專利名稱：：一種海參多肽及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種海參多肽及其制備方法與應用。
背景技術：
：隨著現代社會環境與食物污染的日益嚴重，癌癥發病率越來越高，而治療癌癥主要采用放、化療的手段，但其副作用很大，其中絕大多數會引起白細胞減少癥。海參的重要藥用價值及其生物活性物質的研究工作已有許多報到。目前報道的有關活性物質主要有多糖、多肽及海參皂苷等；這些活性物質的功效主要有抗凝和止血作用，抗腫瘤作用，增強免疫力，延緩衰老，降血糖，抗輻射，抗炎等。但是從海參中逐級分離純化出的多肽在提升白細胞數量和促進機體化療后骨髓細胞增殖作用方面的研究尚未見報道，臨床上也未見海參多肽用于提升白細胞數量和促進機體化療后骨髓細胞增殖作用的治療的報道。
發明內容針對上述現有技術，本發明提供了一種具有藥用價值和保健價值的海參多肽。本發明是通過以下技術方案實現的一種海參多肽的制備方法，包括以下步驟(1)海參多肽粗品的提取取新鮮刺參，去除內臟，洗凈，破碎成0.31.5CI^的小塊，加入海參重量的810倍的水勻漿，得勻漿液；勻漿液依次經胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，酶解完畢后，煮沸滅酶活，離心，取上清液；向上清液中加入乙醇，至乙醇體積百分比達4080%,靜置412小時，離心取上清，對上清減壓濃縮并干燥，既得海參多肽粗品；(2)將上述海參多肽粗品用蒸餾水溶解，SephadexLH-20凝膠過濾層析，雙蒸水洗脫，最終會得到三個峰，取第二個峰，i收集此處的活性組分，濃縮并冷凍干燥；(3)將上述的活性組分用雙蒸水溶解，QSepharoseFastFlow離子交換層析，NaCl溶液線性洗脫，最后會得到三個峰，然后用SephadexG-15凝膠介質脫鹽，取第二個峰，收集此處的活性組分，濃縮并冷凍干燥，即得海參多肽。所述步驟(1)中胃蛋白酶的酶解條件為酶量為海參濕重的0.11%,pH2.02.5,溫度4060。C,時間38h。所述步驟(1)中胰蛋白酶的酶解條件為酶量為海參濕重的0.0.11%，pH8.08.5,溫度4060。C，時間38h。所述步驟(1)中第一次離心的轉速為10000r/min，時間10min;第二次離心的轉速為600010000r/min,時間515min;第二次離心的轉速為20004000r/min，時間515min。所述步驟(1)中的酶解也可以用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶來代替胃蛋白酶、胰蛋白酶。所述步驟(3)中NaCl溶液的濃度為0.5~2mol/L。一種采用上述制備方法制備的海參多肽，以凝膠過濾法測定其分子量小于3kDa。所述海參多肽在制備提升白細胞數量的藥物或保健品中的應用。所述海參多肽在制備用于機體化療后骨髓細胞增殖的藥物或保健品中的應用。本發明的發明人進行了海參多肽的體內和體外試驗，藥理實驗及結果表明本發明所述的海參多肽對于化療后免疫缺陷小鼠模型有明顯的提升白細胞數量的作用；對于化療后小鼠的骨髓細胞有明顯的增殖作用。這些發現從機理上表明，海參多肽對于化療后機體具有良好的提升白細胞數量的作用，對骨髓細胞具有良好的促生長和促增殖作用。預示海參多肽在制備作為提升白細胞數量和促進機體化療后骨髓細胞增殖作用的藥物或保健品中有很大的開發應用前景。圖1為海參多肽粗品SephadexLH-20凝膠柱洗脫曲線(280nm);圖2為HST-2組分QS印haroseFastFlow離子柱洗脫曲線(280nm)。具體實施例方式下面結合實施例和試驗對本發明作進一步的說明實施例l:從刺參中提取海參多肽，步驟如下(1)取新鮮刺參，去除內臟，洗凈，破碎成lcn^的左右的小塊，加入8-10倍水勻漿。勻漿液分別經胃蛋白酶(酶量為海參濕重的0.4%，pH2.0-2.5，溫度50'C,時間5h)、胰蛋白酶(酶量為海參濕重的0.45%，pH8.0-8.5，溫度50'C，時間5h)酶解，酶解完畢，煮沸滅酶活，離心(10000r/min，10min)取上清液。將上清液60%乙醇沉淀過夜，離心(4000r/min，15min)取上清，減壓濃縮并冷凍干燥得海參多肽粗品，命名HST。(2)將海參多肽粗品用蒸餾水溶解，SephadexLH-20凝膠過濾層析，蒸餾水洗脫，280nm在線檢測，洗脫結果如圖1所示，最后得到3個峰，取第二個峰，收集活性組分，濃縮并冷凍干燥，命名HST-2。第一個峰、第三個峰的組分同樣處理，分別命名HST-1，HST-3。(3)將HST-2用蒸餾水溶解，QSepharoseFastFlow離子交換層析，2mol/LNaCl溶液線性洗脫，280nm在線檢測，洗脫結果如圖2所示(其中，棕色曲線表示氯化鈉洗脫濃度)，最后得到3個峰，分別經SephadexG-15凝膠介質脫鹽，取第二個峰，收集活性組分，濃縮并冷凍干燥，命名HST-2-2，即為本發明的海參多肽。