，大約 aa719至大約aa728，大約 aa720至大約aa729，大約 aa721至大約aa730，大約 aa722至大約aa731，大約 aa723至大約aa732，大約 aa724至大約aa733，大約 aa725至大約aa734，大約 aa726至大約aa735，大約 aa727至大約aa736，大約 aa728至大約aa737，大約 aa729至大約aa738，大約 aa730至大約aa739，大約 aa731至大約aa740，大約 aa732至大約aa741，大約 aa733至大約aa742，大約 aa734至大約aa743，大約 aa735至大約aa744，大約 aa736至大約aa745，大約 aa737至大約aa746，大約 aa738至大約aa747，大約 aa739至大約aa748，大約 aa740至大約aa749，大約 aa741至大約aa750，大約 aa742至大約aa751，大約 aa743至大約aa752，大約 aa744至大約aa753，大約 aa745至大約aa754，大約 aa746至大約aa755，大約 aa747至大約aa756，大約 aa748至大約aa757，大約 aa749至大約aa758，大約 aa750至大約aa759，大約 aa751至大約aa760，大約 aa752至大約aa761，大約 aa753至大約aa762，大約 aa754
至大約aa763，大約 aa755至大約aa764，大約 aa756至大約aa765，大約 aa757至大約aa766，大約 aa758至大約aa767，大約 aa759至大約aa768，大約 aa760至大約aa769，大約 aa761至大約aa770，大約 aa762至大約aa771，大約 aa763至大約aa472，大約 aa764至大約aa773，大約 aa765至大約aa774，大約 aa766至大約aa775，大約 aa767至大約aa776，大約 aa768至大約aa777，大約 aa769至大約aa778，大約 aa770至大約aa779，大約 aa772至大約aa780，大約 aa772至大約aa781，大約 aa773至大約aa782，大約 aa774至大約aa783，大約 aa775至大約 aa784，大約 aa776至大約aa785，大約 aa777至大約aa786，大約 aa778至大約aa787，大約 aa779至大約aa788，大約 aa780至大約aa789，大約 aa781至大約aa790，大約 aa782至大約aa791，大約 aa783至大約aa792，大約 aa784至大約aa793，大約 aa785至大約aa794，大約 aa786至大約aa795，大約 aa787至大約aa796，大約 aa788至大約aa797，大約 aa789至大約aa798，大約 aa790至大約aa799，大約 aa791至大約aa800，大約 aa792至大約aa802，大約 aa793至大約aa802，大約 aa794至大約aa803，大約 aa795至大約aa804，大約 aa796至大約aa805，大約 aa797至大約aa806，大約 aa798至大約aa807，大約 aa799至大約aa808，大約 aa800至大約aa809，大約 aa801至大約aa810，大約 aa802至大約aa811，大約 aa803至大約aa812，大約aa804至大約aa813，大約 aa805至大約aa814，大約 aa806至大約aa815，大約 aa807至大約aa816，大約 aa808至大約aa817，大約 aa809至大約aa818，大約 aa810至大約aa819，大約 aa811至大約aa820，大約 aa612至大約aa821，大約 aa813至大約aa822，大約aa814至大約aa823，大約 aa815至大約aa824，大約 aa816至大約aa825，大約 aa817至大約aa826，大約 aa818至大約aa827，大約 aa819至大約aa828，大約 aa820至大約aa829，大約 aa821至大約aa830，大約 aa822至大約aa831，大約 aa823至大約aa832，大約 aa824至大約aa833，大約 aa825至大約aa834，大約 aa826至大約aa835，大約 aa827至大約aa836，大約 aa828至大約aa837，大約 aa829至大約aa838，大約 aa830至大約aa839，大約 aa831至大約aa840，大約 aa832至大約aa841，大約 aa833至大約aa842，大約 aa834至大約aa843，大約 aa835至大約aa844，大約 aa836至大約aa845，大約 aa837至大約aa846，大約 aa838至大約aa847，大約 aa839至大約aa848，大約 aa840至大約aa849，大約 aa841至大約aa850，大約 aa842至大約aa851，大約 aa843至大約aa852，大約 aa844至大約aa853，大約 aa845至大約aa854，大約 aa846至大約aa855，大約 aa847至大約aa856，大約 aa848至大約aa854，大約 aa849至大約aa858，大約 aa850至大約aa859，大約 aa851至大約aa860，大約 aa852至大約aa861，大約 aa853至大約aa862，大約 aa854至大約aa863，大約 aa855至大約aa864，大約 aa856至大約aa865，大約 aa857至大約aa866，大約 aa858至大約aa867，大約 aa859至大約aa868，大約 aa860至大約aa869，大約 aa861至大約aa870，大約 aa862至大約aa871，大約 aa863至大約aa872，大約 aa864至大約aa873，大約 aa865至大約aa874，大約 aa866至大約aa875，大約 aa867至大約aa876，大約 aa868至大約aa877，大約 aa869至大約aa878，大約 aa870至大約aa879，大約 aa871至大約aa880，大約 aa872至大約aa881，大約 aa873至大約aa882，大約 aa874至大約aa883，大約 aa875至大約aa884，大約 aa876至大約aa885，大約 aa877至大約aa886，大約 aa878至大約aa887，大約 aa879至大約aa888，大約 aa880至大約aa889，大約 aa881至大約aa890，大約 aa882至大約aa891，大約 aa883至大約aa892，大約 aa884至大約aa893，大約 aa885至大約aa894，大約 aa886至大約aa895，大約 aa887至大約aa896，大約 aa888至大約aa897，大約 aa889至大約aa898，大約 aa890至大約aa899，大約 aa891至大約aa900，大約 aa892至大約aa901，大約 aa893至大約aa902，大約 aa894至大約aa903，大約 aa895至大約aa904，大約 aa896至大約aa905，大約 aa897至大約aa906，大約 aa898至大約aa907，大約 aa899至大約aa908，大約 aa900至大約aa909，大約 aa901至大約aa910，大約 aa902至大約aa911，大約 aa903至大約aa912，大約 aa904至大約aa913，大約 aa905至大約aa914，大約 aa906至大約aa915，大約 aa907至大約aa916，大約 aa908至大約aa917，大約 aa909至大約aa916，大約 aa910至大約aa919，大約 aa911至大約aa920，大約 aa912至大約aa921，大約 aa913至大約aa922，大約 aa914至大約aa923，大約 aa915至大約aa924，大約 aa916至大約aa925，大約 aa917至大約aa926，大約 aa918至大約aa927，大約 aa919至大約aa928，大約 aa920至大約aa929，大約 aa921至大約aa930，大約 aa922至大約aa931，大約 aa923至大約aa932，大約 aa924至大約aa933，大約 aa925至大約aa934，大約 aa926至大約aa935，大約 aa927至大約aa936，大約 aa928至大約aa937，大約 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aa987至大約aa996，大約 aa988至大約aa997，大約 aa989至大約aa998，大約 aa990至大約aa999，大約 aa991至大約aa1000，大約aa992至大約aa1001，大約 aa998至大約 aa1002，大約 aa994至大約aa1003，大約 aa995至大約aa1004，大約 aa996至大約aa1005，大約 aa997至大約aa1006，大約 aa998至大約aa1007，大約 aa999至大約aa1008，大約 aa1000至大約aa1009，大約aa1001至大約aa1010，大約 aa1002至大約aa1011，大約 aa1003至大約aa1012，大約 aa1004至大約aa1013，大約 aa1005至大約aa1014，大約 aa1006至大約aa1015，大約 aa1007至大約 aa1016，大約 aa1008至大約aa1017，大約 aa1009至大約aa1018，大約aa1010至大約 aa1019，大約 aa1011至大約aa1020，大約 aa1012至大約aa1021，大約 aa1013至大約aa1022，大約 aa1014至大約aa1023，大約 aa1015至大約aa1024，大約 aa1016至大約 aa1025，大約 aa1017至大約aa1026，大約 aa1018至大約aa1027，大約aa1019至大約aa1028，大約 