專利名稱：藥物誘導的亞細胞結構疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明屬于疫苗領域，具體涉及一種藥物誘導的亞細胞結構疫苗及其制備方法。
背景技術：
腫瘤生物治療發展迅速，目前已有一些腫瘤疫苗上市，大量疫苗也進入臨床實驗階段，腫瘤疫苗包括腫瘤細胞疫苗，腫瘤相關抗原疫苗，核酸疫苗及相關活性免疫細胞疫苗
坐寸ο
而腫瘤細胞本身成分復雜，不同種類的腫瘤又存在一定差異，要想選定某特定的抗原肽作為研究靶點又存在一定困難，且腫瘤殺傷主要是通過MHC I類分子提呈誘導Thl型免疫反應起作用，本發明所涉及的短壽蛋白及缺損的核糖體產物屬于MHC I類抗原，且抗原類別根據腫瘤類別具有特異性。蛋白酶體抑制劑本身以可抗多發性骨髓瘤應用于臨床，蛋白酶體抑制劑聯合氯化銨可以抑制溶酶體功能，阻斷腫瘤細胞SLiPs、DRiPs的降解，促使其進入自噬途徑，達到募集短壽蛋白的目的；在此基礎上摹集自噬小體結構。以自噬小體為抗原制備疫苗，小體疫苗的雙層膜結構易于被DC等抗原遞呈細胞識別且攜帶的蛋白抗原易于激發體內Thl型免疫反應，活化的⑶4+、⑶8+ T淋巴細胞及分泌的細胞因子可有效殺傷腫瘤細胞。淋巴結給藥在臨床上以B超定位技術將抗原注射進入腫瘤病人兩側腹股溝淋巴結，大大減少抗原用量，縮短免疫遞呈途徑，快速有效活化免疫系統，使得機體用藥后相對迅速產生免疫應答,殺傷體內腫瘤細胞。
發明內容
解決的技術問題本發明的目的在于提供一種可以用于臨床的攜帶多種抗原的亞細胞結構疫苗。技術方案藥物誘導的亞細胞結構疫苗，在腫瘤原代細胞分裂過程中以蛋白酶體抑制劑誘導，腫瘤細胞內部產生的一些易降解蛋白進入自噬途徑，產生的自噬小體不被溶酶體降解，最終形成直徑為200-900nm的亞細胞結構，即為小體疫苗。藥物作用的主體是存活的原代腫瘤細胞。其抗原主體為短壽蛋白以及缺損的核糖體產物。其抗原主體為短壽蛋白以及缺損的核糖體產物由雙層膜結構包裹形成粒徑約為200-900nm自噬小體的亞細胞結構。誘導形成亞細胞結構的藥物為蛋白酶體抑制劑及氯化銨。給藥途經為淋巴結給藥。既可以單獨使用也可與藥物載體組成藥物組合物，或與其他藥物活性成分制成藥物組合物，或與其他免疫活性細胞組合使用。藥物誘導的亞細胞結構疫苗的制備方法，包括步驟(I)原代腫瘤細胞經酶法及機械研磨法制備單細胞體外培養；(2)培養至一定飽和度加入一定濃度蛋白酶體抑制劑及氯化銨孵育24-48小時，誘導自噬小體形成；(3)低速離心去除殘余完整的腫瘤細胞及其他雜質，保留上清；(4)高速離心收集上清中自噬小體結構；(5)由亞細胞結構包裹的抗原蛋白易于被抗原遞呈細胞識別及提呈，最終誘發機體強烈的細胞免疫。該方法適用于各種對蛋白酶體抑制劑具有藥物敏感性的腫瘤細胞類型制備相應的抗腫瘤小體疫苗。一種藥物誘導的亞細胞結構疫苗，在腫瘤原代細胞分裂過程中以蛋白酶體抑制劑誘導，腫瘤細胞內部產生的一些易降解蛋白進入自噬途徑，產生的自噬小體不被溶酶體降解，最終形成直徑為200-900nm的亞細胞結構，即為小體疫苗。藥物作用的主體是存活的原代腫瘤細胞。其抗原主體為短壽蛋白(short-lived proteins, SLiPs)以及缺損的核糖體產物(defective ribosomal products, DRiPs)。其抗原主體為短壽蛋白(short-livedproteins, SLiPs)以及缺損的核糖體產物(defective ribosomal products, DRiPs)由雙層膜結構包裹形成粒徑約為200-900nm自卩遼小體(aotophagesome)的亞細胞結構。誘導形成亞細胞結構的藥物為蛋白酶體抑制劑及氯化銨。給藥途經為淋巴結給藥，淋巴結給藥可以大大減少抗原用量，縮短抗原在體內傳遞過程，比常規給藥方式更易活化免疫系統。既可以單獨使用也可與藥物載體組成藥物組合物，或其他藥物活性成分制成藥物組合物，或與其他免疫活性細胞組合使用。
