專利名稱：一種重組海參溶菌酶c端多肽、其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及重組海參溶菌酶C端多肽高效表達的工程菌制備方法，優化發酵工藝而獲得高產率的可溶性多肽產物，以及對制備的產品進行廣譜抗菌活性的研究。
背景技術：
溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性酶，它能催化細菌細胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β _1，4糖苷鍵的水解，導致細胞裂解，內容物逸出而使細菌死亡。它廣泛存在于自然界動植物和微生物的組織、體液及分泌物中，在生物機體的免疫防御系統中發揮重要作用。溶菌酶作為天然的抗菌劑、免疫增強劑和防腐劑目前廣泛應用于醫藥、食品及飼料等行業。近年來隨著海洋生物魚類、蝦類、貝類以及海珍品，如海參、鮑魚等養殖產量的快速增長，隨之而來的是海水養殖生產中的品質退化、養殖水平低、疾病泛濫及環境污染等問題。目前在水產品養殖以及畜禽生產中使用抗生素帶來的問題也越來越受到人們的關注，一是耐藥性問題，二是藥物殘留問題，其副作用是不可忽視的，人們不希望以犧牲人類健康為代價換取海產品、畜禽產品生產性能的提高。在這種嚴峻形勢下，溶菌酶在動物養殖方面的優勢以及在疾病預防治療方面的促進作用顯示了它的突出地位，它的綠色、安全、無公害的特點代表了未來的飼料添加劑和動物保健品的方向。根據溶菌酶空間結構、免疫學特性和催化活性的差異通常可分為6類C-型 (chicken-type)溶菌酶、g_ 型(goose-type)溶菌酶、i_ 型(invertebrate-type)溶菌酶； 植物源(plant lysozyme)溶菌酶；微生物源(bacterial lysozyme)溶菌酶；噬菌體(phage lysozyme)溶菌酶。近年來隨著人們把開發新藥和功能性食品的目光投向海洋，對i_型溶菌酶的研究興趣也日益高漲，相繼在海洋貝類、蝦、海星、海膽、海參中發現了 i_型溶菌酶。目前已商品化使用的溶菌酶主要從蛋清中提取，屬于C-型溶菌酶。由于來源有限，生產工藝復雜，溶菌酶產量受限，價格居高不下，難以滿足越來越大的市場需求。因此， 利用基因工程重組技術高效表達溶菌酶成為很重要的手段，尤其生產海參i_型溶菌酶具有非常重要的應用價值。研究發現，海參i_型溶菌酶與蛋清C-型溶菌酶不同，后者只對革蘭氏陽性菌起抗菌作用，而海參i_型溶菌酶不僅對革蘭氏陽性菌，并且對革蘭氏陰性菌均具有顯著的抗菌作用，尤其對通常引起水產動物嚴重病害的病原菌(弧菌和假單胞菌)具有明顯的抗菌效果。同時，海參i_型溶菌酶具有較強的抗真菌、抗病毒、增加免疫力等能力，并具有生物相容性好、對組織無刺激、無毒性等特點。海參i-型溶菌酶(以下簡稱海參溶菌酶)基因于2007年在我們實驗室首次被分離和鑒定(參見楊西建，等.海參i_型溶菌酶基因及其編碼產物的結構特點.中國生物化學與分子生物學報；2007，23 (7) :542-547)。近年來，我們又將海參溶菌酶基因分別在大腸桿菌和畢赤酵母細胞中進行重組表達，并對重組蛋白的抗菌活性進行了研究(參見王秀霞，等.海刺參i_型溶菌酶基因的重組表達及抑菌譜分析.生物工程學報，2009，25 O) 189-194;谷躍峰，等.海參溶菌酶基因克隆及在畢赤酵母中的表達與純化.大連工業大學學報，2010，四(5) :317-320)。但目前存在的問題，一是重組海參溶菌酶基因在大腸桿菌細胞中表達，其溶菌酶蛋白以包涵體形式存在(即酶蛋白不溶解)，后續對該蛋白的變性和復性操作繁瑣，而且獲得的酶產量低、活性不穩定；二是重組海參溶菌酶基因在畢赤酵母細胞中蛋白表達量很低。這兩個瓶頸問題嚴重阻礙了海參溶菌酶研究向產業化試驗的進程，并且國內外幾個實驗室在研究各類溶菌酶基因表達時都遇到類似問題。經過對海參溶菌酶基因結構的分析，發現海參溶菌酶的N端區域可能編碼了糖苷酶活性，而C端區域可能編碼了異構肽酶活性。因此，我們設計將海參溶菌酶基因分成兩段，分別進行重組表達制備成海參溶菌酶N端和C端多肽，再驗證其特性和功能，并與海參溶菌酶做比較和分析。本發明是關于重組海參溶菌酶C端多肽的制備方法及應用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種具有廣譜抗菌活性、高效表達海參溶菌酶C端多肽的基因工程制備方法。本發明采用的技術方案為對來源于自主分離鑒定的海刺參 (Stichopus japonicus)的溶菌酶(SjLys)基因(GenBank 注冊號EF036468)進行 C 端多肽的重組表達。利用設計合成的引物，擴增海參溶菌酶C端多肽的基因；將構建的原核表達載體pET-32a_S jLys-C，轉化Rosetta (DE3) pLysS細胞，獲得一株高效表達重組海參溶菌酶 C端多肽的基因工程菌。用所述的基因工程菌生產的溶菌酶C端多肽，經發酵培養基及發酵條件的優化，其表達產物具有80%以上的可溶性，產品收率高。生產的重組海參溶菌酶C端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其是經100°C加熱40min，該多肽產品的抗菌活性增強了 10% 25%。研究證明，海參溶菌酶C端多肽的抗菌活性、穩定性和生產效率均優于海參溶菌酶， 可無危害地應用于制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等。