aa1020至大約aa1029，大約 aa1021至大約aa1030，大約 aa1022至大約aa1031，大約 aa1023至大約aa1032，大約 aa1024至大約aa1033，大約 aa1025至大約 aa1034，大約 aa1026至大約aa1035，大約 aa1027至大約aa1036，大約aa1028至大約aa1037，大約 aa1029至大約aa1038，大約 aa1030至大約aa1039，大約 aa1031至大約aa1040，大約 aa1032至大約aa1041，大約 aa1033至大約aa1042，大約 aa1034至大約 aa1043，大約 aa1035至大約aa1044，大約 aa1036至大約aa1045，大約aa1037至大約 aa1046，大約 aa1038至大約aa1047，大約 aa1039至大約aa1048，大約 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aa1092至大約aa1101，大約 aa1093至大約aa1102，大約 aa1094至大約aa1103，大約 aa1095至大約aa1104，大約 aa1096至大約aa1105，大約 aa1097至大約 aa1106，大約 aa1098至大約aa1107，大約 aa1099至大約aa1108，大約aa1100至大約aa1109，大約 aa1101至大約aa1110，大約 aa1102至大約aa1111，大約 aa1103至大約aa1112，大約 aa1104至大約aa1113，大約 aa1105至大約aa1114，大約 aa1106至大約 aa1115，大約 aa1107至大約aa1116，大約 aa1108至大約aa1117，大約aa1109至大約aa1118，大約 aa1110至大約aa1119，大約 aa1111至大約aa1120，大約 aa1112至大約aa1121，大約 aa1113至大約aa1122，大約 aa1114至大約aa1123，大約 aa1115至大約 aa1124，大約 aa1116至大約aa1125，大約 aa1117至大約aa1126，大約aa1118至大約aa1127，大約 aa1119至大約aa1128，大約 aa1120至大約aa1129，大約 aa1121至大約aa1130，大約 aa1122至大約aa1131，大約 aa1123至大約aa1132，大約 aa1124至大約 aa133，大約 aa1125至大約aa1134，大約 aa1126至大約aa1135，大約aa1127至大約aa1136，大約 aa1128至大約aa1137，大約 aa1129至大約aa1138，大約 aa1130至大約aa1139，大約 aa1131至大約aa1140，大約 aa1132至大約aa1141，大約 aa1133至大約 aa1142，大約 aa1134至大約aa1143，大約 aa1135至大約aa1144，大約aa1136至大約aa1145，大約 aa1137至大約aa1146，大約 aa1138至大約aa1147，大約 aa1139至大約aa1148，大約 aa1140至大約aa1149，大約 aa1141至大約aa1150，大約 aa1142至大約 aa1151，大約 aa1143至大約aa1152，大約 aa1144至大約aa1153，大約aa1145至大約aa1154，大約 aa1146至大約aa1155，大約 aa1147至大約aa1156，大約 aa1148至大約aa1157，大約 aa1149至大約aa1158，大約 aa1150至大約aa1159，大約 aa1151至大約aa1160，大約aa1152至大約aa1161，大約 aa1153至大約aa1162，大約aa1154至大約aa1163，大約 aa1155至大約aa1164，大約 aa1156至大約aa1165，大約 aa1157至大約aa1166，大約 aa1158至大約aa1167，大約 aa1159至大約aa1168，大約 aa1160至大約aa1169，大約 aa1161至大約aa1170，大約 aa1162至大約aa1171，大約aa1163至大約aa1172，大約 aa1164至大約aa1173，大約 aa1165至大約aa1174，大約 aa1166至大約aa1175，大約 aa1167至大約aa1176，大約 aa1168至大約aa1177，大約 aa1169至大約aa1178，大約 aa1170至大約aa1179，大約 aa1171至大約aa1180，大約aa1172至大約aa1181，大約 aa1173至大約aa1182，大約 aa1174至大約aa1183，大約 aa1175至大約aa1184，大約 aa1176至大約aa1185，大約 aa1177至大約aa1186，大約 aa1148至大約aa1187，大約 aa1179至大約aa1188，大約 aa1180至大約aa1189，大約aa1181至大約aa1190，大約 aa1182至大約aa1191，大約 aa1183至大約aa1192，大約 aa1184至大約aa1193，大約 aa1185至大約aa1194，大約 aa1186至大約aa1195，大約 aa1187至大約aa1196，大約 aa1188至大約aa1197，大約 aa1189至大約aa1198，大約aa1190至大約aa1199，大約 aa1191至大約aa1200，大約 aa1192至大約aa1201，大約 aa1193至大約aa1202，大約 aa1194至大約aa1203，大約 aa1195至大約aa1204，大約 aa1196至大約aa1205，大約 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aa1250至大約aa1259，大約 aa1251至大約aa1260，大約 aa1252至大約aa1261，大約aa1253至大約aa1262，大約 aa1254至大約aa1263，大約 aa1255至大約aa1264，大約 aa1256至大約aa1265，大約 aa1257至大約aa1266，大約 aa1258至大約aa1267，大約 aa1259至大約aa1268，大約 aa1260至大約aa1269，大約 aa1261至大約aa1270，大約aa1262至大約aa1271，大約 aa1263至大約aa1272，大約 aa1264至大約aa1273，大約 aa1265至大約aa1274，大約 aa1256至大約aa1245，大約 aa1267至大約aa1276，大約 aa1268至大約aa1277，大約 aa1269至大約aa1278，大約 aa1270至大約aa1279，大約aa1271至大約aa1280，大約 aa1272至大約aa1281，大約 aa1273至大約aa1282，大約 aa1274至大約aa1283，大約 aa1275至大約aa1284，大約 aa1276至大約aa1285，大約 aa1277至大約aa1286，大約 aa1278至大約aa1287，大約 aa1279至大約aa1288，大約aa1280至大約aa1289，大約 aa1281至大約aa1290，大約 aa1282至大約aa1291，大約 aa1283至大約aa1292，大約 aa1284至大約aa1293，大約 aa1285至大約aa1294，大約 aa1286至大約aa1295，大約 aa1287至大約aa1296，大約 aa1288至大約aa1297，大約aa1289至大約aa1298，大約 aa1290至大約aa1299，大約 aa1291至大約aa1300，大約 aa1292至大約aa1301，大約 aa1293至大約aa1302，大約 aa1294至大約aa1303，大約 aa1295至大約aa1304，大約 aa1296至大約aa1305，大約 aa1297至大約aa1306，大約aa1298至大約aa1307，大約 aa1299至大約aa1308，大約 aa1300至大約aa1309，大約 aa1301至大約aa1310，大約 aa1302至大約aa1311，大約 aa1303至大約aa1312，大約 aa1304至大約aa1313，大約 aa1305至大約aa1314，大約 aa1306至大約aa1315，大約aa1307至大約aa1316，大約 aa1308至大約aa1317，大約 aa1309至大約aa1318，大約 aa1310至大約aa1319，大約aa1311至大約aa1320，大約 aa1312至大約aa1321，大約 aa1313至大約aa1322，大約aa1314至大約aa1323，大約 aa1315至大約aa1324，大約aa1316至大約aa1325，大約 aa1317至大約aa1326，大約 aa1318至大約aa1327，大約 aa1319至大約aa1328，大約 aa1320至大約aa1329，大約aa1321至大約aa1330，大約 aa1322至大約aa1331，大約aa1323至大約aa1332，大約 aa1324至大約aa1333，大約aa1325至大約aa1334，大約 aa1326至大約aa1335，大約 aa1327至大約aa1336，大約 aa1328至大約aa1337，大約aa1329至大約aa1338，大約aa1330至大約aa1339，大約 aa1331至大約aa1340，大約 aa1332至大約aa1341，大約 aa1333至大約aa1342，大約aa1334至大約aa1343，大約 aa1335至大約aa1344，大約 aa1336至大約aa1345，大約 aa1337至大約aa1346，大約 aa1338至大約aa1347，大約 aa1339至大約aa1348，大約 aa1340至大約aa1349，大約 aa1341至大約aa1350，大約 aa1342至大約aa1351，大約aa1343至大約aa1352，大約 