專利名稱：一種宮頸癌預防性vlp疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于誘導抗高危型人乳頭瘤病毒的疫苗。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(HPV)是小型DNA病毒，存在100個以上的基因型，其中有15個基因型(高危型:16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、73 型)是子宮頸癌的原因。HPV16 型在50-60%的子宮頸癌中被檢出。在歐美以18型居多，在亞洲以16、58型居多。HPV病毒殼體為正20面體骨架上具有12分子的L2蛋白質的結構，所述正20面體骨架由72個Ll蛋白質五聚體形成。L2蛋白質的兩端位于病毒殼體的內部，而其N末端側的一部分露出在殼體表面。如果采用重組DNA技術僅使Ll蛋白質大量表達，則會產生病毒樣顆粒(Virus-like particle ；VLP)0實驗證實，如果將牛乳頭瘤病毒、棉尾兔乳頭瘤病毒的VLP或L2蛋白質接種于動物，則會對病毒侵染表現出抵抗性。目前尚沒有可供HPV增殖的培養細胞系。為了監測HPV的感染，制作了假病毒。 在表達SV40T抗原的人293細胞中導入具有SV40復制起點的分泌性堿性磷酸酶(SEAP)表達質粒、以及Ll和E7蛋白質表達質粒，則復制的SEAP表達質粒組入L1/E7-病毒樣顆粒， 從而形成了感染性假病毒。可以通過抑制假病毒的感染性的活性來測定中和抗體(Rose， R. C.，Bonnezj W.，Reichmanj R. C.，Garceaj R. L， 1993. Expression of human papillomavirus type 11 Ll protein in insect cells: in vivo and in vitro assembly of virus-like particles. J. Virol. 67，1936 - 1944)。將HPV的VLP接種于動物而得到的抗血清具有基因型特異性的中和活性 (Chen, X. S. , Garcea, R. L. , Goldberg, I. , Casini, G. , Harrison, S. C. , 2000. Structure of small virus-like particules assembled from the Ll protein of human papillomavirus 16. Mol. Cell 5, 557 - 567 ；Harper, D. Μ. , et al. : Sustained efficacy up to 4. 5 years of abivalent Ll virus-like particle vaccine against human papillomavirus type 16 and 18:follow up from a randomized control trial. Lancet 367(9518)，1247-1255)。基于此，Merck公司開發出了 HPV16、18型VLP的混合疫苗。這些疫苗在大規模臨床實驗中顯示出基因型特異性的感染預防效果，Merck公司的疫苗于2006 年取得了 FDA和歐洲委員會的認證并上市銷售。但是，如上述，如果用HPV的Ll-病毒殼體免疫動物，則會誘導出相應型病毒基因特異性的免疫應答。如使用16型Ll-病毒殼體疫苗進行的臨床實驗的中間成績顯示對16 型的感染的預防有效性，但也顯示對于其它基因型基本沒有預防效果。在15個高危HPV群體中，現在銷售的HPV疫苗僅對16型和18型有效。因為VLP 誘導基因型特異性的中和抗體，為了針對全部高危HPV群，必須使用15種VLP的雞尾酒，以此作為實用性疫苗抗原是困難的。因此，希望開發誘導交叉反應性中和抗體的疫苗抗原。W02007/018049公開的抗原是至少能夠抗全部高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。但是，其使用的感染性假病毒僅為16、18型，相對于這些感染性假病毒，W02007/018049使用的抗原顯示了良好的中和活性。而本申請發明人在后續的實驗中發現， W02007/018049公開的抗原對本發明人新開發的52、58型的感染性假病毒的中和活性并不
尚ο為了用疫苗預防子宮頸癌的發生，至少必須開發出能夠抵抗所有高危型病毒的疫
田ο
發明內容
本發明的目的在于提供一種可以對抗多種高危型HPV病毒的疫苗。本發明所采取的技術方案是
一種宮頸癌預防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳頭瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集體，所述嵌合蛋白通過在HPV 18型、52型或58型的Ll蛋白的140與141位之間插入HPV 16型的 E7 表位而得到，其中，E7 表位為 MLDLQPETT (SEQ ID NO 1), RAHYNIVTF (SEQ ID NO :2)、 LLMGTLGIV (SEQ ID NO :3)、TLGIVCPI (SEQ ID NO :4)中的至少一種。聚集體由多個五聚體病毒殼粒聚集而成。優選的，五聚體病毒殼粒的個數為60 85個。疫苗的聚集體中，至少含有兩種不同的E7表位，優選的，含有4種E7表位。疫苗還含有可接受的藥用輔料。本發明的有益效果是
本發明的疫苗，可以高效地誘導抗多種抗高危型HPV病毒的中和抗體，免疫效果好，免疫時間長。
具體實施例方式一種宮頸癌預防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳頭瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集體， 所述嵌合蛋白通過在HPV 18型、52型或58型的Ll蛋白的140與141位之間插入HPV 16 型的 E7 表位而得到，其中，E7 表位為 MLDLQPETT (SEQ ID NO 1), RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 2), LLMGTLGIV (SEQ ID NO :3)、TLGIVCPI (SEQ ID NO :4)中的至少一種。在本發明中，從蛋白質的氨基末端起依次對氨基酸殘基進行編號，例如第50號位的氨基酸記作氨基酸50。本發明中HPV 18型、52型或58型Ll蛋白的序列分別如SEQ ID NO :5 7所示。為了制作本發明的嵌合蛋白質而插入Ll蛋白質的人乳頭瘤病毒16型的E7表位序列為