藥物誘導的亞細胞結構疫苗的制備方法，包括步驟(I)原代腫瘤細胞經酶法及機械研磨法制備單細胞體外培養，(2)培養至一定飽和度加入一定濃度蛋白酶體抑制劑及氯化銨孵育24-48小時，誘導自噬小體形成。(3)低速離心去除殘余完整的腫瘤細胞及其他雜質，保留上清。(4)高速離心收集上清中自噬小體結構。(5)由亞細胞結構包裹的抗原蛋白易于被抗原遞呈細胞識別及提呈，最終誘發機體強烈的細胞免疫。該方法適用于各種對蛋白酶體抑制劑具有藥物敏感性的腫瘤細胞類型制備相應的抗腫瘤小體疫苗。有益效果提供一種可以用于臨床的攜帶多種抗原的亞細胞結構疫苗及其制備方法，本發明的抗腫瘤的亞細胞結構疫苗是基于以蛋白酶體抑制劑及氯化銨誘導腫瘤原代細胞內短壽蛋白和缺損的核糖體產物作為抗原蛋白通過自噬途徑進入雙層膜結構的自噬小體中，這樣包裹抗原的自噬小體即為本發明的亞細胞結構疫苗。該疫苗經淋巴結給藥可以有效誘發機體免疫系統的交叉遞呈，激活CD4+、CD8+ T淋巴細胞及CTL細胞，殺傷腫瘤細胞。
圖I是本發明中方法制備的肝癌細胞亞細胞結構疫苗電鏡效果 圖2是臨床B超定位病人淋巴結給藥過程 圖3是病人給藥前后外周血IFNy濃度，a.免疫前，b.免疫后一周；
圖4是原發性肝癌病人肺轉移后使用小體疫苗治療前后腫瘤病灶部位CT。a.治療前，
b.治療后3個月。
具體實施方式
實施例I :
在本發明中提供了新型亞細胞結構疫苗的制備方法，包括(1)腫瘤病人原代細胞分離、體外培養，(2)蛋白酶體抑制劑及氯化銨誘導形成攜帶短壽蛋白的自噬小體形成，(3)梯度離心法分離自噬小體，(4)蛋白定量。這種疫苗強化抗原免疫原性原理為蛋白酶體抑制劑及氯化銨為誘導藥物，可以抑制溶酶體中蛋白酶對SLiPs、DRiPs的降解，而SLiPs、DRiPs作為MHC I類抗原可以有效誘導CD8+T淋巴細胞活化。分泌激活型細胞因子，如IL-l、IL-2、IFNa ,IFNy ,TNFa、TNF3
坐寸ο本發明第二方面，提供了一種抗腫瘤的細胞亞結構疫苗，其含多種有已知及未知抗原及表位，這些已知及未知的抗原主要由蛋白酶體抑制劑及氯化銨誘導制備。本發明第三方面，提供了制備亞細胞結構疫苗，S卩小體疫苗制備方法的適用范圍，如上所述，該疫苗可適用于所有對蛋白酶體抑制劑及氯化銨敏感的可在胞內促進SLiPs、DRiPs進入自噬小體形成的腫瘤細胞類型。 本發明第四上面，提供了上述小體疫苗用途，在臨床上，該疫苗可適用于實體瘤腫瘤患者術后有效輔助治療。本發明中，提供了上述小體疫苗的給藥途徑，即B超定位的病人兩側腹股溝淋巴
結給藥。本發明中提供了小體疫苗具體制備方法將實體瘤腫瘤病人術后分離的腫瘤組織在30min內在無菌環境進行單細胞分離處理，并以10%胎牛血清1640培養基二氧化碳環境培養，單細胞分離時先將實體瘤用剪刀簡單分離成小塊，按照每2g組織加入2mg/mL膠原酶II 37°C消化30min，取出消化后的單細胞懸液，經200目濾網過濾，取出其它纖維組織及脂肪組織，得到較純凈的腫瘤原代單細胞，生理鹽水洗滌后以1640完全培養基37°C, CO2培養。