aa1344至大約aa1353，大約 aa1345至大約aa1354，大約 aa1346至大約aa1355，大約 aa1347至大約aa1356，大約 aa1348至大約aa1357，大約 aa1349至大約aa1358，大約 aa1350至大約aa1359，大約 aa1351至大約aa1360，大約aa1352至大約aa1361，大約 aa1353至大約aa1362，大約 aa1354至大約aa1363，大約 aa1355至大約aa1364，大約 aa1356至大約aa1365，大約 aa1357至大約aa1366，大約 aa1358至大約aa1367，大約 aa1359至大約aa1368，大約 aa1360至大約aa1369，大約aa1361至大約aa1370，大約 aa1362至大約aa1341，大約 aa1363至大約aa1372，大約 aa1364至大約aa1373，大約 aa1365至大約aa1374，大約 aa1366至大約aa1375，大約 aa1367至大約aa1376，大約 aa1368至大約aa1377，大約 aa1369至大約aa1378，大約aa1370至大約aa1379，大約 aa1371至大約aa1380，大約 aa1372至大約aa1381，大約 aa1343至大約aa1382， 大約 aa1374至大約aa1383，大約 aa1375至大約aa1384，大約 aa1376至大約aa1385，大約 aa1377至大約aa1386，大約 aa1378至大約aa1387，大約aa1379至大約aa1388，大約 aa1380至大約aa1389，大約 aa1381至大約aa1390，大約 aa1382至大約aa1391，大約 aa1383至大約aa1392，大約 aa1384至大約aa1393，大約 aa1385至大約aa1394，大約 aa1386至大約aa1395，大約 aa1387至大約aa1396，大約aa1388至大約aa1397，大約 aa1389至大約aa1398，大約 aa1390至大約aa1399，大約 aa1391至大約aa1400，大約 aa1392至大約aa1401，大約 aa1393至大約aa1402，大約 aa1394至大約aa1402，大約 aa1395至大約aa1404，大約 aa1396至大約aa1405，大約aa1397至大約aa1406，大約 aa1398至大約aa1407，大約 aa1399至大約aa1408，大約 aa1400至大約aa1409，大約 aa1401至大約aa1410，大約 aa1402至大約aa1411，大約 aa1403至大約aa1412，大約 aa1404至大約aa1413，大約 aa1405至大約aa1414，大約aa1406至大約aa1415，大約 aa1407至大約aa1416，大約 aa1408至大約aa1417，大約 aa1409至大約aa1418，大約 aa1410至大約aa1418，大約 aa1411至大約aa1420，大約 aa1412至大約aa1421，大約 aa1413至大約aa1422，大約 aa1414至大約aa1423，大約aa1415至大約aa1424，大約 aa1416至大約aa1425，大約 aa1417至大約aa1426，大約 aa1418至大約aa1427，大約 aa1419至大約aa1428，大約 aa1420至大約aa1429，大約 aa1421至大約aa1430，大約 aa1422至大約aa1431，大約 aa1423至大約aa1432，大約aa1424至大約aa1433，大約 aa1425至大約aa1434，大約 aa1426至大約aa1435，大約 aa1427至大約aa1436，大約 aa1428至大約aa1437，大約 aa1429至大約aa1438，大約 aa1430至大約aa1439，大約 aa1431至大約aa1440，大約 aa1432至大約aa1441，大約aa1433至大約aa1442，大約 aa1434至大約aa1443，大約 aa1435至大約aa1444，大約 aa1436至大約aa1445，大約 aa1437至大約aa1446，大約 aa1438至大約aa1447，大約 aa1439至大約aa1448，大約 aa1440至大約aa1449，大約 aa1441至大約aa1450，大約aa1442至大約aa1451，大約 aa1443至大約aa1452，大約 aa1444至大約aa1453，大約 aa1445至大約aa1454，大約 aa1446至大約aa1455，大約 aa1447至大約aa1456，大約 aa1446至大約aa1457，大約 aa1449至大約aa1458，大約 aa1450至大約aa1459，大約aa1451至大約aa1460，大約 aa1452至大約aa1461，大約 aa1453至大約aa1462，大約 aa1454至大約aa1463，大約 aa1455至大約aa1464，大約 aa1456至大約aa1465，大約 aa1457至大約aa1466，大約 aa1458至大約aa1467，大約 aa1459至大約aa1468，大約aa1460至大約aa1469，大約 aa1461至大約aa1470，大約 aa1462至大約aa1471，大約 aa1463至大約aa1472，大約 aa1464至大約aa1473，大約 aa1465至大約aa1474，大約 aa1466至大約aa1475，大約 aa1467至大約aa1476，大約 aa1468至大約aa1477，大約aa1469至大約aa1478，大約 aa1470至大約aa1479，大約 aa1471至大約aa1480，大約 aa1472至大約aa1481，大約 aa1473至大約aa1482，大約 aa1474至大約aa1483，大約 aa1475至大約aa1484，大約 aa1476至大約aa1485，大約 aa1477至大約aa1486，大約aa1478至大約aa1487，大約 aa1479至大約aa1488，大約 aa1480至大約aa1489，大約 aa1481至大約aa1490，大約 aa1482至大約aa1491，大約 aa1483至大約aa1492，大約 aa1484至大約aa1493，大約 aa1485至大約aa1494，大約 aa1486至大約aa1495，大約aa1497至大約aa1496，大約 aa1488至大約aa1497，大約 aa1489至大約aa1498，大約 aa1490至大約aa1499，大約 aa1491至大約aa1500，大約 aa1492至大約aa1501，大約 aa1493至大約aa1502，大約 aa1494至大約aa1503，大約 aa1495至大約aa1504，大約aa1496至大約aa1505，大約 aa1497至大約aa1506，大約 aa1498至大約aa1507，大約 aa1499至大約aa1508，大約 aa1500至大約aa1509，大約 aa1501至大約aa1510，大約 aa1502至大約aa1511，大約 aa1503至大約aa1512，大約 aa1504至大約aa1513，大約aa1505至大約aa1514，大約 aa1506至大約 aa1515，大約 aa1507至大約aa1516，大約 aa1508至大約aa1517，大約 aa1509至大約aa1518，大約 aa1510至大約aa1519，大約 aa1511至大約aa1520，大約 aa1512至大約aa1521，大約 aa1513至大約aa1522，大約aa1514至大約aa1523，大約 aa1515至大約 aa1524，大約 aa1516至大約aa1525，大約 aa1517至大約aa1526，大約 aa1518至大約aa1527，大約 aa1519至大約aa1528，大約 aa1520至大約aa1529，大約 aa1521至大約aa1530，大約 aa1522至大約aa1531，大約aa1523至大約aa1532，大約 aa1524至大約aa1523，大約 aa1525至大約aa1534，大約 aa1526至大約aa1535，大約 aa1527至大約aa1536，大約 aa1528至大約aa1537，大約 aa1529至大約aa1538，大約 aa1530至大約aa1539，大約 aa1531至大約aa1540，大約aa1532至大約aa1541，大約 aa1533至大約aa1542，大約 aa1534至大約aa1543，大約 aa1535至大約aa1544，大約 aa1536至大約aa1545，大約 aa1537至大約aa1546，大約 aa1538至大約aa1547，大約 aa1539至大約aa1548，大約 aa1540至大約aa1549，大約aa1541至大約aa1550，大約 aa1542至大約aa1551，大約 aa1543至大約aa1552，大約 aa1544至大約aa1553，大約 aa1545至大約aa1554，大約 aa1546至大約aa1555，大約 aa1547至大約aa1556，大約 aa1548至大約aa1557，大約 aa1549至大約aa1558，大約aa1550至大約aa1559，大約 aa1551至大約aa1560，大約 aa1552至大約aa1561，大約 aa1553至大約aa1562，大約 aa1554至大約aa1563，大約 aa1555至大約aa1564，大約 aa1556至大約aa1565，大約 aa1557至大約aa1566，大約 aa1558至大約aa1567，大約aa1559至大約aa1568，大約 aa1560至大約aa1569，大約 aa1561至大約aa1570，大約 aa1562至大約aa1571，大約 aa1563至大約aa1572，大約 aa1564至大約aa1573，大約 aa1565至大約aa1574，大約 aa1566至大約aa1575，大約 