本發明的另一方面在于保護一種重組海參溶菌酶C端多肽的引物序列，其引物序列分別為，正向引物=SEQ ID NO 1 ；反向引物=SEQ ID NO :2。本發明的另一方面在于保護一種重組海參溶菌酶C端多肽的質粒，其制備方法包括以海參溶菌酶SjLys基因為模板，將核苷酸序列分別為，正向引物SEQ ID NO :1 ；反向引物SEQ ID NO :2的引物序列所擴增的基因片段連接至大腸桿菌表達載體pET3h(+)中， 構建重組表達質粒。本發明的另一方面在于保護一種表達重組海參溶菌酶C端多肽的基因工程菌，其制備方法包括將上文所述的質粒轉化Rosetta(DEiB)pLysS宿主細胞獲得重組基因工程菌。本發明的另一方面在于保護一種重組海參溶菌酶C端多肽的制備方法，包括下述步驟①誘導表達培養上文所述的重組基因工程菌，并用IPTG誘導表達；②分離和純化收集步驟①所得產物，經鎳離子親和層析柱純化，并用超濾膜濃縮；再將濃縮樣品脫鹽后制得終產品。本發明的另一方面在于保護一種上文所述的方法，其特征在于，誘導表達和分離純化的條件包括③誘導表達將上文所述的重組基因工程菌在優化的液體培養基中，37°C、160rpm振蕩培養至0D600達0. 6 0. 8，再向培養體系中加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L, 28C, 150rpm誘導培養》1，收集發酵液；其中，優化的液體培養基是指在LB培養基中加入兩種抗生素，即100mg/L氨芐青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；④分離和純化將步驟③收集的發酵液離心，收集并洗滌菌體，反復凍融，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，并加入Triton X_100至終濃度為1 %后，經冰浴超聲破菌，離心收集上清液，經鎳離子親和層析柱His Trap HP column純化，收集重組海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分，用截留分子量為5kDa的Millipore超濾膜將蛋白濃縮至8 10mg/mL ；再將濃縮樣品經kphadex G-25凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，得到重組海參溶菌酶C端多肽的產品。本發明的另一方面在于保護一種利用上文所述的方法獲得的重組海參溶菌酶C 端多肽產品。本發明的另一方面在于保護一種利用上文所述的重組海參溶菌酶C端多肽在制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物、海水養殖生產領域中的應用。上述本發明涉及的下列各實驗操作，包括基因片段連接至大腸桿菌表達載體 pET32a(+)中、質粒轉化Rosetta (DE;3)pLysS宿主細胞、鎳離子親和層析柱純化、超濾膜濃縮、樣品脫鹽等實驗操作方法均為本領域技術人員常用的實驗技術，故再次不做贅述，具體可見本發明中具體實施例所述部分。本發明的創新特征是1.高效表達和制備可溶性重組海參溶菌酶C端多肽，解決了當前海參溶菌酶產業化遇到的蛋白溶解度低、酶活性低等關鍵問題。2.本發明提供的基因工程菌生產重組海參溶菌酶C端多肽，具有產量高，生產條件和步驟簡單，反應條件易于控制，生產成本低的優點，因此適用于大規模的生產。3.重組海參溶菌酶C端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其經加熱處理后的該產品，其抗菌活性提高了 10% 25%。因此，該產品具有很好的熱穩定性和酶活穩定性，而且安全無害，可應用于制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等。
圖 1 是 PCR 擴增 SjLys-C 的基因片段；其中泳道，M :100bp DNA ladder marker ； 1 =PCR擴增產物；圖2是重組海參溶菌酶C端多肽的Western blotting分析結果圖；其中泳道，M 精準蛋白質分子量標準；1 =IPTG誘導前菌株發酵液的菌體；2 :IPTG誘導后菌株發酵液的菌體；3 =Western blotting檢測泳道1中的樣品；4 =Western blotting檢測泳道2中的樣
P
BFI ；圖3是重組海參溶菌酶C端多肽的誘導表達及純化的SDS-PAGE結果圖；其中泳道，M 蛋白質分子量標準；1 IPTG誘導前菌株發酵液的菌體；2 :IPTG誘導后菌株發酵液的菌體；3 誘導的菌株發酵液菌體細胞被破碎后的沉淀物；4 誘導的菌株發酵液菌體細胞被破碎后的上清液；5 泳道4中的樣品經Ni2+-NTA親和層析柱純化的重組蛋白。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。