專利名稱：海蓬子提取物抑制酪氨酸酶活性的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及海蓬子提取物在抑制酪氨酸酶活性中的應用。
背景技術：
由于酪氨酸酶是合成黑色素的關鍵，因此目前的大多數皮膚美白產品都是在化妝 品中添加了酪氨酸酶抑制劑，通過破壞酪氨酸酶活性，從而達到減少皮膚中黑色素的目的。對苯二酚因為價格便宜，效果好，曾是最廣泛使用的美白劑之一。對苯二酚和維甲 酸的混合配方，對消除紫外線和激素導致的黑色素沉積頗為有效。不過后來有研究表明，對 苯二酚會誘發白血病。自從2001年起，歐洲已經禁止在美白化妝品中添加對苯二酚。曲酸、壬二酸、乙二醇酸、煙酰胺、熊果素等化學物都可以抑制酪氨酸酶，也被用于 美白化妝品中。有些酪氨酸酶抑制劑發揮作用時，需要借助汞(即水銀)做催化劑，因此有 些美白化妝品中還含有一定量的汞。化妝品公司不僅推出各種“純天然”新產品，還不斷嘗 試一些“高新”技術。比如2007年，法國某公司研制出一種含有反義寡聚核苷酸的美白產 品。反義寡聚核苷酸可以特異性抑制靶基因表達，近年來多用于基因治療。該公司研究人 員發表的論文稱，將反義寡聚核苷酸的美白產品外敷在皮膚上，可以抑制皮膚細胞中酪氨 酸酶基因的表達，美白效果達到30%多。不過，反義寡聚核苷酸一般不容易進入細胞，在基 因治療中，需要注射進入人體。所以，這種外敷的“基因治療”法，其真實效果不免令人懷疑。美白產品除了外敷的化妝品，還有內服的藥劑，目前比較常見的是一種叫做谷胱 甘肽的有機物，在體內與銅離子結合后，可以抑制酪氨酸酶活性。隨著酪氨酸酶抑制劑在美白型化妝品中的不斷開發及應用，以及“純天然化妝品” 回歸主流的趨勢下，天然產物酪氨酸酶抑制劑的開發研究越來越得到重視。酪氨酸合成酶 抑制劑在醫藥領域用于治療和預防黑色素瘤、黃褐斑等色素沉著性疾病，在化妝品領域用 于人體肌膚的美白，在食品工業領域用于預防果蔬因褐變而失鮮變質，在農業領域因酪氨 酸合成酶是昆蟲賴以生存的關鍵酶而成為最有前景的生物殺蟲藥劑之一，因而酪氨酸合成 酶抑制劑的開發有著廣闊的應用前景。海蓬子為黎科莖肉質化真鹽生植物，利用海水灌溉，基本無需噴灑農藥，種植管理 簡單、不生病蟲害。海蓬子營養價值極高，是上佳的無公害綠色保健食品。除作為蔬菜之外 還具有藥用、保健及制造建材等價值。現代研究證明海蓬子中含有黃酮類物質，黃酮類化 合物具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗衰老、減少自由基的產生和清除自由基的作用。這 與抑制酪氨酸合成酶活性有一定的聯系。海蓬子(SH)被一些居住在沿海地區的人用作民 間醫藥蔬菜。以往的研究表明，植物可刺激細胞因子和一氧化氮釋放，并表現出免疫調節 作用。另據報道，在小鼠電感試驗中，海蓬子具有預防高脂飲食引起的高血糖和高血脂癥 作用。在海蓬子所有藥理作用研究中，抗氧化作用是研究最廣泛的。例如，通過用海蓬子提 取物分解新的綠原酸的反應中可以發現海蓬子具有強大的抗氧化活性，并能有效保護質粒 DNA。同時海蓬子的某種酶的誘導抗氧化和抗凝作用也被廣泛研究。在一個卵巢切除誘導 的氧化應激模型中，海蓬子提取物能夠抑制肝臟炎癥和肝硬化。