aa1567至大約aa1576，大約aa1568至大約aa1577，大約 aa1569至大約aa1578，大約 aa1570至大約aa1579，大約 aa1571至大約aa1580，大約 aa1572至大約aa1581，大約 aa1573至大約aa1582，大約 aa1574至大約aa1583，大約 aa1575至大約aa1584，大約 aa1576至大約aa1585，大約aa1577至大約aa1586，大約 aa1578至大約aa1587，大約 aa1579至大約aa1588，大約 aa1580至大約aa1589，大約 aa1581至大約aa1590，大約 aa1582至大約aa1591，大約 aa1583至大約aa1592，大約 aa1584至大約aa1593，大約 aa1585至大約aa1594，大約aa1586至大約aa1595，大約aa1587至大約aa1596，大約 aa1588至大約aa1597，大約 aa1589至大約aa1598，大約 aa1590至大約aa1599，大約 aa1591至大約aa1600，大約 aa1592至大約aa1601，大約 aa1593至大約aa1602，大約 aa1594至大約aa1603，大約aa1595至大約aa1604，大約 aa1596至大約aa1605，大約 aa1597至大約aa1606，大約 aa1598至大約aa1604，大約 aa1599至大約aa1608，大約 aa1600至大約aa1609，大約 aa1601至大約aa1610，大約 aa1602至大約aa1611，大約 aa1603至大約aa1612，大約aa1604至大約aa1613，大約 aa1605至大約aa1614，大約 aa1606至大約aa1615，大約 aa1607至大約aa1616，大約 aa1608至大約aa1617，大約 aa1609至大約aa1618，大約 aa1610至大約aa1619，大約 aa1611至大約aa1620，大約 aa1612至大約aa1621，大約aa1613至大約aa1622，大約 aa1614至大約aa1623，大約 aa1615至大約aa1624，大約 aa1616至大約aa1625，大約 aa1617至大約aa1626，大約 aa1618至大約aa1627，大約 aa1619至大約aa1628，大約 aa1620至大約aa1629，大約 aa1621至大約aa1630，大約aa1622至大約aa1632，大約 aa1623至大約aa1632，大約 aa1624至大約aa1633，大約 aa1625至大約aa1634，大約 aa1626至大約aa1635，大約 aa1627至大約aa1636，大約 aa1628至大約aa1637，大約 aa1629至大約aa1638，大約 aa1630至大約aa1639，大約aa1631至大約aa1640，大約 aa1632至大約aa1641，大約 aa1633至大約aa1642，大約 aa1634至大約aa1643，大約 aa1635至大約aa1644，大約 aa1636至大約aa1645，大約 aa1637至大約aa1646，大約 aa1638至大約aa1647，大約 aa1639至大約aa1648，大約aa1640至大約aa1649，大約 aa1641至大約aa1650，大約 aa1642至大約aa1651，大約 aa1643至大約aa1652，大約 aa1644至大約aa1653，大約 aa1645至大約aa1654，大約 aa1646至大約aa1655，大約 aa1647至大約aa1656，大約 aa1648至大約aa1657，大約aa1649至大約aa1658，大約 aa1650至大約aa1659，大約 aa1651至大約aa1660，大約 aa1652至大約aa1661，大約 aa1653至大約aa1662，大約 aa1654至大約aa1663，大約 aa1655至大約aa1664，大約 aa1656至大約aa1665，大約 aa1657至大約aa1666，大約aa1658至大約aa1667，大約 aa1659至大約 aa1668，大約 aa1660至大約aa1669，大約 aa1661至大約aa1670，大約 aa1662至大約aa1671，大約 aa1663至大約aa1672，大約 aa1664至大約aa1673，大約 aa1665至大約aa1674，大約 aa1666至大約aa1675，大約aa1667至大約aa1676，大約 aa1668至大約aa1677，大約 aa1669至大約aa1678，大約 aa1670至大約aa1679，大約 aa1671至大約aa1680，大約 aa1672至大約aa1681，大約 aa1673至大約aa1682，大約 aa1674至大約aa1683，大約 aa1675至大約aa1684，大約aa1676至大約aa1685，大約 aa1677至大約aa1686，大約 aa1678至大約aa1687，大約 aa1679至大約aa1688，大約 aa1680至大約aa1689，大約 aa1681至大約aa1690，大約 aa1682至大約aa1691，大約 aa1683至大約aa1692，大約 aa1684至大約aa1693，大約aa1685至大約aa1694，大約 aa1686至大約aa1695，大約 aa1687至大約aa1696，大約 aa1688至大約aa1697，大約 aa1689至大約aa1698，大約 aa1690至大約aa1699，大約 aa1691至大約aa1700，大約 aa1692至大約aa1701，大約 aa1693至大約aa1702，大約aa1694至大約aa1703，大約 aa1695至大約aa1704，大約 aa1696至大約aa1705，大約 aa1697至大約aa1706，大約 aa1698至大約aa1707，大約 aa1699至大約aa1708，大約 aa1700至大約aa1709，大約 aa1701至大約aa1710，大約 aa1702至大約aa1711，大約aa1703至大約aa1712，大約 aa1704至大約aa1713，大約 aa1705至大約aa1714，大約 aa1706至大約aa1715，大約 aa1707至大約aa1716，大約 aa1708至大約aa1717，大約 aa1709至大約aa1718，大約 aa1710至大約aa1719，大約 aa1711至大約aa1720，大約aa1712至大約aa1721，大約 aa1713至大約aa1722，大約 aa1714至大約aa1723，大約 aa1715至大約aa1724，大約 aa1716至大約aa1725，大約 aa1717至大約aa1726，大約 aa1718至大約aa1727，大約 aa1719至大約aa1728，大約 aa1720至大約aa1729，大約aa1721至大約aa1730，大約 aa1722至大約aa1731，大約 aa1723至大約aa1732，大約 aa1724至大約aa1733，大約 aa1725至大約aa1734，大約 aa1726至大約aa1735，大約 aa1727至大約aa1736，大約 aa1728至大約aa1737，大約 aa1729至大約aa1738，大約aa1730至大約aa1739，大約 aa1731至大約aa1740，大約 aa1732至大約aa1741，大約 aa1733至大約aa1742，大約 aa1734至大約aa1743，大約 aa1735至大約aa1744，大約 aa1736至大約aa1745，大約 aa1737至大約aa1746，大約 aa1738至大約aa1447，大約aa1739至大約aa1748，大約 aa1740至大約aa1749，大約 aa1741至大約aa1750，大約 aa1742至大約aa1751，大約 aa1743至大約aa1752，大約 aa1744至大約aa1753，大約 aa1745至大約aa1754，大約 aa1746至大約aa1755。
在另一個實施例中，圖2中所示的、可用于本發明組合物的肽的抗原性部分具有選自大約aax至大約aay的氨基酸序列，其中aax表示大約從SEQ ID NO:2的1號氨基酸至大約1750號氨基酸，aay是SEQID N0:2的約x+5號氨基酸，即一個選自含有如下氨基酸序列的氨基酸序列從SEQ ID NO:2的約aa1至約aa6，約aa2至約aa7，約aa3至約aa8，約aa4至約aa9，約aa5至約aa10，以及等等，直至約aa1749至約aa1754和約aa1750至約aa1755。
此外，本發明還包括在功能上與上面介紹的MMTV肽或由上文介紹的核酸分子編碼的MMTV肽等價的肽類似物，這種功能等價由多種標準進行判斷，包括但不限于，等價的肽被一種MMTV反應性抗體識別的能力。這種等價MMTV肽可在氨基酸序列中含有氨基酸殘基的刪除、添加或取代，但它們產生一種靜默改變，從而產生一種在功能上等價的MMTV肽。氨基酸取代可根據所涉及殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩親性本質來進行。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；負電荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。用于此處，“功能上等價”是指一種蛋白質能被MMTV肽反應性抗體識別。
雖然(使用本領域技術人員熟知的隨機誘變技術)可以對MMTV核苷酸序列進行隨機突變，并對所產生的MMTV編碼肽進行活性檢測，但可以用遺傳工程的方法對MMTV的編碼序列進行位點特異性誘變(使用本領域技術人員熟知的位點特異性誘變技術)，制備具有提高的功能的突變MMTV肽，例如產生提高的表達或抗原性。