第一個峰、第三個峰的組分同樣處理，分別命名HST-2-l,HST-2-3。實施例2:海參多肽粗品對化療后免疫缺陷小鼠的提升白細胞數量作用選用昆明種小鼠(體重20土1.0g)50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半且分開培養。依次為空白對照組，模型對照組，HST低、中、高三個劑量組。除空白對照組外，其他4組均用環磷酰胺造模，按30mg/kg.bw予每只小鼠作腹腔注射4次。造模后次日起，各組每天灌胃一次，灌胃體積0.2ml/10g.bw，連續10天。空白對照組和模型對照組用生理鹽水；海參多肽組用相對應的海參肽組分(根據小鼠與人的體表面積換算關系，中劑量組為海參粗肽200mg/kg.bw,低劑量組為中劑量組的1/5,高劑量組為中劑量組的5倍)。末次灌胃24h后，小鼠摘眼球取血，用血常規檢査EDTA-K2采血管收集500h1血液，SysmexXT-1800i血液細胞分析儀對血細胞記數，結果見表1。表l海參肽各組分對小鼠白細胞數量的作用影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注:與空白對照組比較*<0.05,*叩<0.01;與模型對照組比較AP0.05,AAP〈0.01從表l中可以看出，HST對化療后免疫缺陷小鼠有明顯的提升白細胞數量的作用。實施例3:HST-2對化療后免疫缺陷小鼠提升白細胞數量的作用選用昆明種小鼠(體重20土1.0g)110只，隨機分為11組，每組10只，雌雄各半且分開培養。依次為空白對照組，模型對照組，HST-1低、中、高三個劑量組，HST-2低、中、高三個劑量組，HST-3低、中、高三個劑量組。除空白對照組外，其他10組均用環磷酰胺造模，按30mg/kg.bw予每只小鼠作腹腔注射4次。造模后次日起，各組每天灌胃一次，灌胃體積0.2ml/10g.bw，連續10天。空白對照組和模型對照組用生理鹽水；海參多肽組用相對應的海參肽組分(根據小鼠與人的體表面積換算關系，中劑量組為海參粗肽200mgX肽組分收率，低劑量組為中劑量組的1/5，高劑量組為中劑量組的5倍)。末次灌胃24h后，小鼠摘眼球取血，用血常規檢查EDTA-K2采血管收集500pl血液，SysmexXT-1800i血液細胞分析儀對血細胞記數，結果見表2。表2海參肽各組分對小鼠白細胞數量的作用影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注:與空白對照組比較*<0.05,**P<0.01;與模型對照組比較AP0.05,AAP〈0.01從表2中可以看出，HST-2對化療后免疫缺陷小鼠有明顯的提升白細胞數量的作用，據統計分析，與其他各組相比，均有明顯差異。實施例4:HST-2-2對化療后免疫缺陷小鼠提升白細胞數量的作用選用昆明種小鼠(體重20土1.0g)110只，隨機分為11組，每組10只，雌雄各半且分開培養。依次為空白對照組，模型對照組，HST-2-l低、中、高三個劑量組，HST-2-2低、中、高三個劑量組，HST-2-3低、中、高三個劑量組。除空白對照組外，其他10組均用環磷酰胺造模，按30mg/kg.bw予每只小鼠作腹腔注射4次。造模后次日起，各組每天灌胃一次，灌胃體積0.2ml/10g.bw，連續10天。空白對照組和模型對照組用生理鹽水；海參多肽組用相對應的海參肽組分(根據小鼠與人的體表面積換算關系，中劑量組為海參粗肽200mgX肽組分收率，低劑量組為中劑量組的1/5,高劑量組為中劑量組的5倍)。末次灌胃24h后，小鼠摘眼球取血，用血常規檢査EDTA-K2采血管收集50(^1血液，SysmexXT-1800i血液細胞分析儀對血細胞記數，結果見表3。表3海參肽各組分對小鼠白細胞數量的作用影響組別劑量/(mg/ml)白細胞數/(Xl()9/L)空白對照組0.9%生理鹽水8.30±1.46模型對照組0.9%生理鹽水3.14士0.41"HST-2-l高劑量2.6106.33±0.98"HST-2-l中劑量0.52206.03±1.33"HST-2-l低劑量0.10445.86土1.18"HST-2-2高劑量0.62257.00±1.32"HST-2-2中劑量0.12456.51±1.25"HST-2-2低劑量0.02496.05±1.44"HST-2-3高劑量0.73255.72士1.07"HST-2-3中劑量0.14655.43士0.83"HST-2-3低劑量0.02935.34±1.81A注:與空白對照組比較tp〈0.05,"PO.01:與模型對照組比較AP0.05，AAP〈0.01從表3中可以看出，HST-2-2對化療后免疫缺陷小鼠有明顯的提升白細胞的作用，據統計分析，與其他各組相比，均有明顯差異。