近來，具有皮膚再生作用的海蓬子提取物的飲料和綠色食品已經制定，然而海蓬子對皮膚的藥理作用尚未調查。黑色素起著保護皮膚免受太陽輻射的紫外線對人體皮膚的有害影響，并具有清除 有毒藥物和化學品的重要作用。黑色素生物合成的前兩個步驟是L_酪氨酸的羥基轉化為 3，4-二羥基-苯丙氨酸(L-多巴)和L-多巴氧化成ο-多巴醌。這種ο-苯醌是非常被動 的，自發形成黑色素沉著，造成了嚴重的人類審美的問題。多功能的酪氨酸酶是含有銅元素 的活性酶，分子量在60-70KDa之間。抑制L-酪氨酸的羥基轉化成L-多巴，并抑制L-多巴 氧化成ο-多巴醌，并作為已知合成的關鍵酶。據報道稱抗氧化劑通過氧化酪氨酸酶來抑制 其活性，抑制化學反應產生黑色素，它們改變了形成黑色素的結構，并展現出美白的效果。 研究表明由于海蓬子的抗氧化活性物質在其組織中，研究其提取物的潛能，可用來作為皮 膚的抗氧化劑和美白劑。因為，肌膚的美白主要是受黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響。
發明內容
本發明的目的揭示海蓬子提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用，為預防和治療色 素沉著疾病提供實驗依據。本發明的技術方案分別制備海蓬子水提物、海蓬子醇提物、海蓬子超聲波水提 物、海蓬子超聲波醇提物，分別經蒸餾濃縮和旋轉蒸發儀蒸發濃縮得到濃縮物，對酪氨酸合 成酶合成活性的抑制作用進行了研究。為化妝品行業提供新的天然酪氨酸合成酶抑制劑。本發明的有益效果當今研究和開發利用生長于廣袤海岸荒漠和海灘上的鹽生植 物，已成為當今世界農業的重大課題，在鹽堿地上耕作是一種新的思維方式。因為海蓬子生 長在不毛之地的鹽堿地上，土地費用比較低。另外，它無蟲害，不需要用農藥，也不需要鋤 草，海蓬子種植管理費用不高。因而海蓬子提取物可以作為天然美白活性物質應用于美白 護膚品和功能食品，也可以作為預防和治療黑色素瘤等色斑疾病的藥物進行開發。為化妝 品行業提供了新的廉價的天然美白素材。
圖1實施例1中各種提取物對酪氨酸酶活性的抑制效果圖。圖2實施例2中不同濃縮方式對酪氨酸酶活性的抑制效果。圖3實施例3中乙醇的配伍作用對海蓬子提取物抑制酪氨酸酶活性的效果。圖4實施例4中對出芽短梗霉細胞酪氨酸酶活性的抑制率分析。圖5實施例5中對出芽短梗霉細胞黑色素合成抑制的培養效果圖。圖6實施例5中對出芽短梗霉細胞黑色素合成的影響。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明，但實施例不限制本發明的保護范圍。實施例1各種提取物對酪氨酸酶活性的抑制效果分析海蓬子水(醇)提物的制備 取研磨好的海蓬子粉末3g加入60mL蒸餾水(或60mL體積分數為60 %乙醇)浸 泡24h，回流提取Ih0