用于本發明的免疫調節組合物的MMTV肽是基本上純的或均一的。當一種樣品顯示至少60至75％為單一一種肽序列時，該樣品被認為是基本上純的。一種基本上純的肽應優選含有60至90％的一種肽樣品，更優選約95％，最優選99％。本領域的技術人員熟知的方法可用于測定純度或均一性，例如樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，并接著在染色后的膠上觀察到一條單一肽條帶。此外，還可使用HPLC或本領域熟知的其他類似方法獲得解決方案。通常參見Sambrook等，1989，《分子克隆實驗手冊》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和Ausubel等(編輯)，1989，《當代分子生物學方法》Ⅰ卷，Green PublishingAssociates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,New York。
本發明包括MMTV肽在免疫調節組合物中的應用，MMTV肽通常純化自表達了編碼MMTV肽的重組核苷酸序列的宿主細胞。這種蛋白純化可通過本領域熟知的各種方法來完成。在一個實施方案中，本發明的MMTV肽以與谷胱甘肽-S-轉移酶融合的融合蛋白形式表達，所產生的重組融合蛋白通過親和層析進行純化，并且將MMTV肽結構域從異源半分子中切割下來，產生一種基本上純的MMTV肽樣品。其他方法也可以使用，例如參見《酶學方法》1990,Academic Press,Inc.,San Diego；《蛋白純化，原理和實踐》，1982,Springer-Verlag,New York中介紹的技術。
5.2．MMTV核酸本發明還包括編碼至少一種MMTV肽或其免疫原性或抗原性部分以及這種肽或部分的類似物的核酸分子，和具有一個代表至少一個MMTV的不連續表位的氨基酸分子的肽及其在本發明的免疫調節組合物中的應用。本發明的核酸分子包括如下(1)具有一個包含圖1(SEQ IDNO:1)中所示核苷酸序列或其至少18個連續核苷酸的部分的核苷酸序列的分子；(2)任何含有一個編碼能與抗MMTV肽抗體進行免疫反應的肽的核苷酸序列的核酸分子；(3)任何含有一個編碼如下一種肽的核苷酸序列的核酸分子，這種肽包含圖2-6(SEQ ID NO:2-6)中任何一個所示的氨基酸序列或其至少6個連續氨基酸的部分；(4)任何含有一個編碼至少一個MMTV的不連續表位的核苷酸序列的核酸分子；(5)任何含有如下一種核苷酸序列的核酸分子，這種核苷酸序列可與圖1(SEQ ID NO:1)中所示DNA序列的互補物在高度嚴謹條件下雜交，例如在0.5M NaHPO4,7％十二烷基磺酸鈉(SDS),1mM EDTA中在65℃與濾膜結合的DNA雜交，并在0.1×SSC/0.1％的SDS中在68℃進行洗滌(Ausubel等編輯，1989，《當代分子生物學方法》Ⅰ卷，Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&Sons，Inc.,New York，第2.10.3)，并編碼一種功能上等價的MMTV肽；(6)任何含有如下一種核苷酸序列的核酸分子，這種核苷酸序列可與圖1(SEQ ID NO:1)中所示DNA序列的組分在低一些的嚴謹條件下雜交，例如中等嚴謹條件下，如在0.2×SSC/0.1％的SDS中在42℃進行洗滌(Ausubel等，1989，上文)，并編碼一種功能上等價的MMTV肽；以及(7)任何含有如下一種核苷酸序列的核酸分子，這種核苷酸序列可與圖1(SEQ ID NO:1)中所示DNA序列的互補物在低嚴謹條件下雜交，例如在0.2×SSC/0.1％的SDS中在37℃進行洗滌，并編碼一種功能上等價的MMTV肽。
例如，可用于本發明的方法中的一種核酸分子具有這樣一種核苷酸序列，它含有一個選自圖1(SE ID NO:1)中所示的序列的大約ntx至大約nty的核苷酸序列，其中ntx表示從SEQ ID NO:1的大約1號核苷酸至大約8786號核苷酸，nty是SEQ ID NO:1的大約x+17號核苷酸；即這樣一種核苷酸，它選自含有SEQ ID NO:1的從大約nt1至大約nt20，大約nt2至大約nt21，大約nt3至大約nt22，大約nt4至大約nt23，大約nt5至大約nt24，等等，直至大約nt8785至大約nt8804以及大約nt8786至大約nt8805的核苷酸序列。
在另一個實施例中，可用于本發明的方法中的一種核酸分子具有這樣一種核苷酸序列，它含有一個選自圖1(SEQ ID NO:1)中所示的序列的大約ntx至大約nty的核苷酸序列，其中ntx表示從SEQ ID NO:1的大約1號核苷酸至大約8786號核苷酸，nty是SEQ ID NO:1的大約x+29號核苷酸；即這樣一種核苷酸，它選自含有SEQ ID NO:1的從大約nt1至大約nt30，大約nt2至大約nt31，大約nt3至大約nt32，大約nt4至大約nt33，大約nt5至大約nt34，等等，直至大約nt8775至大約nt8804以及大約nt8776至大約nt8805的核苷酸序列。
此外，本發明還包括這樣一種核酸分子，它編碼在功能上與這里介紹的MMTV肽等價的MMTV肽類似物，這種功能等價由多種標準進行判斷，包括但不限于，等價的肽被一種MMTV反應性抗體識別的能力。這種等價MMTV肽可在氨基酸序列中含有氨基酸殘基的刪除、添加或取代，但它們產生一種靜默改變，從而產生一種在功能上等價的MMTV肽。這種MMTV核酸的免疫等價類似物可通過如下方法進行鑒定(1)制備核酸分子的類似物，使之編碼在序列的5’和3’末端被剪切和/或具有一個或多個內部刪除的肽；(2)表達這種核苷酸序列類似物；并(3)確定所產生的表達肽是否能與一種MMTV反應性抗體進行免疫反應或是否能在體內誘導這種抗體的產生。
用于本發明的免疫調節組合物的核酸分子是基本上純的或均一的。當一種樣品顯示至少60至75％為單一一種核酸序列時，該核酸樣品被認為是基本上純的。一種基本上純的核酸應優選含有60至90％的一種核酸樣品，更優選約95％，最優選99％。本領域的技術人員熟知的方法可用于測定純度或均一性，例如樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，并接著在染色后的膠上觀察到一條單一核酸條帶。此外，還可使用HPLC或本領域熟知的其他類似方法獲得更高的分辨率。通常參見Sambrook等，1989，《分子克隆實驗手冊》，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，和Ausubel等(編輯)，1989，《當代分子生物學方法》Ⅰ卷，Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,New York。
本發明還包括(1)含有任何前述核酸分子與調節元件操縱連接的核酸表達載體，其中所說的調節元件指導核苷酸編碼序列的表達，和(2)經過遺傳工程構建的宿主細胞，這種細胞含有與調節元件操縱連接的任何前述編碼MMTV肽的核酸分子，其中所說的調節元件指導核苷酸編碼序列的表達。用于此處，調節元件包括但不限于誘導型或非誘導型啟動子、增強子、操縱子和其他本領域技術人員熟知的能驅動和調節表達的元件。更具體的討論，見下文的章節5.4和5.5。
MMTV肽或其部分或非連續表位可通過重組DNA技術使用本領域熟知的技術進行制備。因此，這里將討論通過表達含有MMTV核苷酸序列的核酸分子來制備本發明的肽的方法。本領域的技術人員熟知的方法可用來構建含有MMTV核苷酸序列和合適的轉錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括諸如體外重組DNA技術、合成技術和體內遺傳重組。見諸如Sambrook等，1989，《分子克隆實驗手冊》，Cold SpringHarbor Laboratory Press，和Ausubel等，1989，上文中介紹的技術。此外，能夠編碼一種MMTV肽的RNA或其一個部分可使用諸如合成儀進行化學合成。參見，諸如《寡核苷酸合成》，1984,Gait編輯，IRL Press,Oxford中介紹的技術，該文在此全文引入作為參考。
5.3．為免疫調節組合物選擇抗原本發明還通過測定候選MMTV抗原是否能與一種獲自接觸或感染了MMTV的個體或接觸了一種能與抗MMTV抗體如鼠中和性多克隆或單克隆抗體進行反應的化學或生物試劑的個體的抗體或免疫細胞發生反應，來提供選擇或鑒定能夠引發一種免疫應答的候選MMTV抗原的方法。所鑒定或選擇的抗原可用于本發明的免疫調節組合物。
在本發明的一個實施方案中，該方法是建立一個肽庫，這種肽庫含有所有可能的MMTV肽中含有的給定長度的肽。這個文庫將代表該肽的完全的肽掃描。然后該肽掃描文庫可用獲自諸如感染了MMTV的個體的血清或免疫細胞進行篩選，來確定哪些肽代表一種抗原性肽，并因而確定哪些肽可以包含在免疫調節組合物中，用來在個體中誘導一種免疫反應。例如血清可獲自感染了MMTV的小鼠。這樣一種完全的肽掃描已由Baughn等在1996，《感染與免疫》，64卷，2457-2466，關于Treponema pallidum的15kDa中介紹。合成重疊的十肽(10個氨基酸)，每種肽與后一種肽重疊9個氨基酸并后移1個氨基酸，這樣就合成了該蛋白的一套完全的十肽。然后用來自患梅毒的兔的血清在ELISA(酶聯免疫吸附試驗)中進行篩選，來發現那些能與抗梅毒抗體反應的肽。相似的方法可用于本發明，即使用人血清來篩選可用于本發明的組合物的MMTV抗原。
另一個方法涉及組合的噬菌體顯示文庫，包括隨機肽噬菌體顯示文庫，在這種文庫中編碼MMTV肽的核酸分子被插入到一個噬菌體顯示文庫中，表達，并用于一個篩選試驗，使用獲自感染了MMTV的個體或獲自接觸了能與MMTV抗體反應的生物或化學試劑的個體或具有MMTV反應性抗體的個體的免疫血清或免疫細胞進行篩選。例如，血清或免疫細胞可獲自感染了MMTV的小鼠。使用這種組合噬菌體顯示文庫，連續和不連續抗原表位都被篩選到。連續表位被定義為這樣一種表位，其中抗原性殘基位于一個短的氨基酸序列內，即相互連續。不連續表位由來自一級氨基酸序列的不同位置但在蛋白的三維結構中接近的氨基酸序列組成。不連續表位也被稱為構象肽，它可由含有編碼在三維結構中接近的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子編碼。