實施例5:海參多肽對化療后免疫缺陷小鼠骨髓細胞的增殖作用免疫缺陷小鼠頸椎脫臼處死，在75%酒精中浸泡片刻，剪開大腿部皮膚、分離肌肉，暴露股骨及兩端相連關節部。清除股骨上殘留肌肉，游離兩端關節或直接從兩端關節頭處剪下股骨，每只小鼠各取一根股骨(右側)。無菌條件下，剪掉股骨兩端彭大的關頭節，用PBS緩沖液通過針頭沖出全部骨髓細胞，吹吸沖打后，制成骨髓單細胞懸液。置于二氧化碳培養箱中，37°C，5%二氧化碳飽和濕度培養48h后進行實驗。骨髓細胞在96孔板中培養48h后，分別加入2mg/ml海參多肽，使海參多肽的終濃度分別為100jig/ml、10jxg/ml、lpg/ml，設正常對照組，37'C，5%二氧化碳飽和濕度培養48h，后進行MTT測定，結果見表4。_一表4海參多肽對骨髓細胞的作用_劑量/Oig/ml)吸光度增殖率/%空白對照0.0480±0.01101000.0813±0.013'69.3100.0761±0.009'58.610.0526±0.0089.5*表示跟空白對照相比，尸<0.05從表4中可以看出，海參多肽對化療后免疫缺陷小鼠骨髓細胞具有明顯的增殖作用。顯微鏡觀察發現，加入海參多肽的骨髓細胞，其增殖效果明顯，與未加入海參多肽的對照樣本相比顯著不同。權利要求1.一種海參多肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)海參多肽粗品的提取取新鮮刺參，去除內臟，洗凈，破碎成0.3～1.5cm3的小塊，加入8～10倍水勻漿，得勻漿液；勻漿液依次經胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，酶解完畢后，煮沸滅酶活，離心，取上清液；向上清液中加入乙醇，至乙醇體積百分比達40～80％，靜置4～12小時，離心取上清，對上清減壓濃縮并干燥，既得海參多肽粗品；(2)將上述海參多肽粗品用蒸餾水溶解，SephadexLH-20凝膠過濾層析，雙蒸水洗脫，最終會得到三個峰，取第二個峰，收集此處的活性組分，濃縮并冷凍干燥；(3)將上述的活性組分用雙蒸水溶解，QSepharoseFastFlow離子交換層析，NaCl溶液線性洗脫，最后會得到三個峰，然后用SephadexG-15凝膠介質脫鹽，取第二個峰，收集此處的活性組分，濃縮并冷凍干燥，即得海參多肽。2.根據權利要求1所述的一種海參多肽的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中胃蛋白酶的酶解條件為酶量為海參濕重的0.11%，pH2.02.5，溫度4060'C,時間38h。3.根據權利要求1所述的一種海參多肽的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中胰蛋白酶的酶解條件為酶量為海參濕重的0.0.11%，pH8.0~8.5,溫度406(TC，時間38h。4.根據權利要求1所述的一種海參多肽的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中第一次離心的轉速為600010000r/min，時間515min;第二次離心的轉速為20004000r/min，時間515min。5.根據權利要求1所述的一種海參多肽的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中NaCl溶液的濃度為0.52mol/L。6.—種采用權利要求1所述的制備方法制備的海參多肽。7.權利要求6所述的海參多肽在制備提升白細胞數量的藥物或保健品中的應用。8.權利要求6所述的海參多肽在制備用于機體化療后骨髓細胞增殖的藥物或保健品中的應用。全文摘要本發明公開了一種海參多肽，其制備方法如下(1)取新鮮刺參，去除內臟，洗凈破碎成小塊，加入水勻漿；勻漿液經酶解后，離心取上清液；加入乙醇，靜置，離心取上清，減壓濃縮并干燥，得海參多肽粗品；(2)將海參多肽粗品用蒸餾水溶解，SephadexLH-20凝膠過濾層析，雙蒸水洗脫，取第二個峰，收集活性組分，濃縮并冷凍干燥；(3)將上述的活性組分用雙蒸水溶解，QSepharoseFastFlow離子交換層析，NaCl溶液線性洗脫，然后脫鹽，取第二個峰，收集活性組分，濃縮并冷凍干燥，即得海參多肽。海參多肽可用于制備提升白細胞數量的藥物或保健品，還可用于制備用于機體化療后骨髓細胞增殖的藥物或保健品。文檔編號A61P35/00GK101514354SQ200910014298公開日2009年8月26日申請日期2009年2月25日優先權日2009年2月25日發明者吉愛國,宋淑亮,浩梁,王允山,逄少堃申請人:山東大學