海蓬子超聲波水(醇)提物的制備取研磨好的海蓬子粉末3g加入60mL蒸餾水(或60mL體積分數為60 %乙醇)浸 泡半小時，煮沸30min，冷卻至室溫，用超聲波(59kHz，500W，65°C )提取lh。酪氨酸合成酶活性抑制率的測定取上述海蓬子提取液2mL，加pH 6. 8的磷酸鹽緩沖液ImL與2. Ommol/L的酪氨酸 溶液2mL，待混合均勻后在冰浴中迅速加入酪氨酸合成酶溶液lmL，混勻，37°C溫育lOmin， 于412nm處測定吸光度。酪氨酸合成酶抑制率(1% )計算公式為I%= [(A-B)-(C-D)]/[A-B] X 100A 未加提取物樣品的加酶混合液所測的吸光度；B 未加提取物樣品亦未加酶的混合液所測的吸光度；C 加提取物樣品和酶的混合液所測的吸光度；D 加提取物樣品而未加酶的混合液所測的吸光度通過圖1可以清晰地看到，由于乙醇的配伍作用，醇提物比水提物對酪氨酸合成 酶的抑制效果更顯著；因為超聲波破碎細胞的空化作用和強化傳質的機械作用，從而更有 利于海蓮子活性物的釋出，表現為超聲波的醇提物比超聲波的水提物具有更強的抑制作 用。故最適宜選取超聲波醇提方案來提取海蓬子中酪氨酸合成酶的抑制劑。實施例2不同濃縮方式對酪氨酸酶活性的抑制效果分析用蒸餾法濃縮提取液置于6000r/min離心4min，得上清液，置于沸水鍋里，直至試管內的液體揮 發至大概5mL。用旋轉蒸發法濃縮提取液置于旋轉蒸發儀以60°C濃縮蒸發lh，混合液于6000r/min離心4min，得上清液。由圖2可以看出，蒸發濃縮和旋轉蒸發儀濃縮提取物這兩種不同濃縮條件，對酪 氨酸合成酶活性的抑制率影響不是很大。說明海蓬子提取物中抑制酪氨酸合成酶活性的成 分受溫度的影響不顯著。實施例3乙醇的配伍作用對海蓬子提取物抑制酪氨酸酶活性的效果分析從圖3可知，用水回流濃縮后的海蓬子醇提取物對酪氨酸合成酶有明顯抑制效 果，與未加提取液相比，酶促反應時間曲線下移；至于海蓬子醇提取物的酶促反應時間曲線 繼續下移，說明由于乙醇的配伍作用，海蓬子醇提取物對酪氨酸合成酶的抑制效果更加顯 著。總之，兩種方式處理的海蓬子醇提取物對酪氨酸合成酶都有明顯的抑制效果。實施例4對出芽短梗霉細胞酪氨酸酶活性的影響將活化菌體以2%的接種量接種到種子培養基中(葡萄糖5%，(NH4)2SO4O. 06%, K2HPO4O. 5%, MgSO4. 7Η20 0. 04%, NaCl 0. 1 %，酵母抽提物 0. 04%，121°C滅菌 20 分鐘。)， 控制pH 6. 5，300C，150r/min搖瓶培養4d。IOOOOr離心5min，收集菌體，菌體經去離子水洗 滌兩遍，棄去上清，得到濕菌體待用。稱取2g濕菌體，采用無菌去離子水制成2g/100mL的 菌懸液。取含不同濃度海蓬子提取物的溶液5mL(空白對照為5mL去離子水)，放入IOOmL 三角瓶中，再分別加5mL上述菌懸液(每樣重復三遍)，再添加40mL種子培養基，在最佳培 養條件下置于搖床中，150r/min振蕩培養48h后，IOOOOr離心5min，棄去培養基，加入PBS洗滌兩次，加入1 %的TritonX-IOO溶液振蕩5分鐘，加入L-Dopa溶液，37°C反應30分鐘， 于492nm檢測吸光度值。從圖4可知，酪氨酸酶活性受所添加海蓬子的劑量增加而活性降低，即酪氨酸酶 活性被抑制率提高。海蓬子(100yg/ml)對酪氨酸酶的抑制率達到59. 1 %。實施例5對出芽短梗霉細胞黑色素合成的影響將活化菌體以2%的接種量接種到種子培養基中，控制pH 6. 5,30°C,150r/min搖 瓶培養4d。IOOOOr離心5min，收集菌體，菌體經去離子水洗滌兩遍，棄去上清，得到濕菌體 待用。稱取2g濕菌體，采用無菌去離子水制成2g/100mL的菌懸液。