這種噬菌體肽庫通常以下面的方式構建。噬菌體由衣殼蛋白包圍的DNA組成，這種結構使噬菌體能夠感染細菌并復制其自身，產生大量的噬菌體拷貝。為利用這種特征，將編碼目標肽的DNA序列插入到編碼噬菌體衣殼蛋白的基因中。只要這些插入不干擾噬菌體的生命周期，這些修飾的噬菌體將具有顯示外源肽的衣殼蛋白。絲狀噬菌體是優選的載體，因為它們的兩種衣殼蛋白很容易修飾來在它們的表面顯示外源肽和外源表位。一般說來，這些修飾具有很好的耐受性。但是，即使修飾不被耐受，噬菌體仍能通過多種技術保持存活，這包括共感染一種野生型噬菌體，后者在本領域中被稱為輔助噬菌體。
絲狀類型的噬菌體如M13、fd和f2的兩種衣殼蛋白已知為pⅢ和pⅧ。在噬菌體衣殼中只有5個拷貝的pⅢ，而在衣殼中有大約2700個拷貝的pⅧ。但是，pⅢ通常能耐受高達幾百個氨基酸長度的大的插入，而pⅧ只能耐受5或6個氨基酸的插入。如同上文的介紹，其他的技術可用來保持在pⅧ蛋白中含有較大插入的噬菌體的存活。
在本發明的一個實施方案中，可以通過MMTV基因組的基本上消化即90％或更大程度的消化，來獲得多樣性的核酸片段，并將消化所獲得的片段插入到噬菌體中，構建一種連續的肽庫。然后表達這些核酸片段，并用獲自諸如感染了MMTV的個體或能與MMTV抗原進行免疫反應的個體的免疫血清或免疫細胞對噬菌體進行反應性篩選。純化可以與免疫血清或免疫細胞反應的噬菌體，并將MMTV核酸片段或編碼的肽包含在免疫組合物中，用于人體給藥。
在本發明的另一個實施方案中，可以通過MMTV基因組的基本上消化即90％以上程度的消化，來獲得多樣性的核酸片段，使片段連接，形成至少一個連接片段，并將消化所得的連接片段插入噬菌體，構建一種不連續的肽庫。然后表達連接的核酸片段。并用獲自諸如接觸或感染了MMTV的個體或能與MMTV抗原進行免疫反應的個體例如獲自感染了MMTV的小鼠的免疫血清或免疫細胞對噬菌體進行反應性篩選。純化可以與免疫血清或免疫細胞反應的噬菌體，并將含有不連續表位的核酸片段或編碼的肽包含在免疫組合物中，用于人體給藥。
在本發明的另一個實施方案中，獲自任何來源的隨機肽噬菌體顯示文庫可用于篩選MMTV表位。
5.4．表達系統本發明包括表達系統的使用，這包括真核和原核表達載體以及病毒表達載體，它們可用于表達全長和剪切部分的MMTV肽以及使用上文章節5.3中的方法鑒定的不連續表位。
在本發明的一個實施方案中，編碼一種MMTV肽的圖1的核苷酸序列或其一個部分在真核、原核或病毒表達載體中進行了表達。圖1-6中描述的核酸和氨基酸序列獲自GenBank，號碼為No.AF033807，并描述了MMTV的一個分離株的核苷酸和編碼氨基酸序列。可以想象，其他MMTV分離株的其他核苷酸和氨基酸序列也可用于本發明。在另一個實施方案中，用上文章節5.3中介紹的方法分離的一種核苷酸序列在真核、原核或病毒表達載體中進行了表達。
本發明的一個實施方案包括在一種桿狀病毒系統中表達MMTV肽。本發明的另一個實施方案包括在一種桿狀病毒系統中表達一種編碼不連續MMTV表位的核苷酸序列。本發明的另一個實施方案包括在一種哺乳動物細胞系統中表達一種編碼不連續MMTV表位的核苷酸序列。
多種宿主一表達載體系統可用來表達本發明的核苷酸序列。這種宿主一表達載體系統代表這樣一種載體，通過這種載體，可以制備和基本上純化目標核苷酸編碼序列，并且還代表這樣一種細胞，當這種細胞用合適的核苷酸編碼序列轉化或轉染時，可在細胞表面表達本發明的MMTV肽。它們包括但不限于微生物例如用含有MMTV核苷酸編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)、用含有MMTV肽編碼序列的重組酵母表達載體轉化的酵母(如酵母、畢赤酵母)、感染了含有MMTV核苷酸編碼序列的重組病毒表達載體(如桿狀病毒)的昆蟲細胞系統、感染了含有MMTV核苷酸編碼序列的重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒CaMV、煙草花葉病毒TMV)或轉化了重組質粒表達載體(如Ti質粒)的植物細胞系統、以及攜帶了含有處于來自哺乳動物細胞基因組(如金屬硫蛋白啟動子)或來自哺乳動物病毒(如腺病毒晚期啟動子、痘病毒7.5k啟動子)的啟動子控制之下的MMTV核苷酸編碼序列的重組表達結構物的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)。
在細菌系統中，可根據所要表達的MMTV核苷酸序列的使用目的，優先選擇多種表達載體。例如，在要制備大量的肽時，如制備藥物組合物用于產生針對肽的抗體時，或將肽包含在藥物組合物中時，能夠指導肽高水平表達并使之能很方便地純化的載體將是可取的。這種載體包括但不限于，大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther等，1983,EMBOJ.2卷，1791)，其中本發明的編碼核苷酸序列可分別連接到載體中，與lacZ編碼區處于同一閱讀框內，產生一種融合蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye,1985，《核酸研究》13卷，3101-3109；Van Heeke&Schuster,1989，《生物化學雜志》264卷，5503-5509)等等。pGEX載體也可用于以與谷胱甘肽S轉移酶(GST)的融合蛋白形式表達外源肽。一般來說，這種融合蛋白是可溶性的，能夠通過與谷胱甘肽-瓊脂珠吸附并接著用存在有游離谷胱甘肽的洗脫液進行洗脫，很方便地從裂解的細胞中純化。pGEX載體設計為包含有凝血酶或Ⅹa因子的蛋白酶切位點，從而使克隆的靶基因的產物可從GST半分子上釋放出來。
在昆蟲系統中苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)可用作載體來表達外源基因。該病毒生長于草地夜蛾細胞中。一種MMTV基因編碼序列如pol蛋白編碼序列可插入到該病毒的非必需區域(例如多角體基因)中，并置于一種AcNPV啟動子(例如多角體啟動子)的控制之下。成功地插入一種肽編碼序列將導致多角體基因失活，產生非封閉型的重組病毒(即缺少由多角體基因編碼的蛋白型衣殼的病毒)。然后將這些重組病毒用于感染用來表達插入基因的草地夜蛾細胞。(例如，參見Smith等，1983，《病毒學雜志》46卷，584頁；Smith等，美國專利No.4,215,051)。
在哺乳動物宿主細胞中，可以使用多種以病毒為基礎的表達系統。在一種腺病毒被用作表達載體的場合，一種目標MMTV核酸分子可連接至一種腺病毒轉錄/翻譯控制復合物，例如晚期啟動子和三聯前導序列。然后可將這種嵌合基因通過體外或體內重組插入到腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區域(例如區域E1或E3)的插入將導致這樣一種重組病毒，這種病毒能夠在感染的宿主細胞中存活，并能夠表達目標核酸分子編碼的肽。(例如，參見Logan&Shenk,1984，《美國科學院院刊》81卷，3655-3659)。特殊的起始信號對插入的編碼序列的有效翻譯來說也是必需的。這些信號包括ATG起始密碼子和其他相鄰的序列。在一個完整的基因，包括其自己的起始密碼子和相鄰序列被插入到合適的表達載體的場合，就不需要另外的翻譯控制信號。但是，在僅有編碼序列的一個部分被插入的場合，就需要提供外源的翻譯控制信號，這可能包括ATG起始密碼子。而且，起始密碼子必須與目標編碼序列處于同一閱讀框，來保證整個插入的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以有多種來源，天然和合成的都可以。表達的效率可通過包含合適的轉錄增強子元件、轉錄終止子等等來提高。(參見Bittner等，1987，《酶學方法》，153卷，516-544)。
其他的病毒表達系統也可用于本發明。這種系統包括但不限于，痘苗病毒、重組病毒或金絲雀痘病毒表達系統等等。
5.5細胞系本發明包括MMTV肽在動物和昆蟲細胞系中的表達。在本發明的一個實施方案中，env糖蛋白或其一個部分用一種桿狀病毒表達載體在一種昆蟲細胞系中進行了表達。在本發明的另一個實施方案中，gag蛋白或其一個部分在一種穩定轉染的哺乳動物細胞系中進行了表達。在另一個實施方案中，一種含有一個編碼MMTV的不連續表位的核苷酸序列的核酸分子在哺乳動物細胞系中進行了表達。
可以選擇能夠調節核酸編碼序列的表達或以所需的特殊方式修飾和加工表達肽的宿主細胞菌株。表達肽的這種修飾(如糖基化)和加工(如切割)對其功能如抗原性來說可能是重要的。不同的宿主細胞具有特征性的和特殊的機制來對表達肽進行翻譯后加工和修飾。可以選擇適當的細胞系或宿主系統來保證表達的肽的正確修飾。為這一目的，可以使用擁有能夠對表達肽進行原初轉錄本的正確加工、糖基化和磷酸化的細胞機制的真核宿主細胞。這種哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38細胞系。
對于重組蛋白的長期、高產量的制備來說，優選穩定表達。例如，可以通過遺傳工程構建能夠穩定地表達env糖蛋白或其一個部分的細胞系。除了使用含有病毒復制起始區域的表達載體，宿主細胞可用位于合適表達控制元件(如啟動子、增強子序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)和一種選擇標記控制之下的DNA進行轉化。在導入外源DNA后，可將工程細胞在一種加富培養基中生長1-2天，然后轉入一種選擇培養基。重組質粒中的選擇標記提供對選擇壓力的抗性，使細胞能將質粒穩定地整合到其染色體中，生長形成轉化灶，對后者可進行克隆，并形成細胞系。這種方法可優選用于能夠表達諸如MMTV env糖蛋白的工程細胞系。