培養24小時后，收集細胞，將原培養液更換為含有Immol蛋白酶體抑制劑及Immol氯化銨的培養液，再放入細胞培養箱孵育過夜。電鏡觀察自噬小體形成情況，發現細胞此時會有200-900nm小泡狀結構分泌至胞外，即為自噬小體。此時，收集培養液上清，先經1000rpm/5min離心，完整細胞等將形成沉淀，小體將保留于上清中。再將上清12000rpm/30min離心，此時，粒徑較小的自噬小體將出現在沉淀中。收集沉淀，生理鹽水洗滌3次后以約500ul生理鹽水重懸，此時即得到小體疫苗注射液。為了充分滅活腫瘤原代細胞，小體疫苗制備完成后將經放射科Y射線處理lh。病人術后一個月即可使用上述小體疫苗，給藥劑量為每側IOOug/次，給藥間隔時間為一個月。
權利要求
1.藥物誘導的亞細胞結構疫苗，其特征在于在腫瘤原代細胞分裂過程中以蛋白酶體抑制劑誘導，腫瘤細胞內部產生的一些易降解蛋白進入自噬途徑，產生的自噬小體不被溶酶體降解，最終形成直徑為200-900nm的亞細胞結構，即為小體疫苗。
2.根據權利要求I所述的藥物誘導的亞細胞結構疫苗，其特征在于藥物作用的主體是存活的原代腫瘤細胞。
3.根據權利要求I所述的藥物誘導的亞細胞結構疫苗，其特征在于其抗原主體為短壽蛋白以及缺損的核糖體廣物。
4.根據權利要求I所述的藥物誘導的亞細胞結構疫苗，其特征在于其抗原主體為短壽蛋白以及缺損的核糖體產物由雙層膜結構包裹形成粒徑約為200-900nm自曬小體的亞細胞結構。
5.根據權利要求I所述的藥物誘導的亞細胞結構疫苗，其特征在于誘導形成亞細胞結構的藥物為蛋白酶體抑制劑及氯化銨。
6.根據權利要求I所述的藥物誘導的亞細胞結構疫苗，其特征在于給藥途經為淋巴結給藥。
7.根據權利要求I所述的藥物誘導的亞細胞結構疫苗，其特征在于既可以單獨使用也可與藥物載體組成藥物組合物，或與其他藥物活性成分制成藥物組合物，或與其他免疫活性細胞組合使用。
8.權利要求I所述的藥物誘導的亞細胞結構疫苗的制備方法，其特征在于包括步驟(O原代腫瘤細胞經酶法及機械研磨法制備單細胞體外培養；(2)培養至一定飽和度加入一定濃度蛋白酶體抑制劑及氯化銨孵育24-48小時，誘導自噬小體形成；(3)低速離心去除殘余完整的腫瘤細胞及其他雜質，保留上清；(4)高速離心收集上清中自噬小體結構；(5)由亞細胞結構包裹的抗原蛋白易于被抗原遞呈細胞識別及提呈，最終誘發機體強烈的細胞免疫。
9.根據權利要求8所述的藥物誘導的亞細胞結構疫苗的制備方法，其特征在于該方法適用于各種對蛋白酶體抑制劑具有藥物敏感性的腫瘤細胞類型制備相應的抗腫瘤小體疫苗。
全文摘要
藥物誘導的亞細胞結構疫苗及其制備方法，在腫瘤原代細胞分裂過程中以蛋白酶體抑制劑誘導，腫瘤細胞內部產生的一些易降解蛋白進入自噬途徑，產生的自噬小體不被溶酶體降解，最終形成直徑為200-900nm的亞細胞結構，即為小體疫苗。本發明的抗腫瘤的亞細胞結構疫苗是基于以蛋白酶體抑制劑及氯化銨誘導腫瘤原代細胞內短壽蛋白和缺損的核糖體產物作為抗原蛋白通過自噬途徑進入雙層膜結構的自噬小體中，這樣包裹抗原的自噬小體即為本發明的亞細胞結構疫苗。該疫苗經淋巴結給藥可以有效誘發機體免疫系統的交叉遞呈，激活CD4+、CD8+T淋巴細胞及CTL細胞，殺傷腫瘤細胞。
文檔編號A61K39/00GK102813915SQ20121025700
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月24日 優先權日2012年7月24日
發明者周鎮先, 邢蕓, 魏強, 曾勇, 蘇舒, 方媛 申請人:東南大學