取含不同濃度海蓬子 提取物的溶液5mL (空白對照為5mL去離子水)，放入IOOmL三角瓶中，再分別加5mL上述菌 懸液(每樣重復三遍)，再添加40mL種子培養基，在最佳培養條件下置于搖床中，150r/min 振蕩培養48h后，向其加入同等體積的lmol ^L-1NaOHjirc加熱攪拌Ih后，以6000r -min"1 離心15min棄沉淀，合并上清液。將定性濾紙103多次過濾后的上清液再經微孔濾膜 (0. 45 μ m)真空抽濾3次后，收集的濾液用6mol · L^HCl調pH至2 3左右，靜置4h后沸 水浴加熱30min，6000r · mirT1離心lOmin，蒸餾水洗滌沉淀至中性，烘干得到黑色素粗品。 從圖5可知，添加了海蓬子提取物的培養液顏色呈黃綠色，而對照為深褐色；經檢測由圖6 可知，添加了 ΙΟΟμ g/ml海蓬子提取物的培養液中，細胞所分泌的黑色素含量僅有241 μ g/ ml，而空白中達到972 μ g/ml，為添加海蓬子提取物的4倍之多。進一步說明，海蓬子提取物 由于抑制了出芽短梗霉細胞的酪氨酸酶合成活性，從而抑制了細胞黑色素的分泌。
權利要求
根據權利要求1所述的海蓬子提取物在抑制酪氨酸酶活性中的應用，其特征是本發明所述的海蓬子提取物，是指海蓬子水提物、海蓬子醇提物、超聲波水提物、超聲波醇提物。
2.根據權利要求2所述的海蓬子提取物，其特征是海蓬子水提物、海蓬子醇提物、超 聲波水提物、超聲波醇提物均分別經蒸餾濃縮和旋轉蒸發儀蒸發濃縮所得濃縮物。
3.根據權利要求3所述的海蓬子提取濃縮物，其特征是對酪氨酸合成酶活性的抑制 作用研究結果表明，蒸餾濃縮和旋轉蒸發儀蒸發濃縮對提取物的抑制率幾乎沒有影響。
4.根據權利要求1所述的海蓬子提取物在抑制酪氨酸酶活性中的應用，其特征是這 四種提取物對以酪氨酸為底物的酪氨酸酶抑制作用存在顯著性差異；抑制率分別為水提 物32. 48%，醇提物62. 37%，超聲波水提物43. 56%，超聲波醇提物75. 81%。其中海蓬子 超聲波醇提物表現出最好的抑制作用。為預防和治療色素沉著疾病提供依據。
5.根據權利要求1所述的海蓬子提取物在抑制酪氨酸酶活性中的應用，其特征是海 蓬子提取物在抑制出芽短梗霉細胞酪氨酸酶活性、細胞黑色素合成方面都表現出了較好的 效果。
全文摘要
本發明涉及海蓬子提取物抑制酪氨酸酶活性的應用。本發明所述的海蓬子提取物，是指海蓬子水提物、海蓬子醇提物、超聲波水提物、超聲波醇提物，分別經蒸餾濃縮和旋轉蒸發儀蒸發濃縮所得濃縮物，提供了其對酪氨酸合成酶活性的抑制作用研究結果。結果表明，蒸餾濃縮和旋轉蒸發儀蒸發濃縮對提取物的抑制率幾乎沒有影響。這四種提取物對以酪氨酸為底物的酪氨酸酶抑制作用存在顯著性差異。抑制率分別為水提物32.48％，醇提物62.37％，超聲波水提物43.56％，超聲波醇提物75.81％。其中海蓬子超聲波醇提物表現出最好的抑制作用。為預防和治療色素沉著疾病提供依據。
文檔編號A61P17/00GK101953764SQ20101028169
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月15日 優先權日2010年9月15日
發明者余曉紅, 劉漢文, 張龍, 申玉香, 許偉, 邵榮, 鄭清, 陳洪興 申請人:鹽城工學院