可以使用多種選擇系統，包括但不限于，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等，1977，《細胞》11卷，223頁)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska&Szybalski,1962，《美國科學院院刊》48卷，2026頁)和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等，1980，《細胞》22卷，817頁)，這些基因可分別應用于tk-、hgprt-或arpt-細胞。對下列基因來說，抗代謝物抗性也可作選擇的基礎dhfr，它提供對氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，《美國科學院院刊》77卷，3567頁；O’Hare等，1981，《美國科學院院刊》78卷，1527頁)；gpt，它提供對霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981，《美國科學院院刊》78卷，2072頁)；neo，它提供對氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，《分子生物學雜志》150卷，1頁)；以及hygro，它提供對潮霉素的抗性(Santerre等，1984，《基因》30卷，147頁)。
此外，任何表達肽都可方便地使用一種針對該表達肽的抗體進行純化。例如Janknecht等介紹的一種系統可允許對人細胞系中表達的非變性融合蛋白方便地進行純化(Janknecht等，1991，《美國科學院院刊》88卷，8972-8976頁)。在該系統中，目標基因被亞克隆到一種痘苗重組質粒中，使該基因的開放閱讀框與一個由6個組氨酸殘基組成的氨基末端標記在翻譯時融合。將來自感染了重組痘苗病毒的細胞的抽提物上樣到Ni2+氮川乙酸一瓊脂糖柱，用含有咪唑的緩沖液選擇性地洗脫表達的組氨酸標記的肽。
5.6免疫調節組合物和給藥方法本發明的免疫調節組合物包括一種有效劑量的免疫原性活性成分即一種或多種MMTV抗原和一種可藥用的載劑，其中活性成分能夠有效地在受體中產生一種可測量的針對抗原的免疫應答。
含有一種免疫原性肽或一種編碼這種肽的核酸分子作為活性成分的免疫調節組合物的制備，對本領域的技術人員來說是熟知的。
5.6.1免疫調節組合物效果的測定MMTV抗原的免疫能力可通過在用MMTV抗原免疫后在試驗動物中監測免疫應答或通過使用本領域任何已知的免疫試驗來測定。體液(抗體)應答和/或細胞介導的免疫可用作免疫應答的指征。試驗動物可包括小鼠、倉鼠、犬、貓、猴、兔、猩猩等以及人。
導入免疫調節組合物的方法可包括口、腦內、皮內、肌肉、腹膜內、靜脈、皮下、鼻內或任何其他標準的免疫途徑。試驗受體的免疫應答可通過多種方法如所產生的免疫血清與MMTV抗原的反應性，用已知的的技術如免疫吸附試驗(ELISA)、免疫印跡、放射免疫沉淀等，進行分析，或者在MMTV抗原顯示抗原性或免疫原性的場合，通過為免疫動物提供對MMTV感染的保護，或在免疫宿主中減輕因感染MMTV而產生的癥狀，或減輕因接觸一種能與抗MMTV抗原的抗體發生反應的化學或生物試劑而產生的癥狀，來進行分析。
作為MMTV免疫組合物的合適動物試驗的一個例子，本發明的一種組合物可在小鼠中試驗其誘導一種對MMTV抗原應答的抗體的能力。可以使用BALB/c小鼠。每個試驗組接受一個固定濃度的組合物。對照組接受一個緩沖液注射，如注射不含MMTV抗原的1mM Tris-HCl pH9.0。
從小鼠中每1或2周抽取血樣，分析血清中的抗MMTV抗原的抗體。可以使用諸如ELISA分析針對抗原的抗體的存在。
5.6.2免疫組合物這種組合物的合適配方包括可注射的液體溶液或懸浮液，也可制備在注射前溶于或懸浮于液體的固體形式。為用于這樣一種配方，組合物也可以是乳化的，或者MMTV抗原可以包裹在脂質體中或與多糖和/或其他聚合物接合。活性的免疫原性成分通常與可藥用的并與活性成分相匹配的賦形劑混合。合適的賦形劑為諸如鹽水、葡聚糖、甘油、乙醇等以及它們的組合物。此外，在需要時，組合物也可包括少量的輔助物質如濕潤或乳化試劑、pH緩沖液試劑、和/或能增強組合物的效果的佐劑。
可能有效的佐劑的例子包括但不限于，礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、油乳化物、明磯、MDP、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酰-2-(1’-2’-二棕櫚基-sn-甘油酰-3-羥基磷酰氧)-乙胺。一種佐劑的有效性可通過測定在存在或不存在各種佐劑的情況下測量針對含有MMTV抗原的組合物的抗體的誘導來確定。
MMTV抗原可配制成中性或鹽形式的組合物。可藥用的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基基團形成)和與無機酸如鹽酸、磷酸或與有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等形成的鹽。與游離羧基基團形成的鹽也可從無機堿如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物以及有機堿如異丙胺、三甲基胺、2-乙胺乙醇、組氨酸、普魯卡因等衍生。
本發明的組合物可以是多價的或單價的。多價組合物可以從指導一種以上抗原表達的重組病毒制備。
多種方法可用來導入本發明的免疫調節組合物。這些包括但不限于口、皮內、肌肉、腹膜內、靜脈、皮下、鼻途徑以及通過劃痕(擦破皮膚的表層，例如使用一種分支的針)。口服組合物可包括標準的載劑如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。含有本發明的核酸的組合物可通過任何本領域已知的用于將一種核酸傳遞給一種受體的方法進行給藥，例如按照這里的介紹。
被給藥本發明的一種免疫調節組合物的患者是一種哺乳動物，優選是人，但也可以是一種非人類的動物，包括但不限于奶牛、馬、羊、豬、家禽(如雞)、山羊、貓、犬、倉鼠、小鼠和大鼠。患者最優選是一個沒有接觸過MMTV的人或一個對MMTV抗原沒有免疫反應的人。
一般來說，各成分以單位劑量形式單獨或混合在一起提供，例如以標明了活性成分數量的密封容器如安瓶或小袋中的凍干粉末或無水濃縮物的形式進行提供。當組合物通過注射給藥時，可以提供一安瓶的無菌稀釋劑，使成分在給藥前可以混合。
在一個特殊實施方案中，本發明的一種凍干MMTV抗原在第一個容器中提供，第二個容器含有溶劑，溶劑由50％甘油、0.25％酚和一種抗菌劑(例如0.005％的亮綠)的水溶液組成。
一種免疫調節組合物使用的準確劑量也可根據給藥途徑、患者的體質來決定，并可按照醫師的判斷和每個患者的狀況按照標準的臨床技術來決定。一種有效的免疫劑量是足以在給藥了組合物的宿主中產生一種針對該抗原的免疫應答的數量。
將純化的抗原用作免疫調節組合物可通過標準的方法進行。例如，純化的肽應被調整為一個合適的濃度，用任何合適的佐劑進行配制，包裝待用。當MMTV抗原是一種半抗原時，半抗原是一種具有抗原性的分子，它能選擇性地與相關抗體發生反應，但沒有免疫原性，它不能引發一種免疫應答。半抗原可共價結合于一種載體或免疫原性分子，例如一種大的蛋白如血清白蛋白可為與之偶聯的半抗原提供免疫原性。半抗原-載體可配制來用作一種免疫調節組合物。
本發明的組合物在人體中的有效劑量也可從動物模型試驗系統獲得的劑量應答曲線推知。
5.6.3本發明的組合物產生的抗體的應用通過給藥本發明的MMTV抗原產生的針對該抗原的抗體也可用于診斷免疫試驗、被動免疫治療和產生抗獨特型抗體。
所產生的抗體可用本領域熟知的標準技術進行分離(例如免疫吸附層析、離心、沉淀等等)，并用于診斷免疫試驗。抗體也可用來監測治療和/或疾病過程。本領域熟知的任何免疫試驗系統，例如下文所列出的，都可用于這一目的，它們包括但不限于，使用技術如放射免疫、ELISA(酶聯免疫吸附試驗)、“夾心”免疫試驗、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散試驗、凝集試驗、補體固定試驗、免疫放射分析試驗、熒光免疫試驗、蛋白A免疫試驗和免疫電泳試驗的競爭性和非競爭性試驗系統，僅舉出一小部分。
本發明的免疫調節組合物也可用來制備抗體，用于被動免疫治療，在這種治療過程中，通過給藥預先形成的針對MMTV抗原的抗體，宿主獲得短期的保護。
用本發明的免疫調節組合物制備的抗體也可用于產生抗獨特型抗體。然后抗獨特型抗體又可用來進行免疫，來產生一個能結合最初的病原微生物抗原或試劑的抗體亞群(Jerne,1974，《免疫學年鑒》(Paris)125c,373頁；Jerne等，1982,EMBO J,1卷，234頁)。
5.6.4包裝在需要時，組合物可存在于一個包裝或分配裝置中，后者包括一個或多個含有活性成分的單位劑量形式。例如包裝可包括金屬或塑料薄片，例如一種blister包裝。包裝或分配裝置可伴隨有給藥指示。與這種包裝或分配裝置相關的是管理制造者的政府機構簽發的關于藥物或生物制品的使用或銷售的注意事項，該注意事項反映制造管理部門同意人體給藥的使用或銷售。含有配制在一種匹配的藥用載劑中的本發明的一種抗原的組合物也可在一個合適的容器中制備、放置，并標明用于治療適應癥。
本發明并不限于這里介紹的特殊實施方案的范圍。事實上，對本領域的技術人員來說，根據前面的介紹，除了這里介紹的修改，本發明的各種修改都是顯而易見的。這種修飾也在后面所附的權利要求的范圍內。
這里引用了各種參考文獻，它們的內容在此全文引如作為參考。序列表(1)一般信息(ⅰ)發明人Stewart,T.