下述實施例中所用的海刺參(Stichopus japonicus)，源于大連長海縣地區，其海參溶菌酶(SjLys)基因的GenBank注冊號為EF036468 ；引物序列合成、DNA測序是由北京華大基因研究中心完成；Western blotting 7MirMi^ TaKaRa Biotechnology ( ) ^ ] ；大腸桿菌Rosetta (DE;3)pLysS感受態細胞和表達載體pET_32a(+)購自 Novagen(美國)公司；大腸桿菌DH5a，克隆載體 pMD 18-T，RNAiso Plus 試劑，TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒，限制性核酸內切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，DNA ladder marker禾口蛋白低分子量marker均購自TaKaRa Biotechnology (大連)公司；質粒提取和瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；HisTrap HP column 購自 GE Healthcare (美國)公司；其他試劑均為國產的分析純。實施例1高效表達重組海參溶菌酶C端多肽的基因工程菌的制備1.海參溶菌酶C端多肽基因序列的擴增(1)根據海參溶菌酶的基因序列，設計兩對特異性引物，分別在正向和反向序列里引入Nco I和EcoR I酶切位點。其序列為正向引物SEQID NO :1GAATGCCATGGTGATGGGAGGTAGTCT反向引物SEQID NO :2GTGGAATTCTGTTCAGTTGTTGCTCATGTC。PCR擴增片段范圍是從海參溶菌酶氨基酸Gly 70至Asn 145，全長為228bp (含有 76aa)，即為SjLys-C的基因片段。(2)取新鮮的海刺參腸樣品，根據RNAiso Plus試劑說明抽提總RNA。(3)以該海參腸總 RNA 為模板，使用 TaKafci One Step RNA PCR Kit(AMV)進行 RT-PCR基因擴增，其反應體系為
權利要求
1.重組海參溶菌酶C端多肽的引物序列，其特征在于引物序列分別為，正向引物SEQ ID NO 1 ；反向引物:SEQ ID NO :2。
2.一種重組海參溶菌酶C端多肽的質粒，其特征在于，制備方法包括以溶菌酶SjLys 基因為模板，將權利要求1所述的引物序列所擴增的基因片段連接至大腸桿菌表達載體 pET32a(+)中，構建重組表達質粒。
3.—種表達重組海參溶菌酶C端多肽的基因工程菌，其特征在于，制備方法包括將權利要求2所述的質粒轉化Rosetta(DE;3)pLysS宿主細胞獲得重組基因工程菌。
4.一種重組海參溶菌酶C端多肽的制備方法，其特征在于，制備方法包括①誘導表達培養權利要求3所述的重組基因工程菌，并用IPTG誘導表達；②分離和純化收集步驟①所得產物，經鎳離子親和層析柱純化，并用超濾膜濃縮；再將濃縮樣品脫鹽后制得終產品。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，誘導表達和分離純化的條件包括③誘導表達將權利要求3所述的重組基因工程菌在優化的液體培養基中，37°C、160rpm振蕩培養至0D600達0. 6-0. 8，再向培養體系中加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，、150rpm誘導培養8h，收集發酵液；其中，優化的液體培養基是指在LB培養基中加入兩種抗生素，即100mg/L氨芐青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；④分離和純化將步驟③收集的發酵液離心，收集并洗滌菌體，反復凍融，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體， 并加入Triton X-100至終濃度為1 %后，經冰浴超聲破菌，離心收集上清液，經鎳離子親和層析柱His Trap HP column純化，收集重組海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分，用截留分子量為51^^的肌11丨？0儀超濾膜將蛋白濃縮至8 1011^/1^ ；再將濃縮樣品經kphadex G-25 凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，得到重組海參溶菌酶C端多肽的產品。
6.根據權利要求4或5所述的方法獲得的重組海參溶菌酶C端多肽產品。
7.如權利要求6所述的重組海參溶菌酶C端多肽在制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物、海水養殖生產領域中的應用。
全文摘要
本發明涉及對來源于海刺參(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)基因(GenBank注冊號為EF036468)進行C端多肽的重組表達。首先構建出重組表達質粒pET-32a-SjLys-C，再轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS細胞，獲得一株高效表達重組海參溶菌酶C端多肽的基因工程菌。利用該基因工程菌生產的溶菌酶C端多肽，經發酵培養基及發酵條件的優化，其表達產物具有80％以上的可溶性，產品收率高。生產的重組海參溶菌酶C端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其是該產品經100℃加熱40min處理后，它的抗菌活性增強了10％～25％，這對開發海參溶菌酶多肽作為飼料添加劑非常有利。
文檔編號A61K38/47GK102559671SQ20121005548
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者叢麗娜, 常藝海 申請人:大連工業大學