MLDLQPETT (以下簡稱12-20 E7表位) RAHYNIVTF (以下簡稱49-57 E7表位) LLMGTLGIV (以下簡稱82-90 E7表位)或 TLGIVCPI (以下簡稱86-93 E7表位)。12-20 E7表位由HPV16型的E7蛋白質的氨基酸12-20區域的9個氨基酸構成。 49-57 E7表位由HPV16型的E7蛋白質的氨基酸49-57區域的9個氨基酸構成。82-90 E7 表位由HPV16型的E7蛋白質的氨基酸82-90區域的9個氨基酸構成。86-93 E7表位由 HPV16型的E7蛋白質的氨基酸86-93區域的8個氨基酸構成。
HPV的基因型多，因而，通常以HPV16、HPV58等表示方式將其基因型一并表示出來。在本文中，類似將HPV16型的Ll-病毒殼體表述為16L1-病毒殼體。聚集體由多個五聚體病毒殼粒聚集而成。優選的，五聚體病毒殼粒的個數為60 85個。如前述，HPV粒子中，72個由5個分子的Ll蛋白質聚集而成的病毒殼粒聚集在一起形成正20面體的病毒殼體。如果使Ll蛋白質在細胞中高表達，則Ll蛋白質集中在核內， 并自主性的形成病毒殼體。僅由Ll蛋白質形成的病毒殼體稱為Ll-病毒殼體或病毒樣顆粒(virus-like particle :VLP)。如果使Ll蛋白質和E7蛋白質同時表達，則12個分子的 E7蛋白質會組入Ll-病毒殼體，從而形成L1/E7-病毒殼體(或L1/E7-VLP)。Ll-病毒殼體與L1/E7-病毒殼體無法用電子顯微鏡辨別。天然型VLP通常由360個分子的Ll蛋白質形成，這種情況下，每個粒子具有360 個交叉反應性表位。使用重組桿狀病毒在昆蟲sf9細胞中表達將HPV16E7蛋白質的氨基酸12 20、49 57、82 90、86 93的序列插入HPV18型、52型、58型Ll蛋白質的氨基酸140/141之間而VLP，電子顯微鏡照片顯示各嵌合蛋白形成了 VLP粒子，分別命名為 Chl2/20、Ch49/57、Ch82/90、Ch86/93。疫苗的聚集體中，至少含有兩種不同的E7表位，優選的，含有4種E7表位。這可以獲得更多的交叉中各反應，使得該疫苗可以對抗更多的高危型HPV。疫苗還含有可接受的藥用輔料。將E7表位對應的核酸序列插入到相應的Ll蛋白基因中的對應位置，之后將得到的核酸序列插入表達載體中表達，即可得到相應的嵌合蛋白。下面結合實施例，進一步說明本發明。兔肽抗血清的制作
對2只新西蘭兔(2. 5kg 3. Okg)進行了免疫。所使用的抗原是化學合成的肽與KLH (keyhole limpet hemocyanin)相結合而得到的。首次致敏是將0. 5mg抗原與弗氏完全佐劑一起皮下施用。首次施用2周后將0.25mg抗原與弗氏完全佐劑一起皮下施用。而且，在 2周后、4周后、6周后同樣(0. 25mg)地進行致敏，共計進行5次致敏。在末次致敏1周后， 采集全血，得到了血清。采用以下所示的中和實驗，考察了用具有HPV16型E7-表面區域的氨基酸序列的合成兔肽兔而得到的抗血清。結果如表1所示。由表1所示的結果可知氨基酸12-20、 49-57,82-90,86-93區域中存在交叉反應性表位。中和實驗
1)中和實驗前一天，在96孔細胞培養用平板中播種10000個/孔的細胞(購自 Invitrogen 公司)；
2)用NeautralizationBuffer (在除去酚紅的DMEM培養基中添加10%FCS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酸、IOmM HEPES而得到)稀釋血清，并與感染性假病毒相混合，4°C反應1 小時，再將其添加于前一天播種的細胞；
3)培養約72小時后，回收上清20μ1，采用Roden等的方法(參照http://home.ccr. cancer. gov/lco/colorimetricSEAP. htm)測定堿性磷酸酶活性。表1、抗E7肽抗體中和活性
權利要求
1.一種宮頸癌預防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳頭瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集體， 所述嵌合蛋白通過在HPV 18型、52型或58型的Ll蛋白的140與141位之間插入HPV 16 型的 E7 表位而得到，其中，E7 表位為 MLDLQPETT (SEQ ID NO 1), RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 2)、LLMGTLGIV (SEQ ID NO :3)、TLGIVCPI (SEQ ID NO :4)中的至少一種。
2.根據權利要求1所述的一種宮頸癌預防性VLP疫苗，其特征在于聚集體由多個五聚體病毒殼粒聚集而成。
3.根據權利要求2所述的一種宮頸癌預防性VLP疫苗，其特征在于聚集體的五聚體病毒殼粒的個數為60 85個。
4.根據權利要求1 3任意一項所述的一種宮頸癌預防性VLP疫苗，其特征在于所述疫苗的聚集體中，至少含有兩種不同的E7表位。
5.根據權利要求4所述的一種宮頸癌預防性VLP疫苗，其特征在于所述疫苗的聚集體中，含有4種E7表位。
6.根據權利要求1所述的一種宮頸癌預防性VLP疫苗，其特征在于所述疫苗還含有可接受的藥用輔料。
全文摘要
本發明公開了一種宮頸癌預防性VLP疫苗，VLP是HPV18型、52型、58型L1蛋白的環部位插入1個16型的E7表位而得到的嵌合蛋白的聚集體。本發明的疫苗可以高效地誘導抗多種抗高危型HPV病毒的中和抗體，免疫效果好，免疫時間長。
文檔編號A61P31/20GK102552897SQ20121001561
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者安鴻, 尹海濱 申請人:廣東華南聯合疫苗開發院有限公司