Gershoni,J.(ⅱ)發明名稱MMTV抗原的免疫調節組合物及其使用方法(ⅲ)序列數6(ⅳ)聯系地址(A)聯系人Pennie&Edmonds LLP(B)街道1155 Avenue of Americas(C)城市New York(D)州New York(E)國家USA(F)ZIP:10036(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型磁盤(B)計算機IBM兼容(C)操作系統DOS(D)軟件FastSEQ Version2.0(ⅵ)現申請日期(A)申請號(B)提交日期(C)分類(ⅶ)律師/代理人信息(A)姓名Gordon,Jennifer(B)登記號30,753(C)參考/登記號9345-004(ⅸ)電信信息(A)電話212-790-9090(B)傳真212-869-9741(C)電傳66141 PENNIE(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8805堿基對(B)類型核酸(C)線型單鏈(D)拓撲構型線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GCAACAGTCC TAACATTCAC CTCTCGTGTG TTTGTGTCTG TTCGCCATCC CGTCTCCGCT 60CGTCACTTAT CCTTCACTTT CCAGAGGGTC CCCCCGCAGA CCCCGGTGAC CCTCAGGTCG 120GCCGACTGCG GCAGCTGGCG CCCGAACAGG GACCCTCGGA TAAGTGACCC TTGTCTCTAT 180TTCTACTATT TTGTGTTCGT CTTGTTTTGT CTCTATCTTA TCTGGCTATT ATCACAAGAG 240CGGAACGGAC TCACCACAGG GAACTGCAGT CTCGCCTACA GAGAAGAGGT AGGTTACGGT 300GAGCCATTGG AAATGGGGGT CTCGGGATCA AAAGGGCAGA AACTCTTTGT TTCTGTTCTA 360CAAAGACTCC TCTCAGAGAG GGGTCTTCAT GTGAAAGAGA GCAGTGCAAT AGAGTTTTAT 420CAGTTCCTAA TAAAGGTCTC TCCTTGGTTT CCCGAAGAAG GAGGATTAAA TTTACAAGAT 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Ile Asn Trp Ile Arg Pro Phe Leu Lys Leu Thr Thr Gly Glu112511301135Leu Lys Pro Leu Phe Glu Ile Leu Asn Gly Asp Ser Asn Pro Ile Ser114011451150Thr Arg Lys Leu Thr Pro Glu Ala Cys Lys Ala Leu Gln Leu Met Asn11551160 1165Glu Arg Leu Ser Thr Ala Arg Val Lys Arg Leu Asp Leu Ser Gln Pro117011751180Trp Ser Leu Cys Ile Leu Lys Thr Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Cys Leu1185 119011951200Trp Gln Asp Giy Val Val Glu Trp Ile His Leu Pro His Ile Ser Pro120512101215Lys Val Ile Thr Pro Tyr Asp Ile Phe Cys Thr Gln Leu Ile Ile Lys122012251230Gly Arg His Arg Ser Lys Glu Leu Phe Ser Lys Asp Pro Asp Tyr Ile123512401245Val Val Pro Tyr Thr Lys Val Gln Phe Asp Leu Leu Leu Gln Glu Lys125012551260Glu Asp Trp Pro Ile Ser Leu Leu Gly Phe Leu Gly Glu Val His Phe1265 127012751280His Leu Pro Lys Asp Pro Leu Leu Thr Phe Thr Leu Gln Thr Ala Ile128512901295Ile Phe Pro His Met Thr Ser Thr Thr Pro Leu Glu Lys Gly Ile Val130013051310Ile Phe Thr Asp Gly Ser Ala Asn Gly Arg Ser Val Thr Tyr Ile Gin131513201325Gly Arg Glu Pro Ile 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權利要求
1．在人受體中誘導針對MMTV的免疫應答的方法，包括對受體給藥一種免疫調節組合物，該組合物含有一種藥用載劑和至少一種MMTV抗原，其中抗原的數量足以引起MMTV特異的細胞或體液應答提高。
2．權利要求1的方法，其中抗原是MMTV env肽或其一個部分。
3．權利要求2的方法，其中所說的部分包含MMTV env肽的至少6個連續氨基酸。
4．權利要求1的方法，其中抗原是MMTV核心肽或其一個部分。
5．權利要求4的方法，其中所說的部分包含MMTV核心肽的至少6個連續氨基酸。
6．權利要求1的方法，其中抗原是MMTV pol肽或其一個部分。
7．權利要求6的方法，其中所說的部分包含MMTV pol肽的至少6個連續氨基酸。
8．權利要求1的方法，其中抗原是一種核酸分子，該核酸分子編碼至少一種MMTV抗原。
9．權利要求8的方法，其中核酸分子編碼MMTV env肽或其一個部分。
10．權利要求9的方法，其中所說的部分編碼MMTV env肽的至少6個連續氨基酸。
11．權利要求8的方法，其中核酸分子編碼MMTV核心肽或其一個部分。
12．權利要求11的方法，其中所說的部分編碼MMTV核心肽的至少6個連續氨基酸。
13．權利要求8的方法，其中核酸分子編碼MMTV pol肽或其一個部分。
14．權利要求13的方法，其中所說的部分編碼MMTV pol肽的至少6個連續氨基酸。
15．權利要求8的方法，其中核酸編碼MMTV的一個不連續表位。
16．權利要求1的方法，其中人受體在給藥該免疫調節組合物前沒有接觸或感染過MMTV。
17．權利要求1的方法，其中人受體在給藥該免疫調節組合物前對MMTV抗原沒有免疫反應性。
18．權利要求1的方法，其中免疫調節組合物通過選自口、鼻內途徑、皮下途徑、靜脈途徑、腹膜內途徑和皮下途徑的途徑進行給藥。
19．使用一種方法制備的MMTV的不連續表位，該方法包括(a)基本上消化MMTV的基因組，產生多樣性的MMTV核酸片段；(b)將片段連接，產生至少一種連接的核酸片段，后者至少編碼一種肽；(c)在一種表達系統中表達該連接片段，使編碼的肽表達；(d)用血清對表達的肽進行篩選，其中血清含有能與至少一種MMTV抗原反應的抗體或免疫細胞；和(e)將與抗體或免疫細胞反應陽性的表達肽純化。
20．在人受體中誘導針對MMTV的免疫應答的方法，包括將一種免疫調節組合物給藥于該受體，其中該組合物包含一種可藥用載劑和一種MMTV的不連續表位，其中該不連續表位通過下面的方法制備，包括(a)基本上消化MMTV的基因組，產生多樣性的MMTV核酸片段；(b)將片段連接，產生至少一種連接的核酸片段，后者至少編碼一種肽；(c)在一種表達系統中表達該連接片段，使編碼的肽表達；(d)用血清對表達的肽進行篩選，其中血清含有能與至少一種MMTV抗原反應的抗體或免疫細胞；和(e)將與抗體或免疫細胞反應陽性的表達肽純化，使其數量足以引發MMTV特異的細胞或體液應答的增加。
全文摘要
本發明涉及在人體中誘導針對MMTV抗原的免疫應答的方法,用來在人體中治療或預防因感染MMTV或接觸能與抗MMTV抗原的抗體發生反應的生物或化學試劑而引起的疾病或紊亂。
文檔編號A61K48/00GK1305384SQ99807144
公開日2001年7月25日 申請日期1999年4月8日 優先權日1998年4月8日
發明者T·H·M·斯圖爾特, J·格爾肖尼 申請人:國際生物免疫系統公司