從生物組織分離細胞的方法
【技術領域】
本發明涉及從生物組織分離細胞的方法。更詳細地，涉及通過調整蛋白質分解酶的使用量，能夠有效地穩定并分離具有高的生物活性的細胞的方法。
【背景技術】
在哺乳類、鳥類、爬行類及魚類等多細胞動物的肝臟、胰臟、腎臟、牙周組織、皮膚、軟骨、骨及神經組織等各種臟器及組織、以及ES細胞組織、誘導性多能干細胞(iPS細胞)的原材料用纖維芽細胞組織中存在的細胞或細胞集合體(細胞簇)的酶的離析在細胞移植或細胞株建立、治療及診斷、檢查等廣泛的用途中有用。例如，正在進行通過將從胰臟離析的胰島移植給患者來治愈糖尿病的醫療。在胰島移植中，在胰臟組織中存在的稱為胰島的細胞集合體的分離是必須的，此時，需要使胰島不受到損壞地分解胰臟組織，將胰島分離。另夕卜，正在通過將從肝臟分離的肝細胞移植給患者，進行肝功能衰竭等的治療。
為了使生物組織解離，從而使生物組織所含有的細胞或細胞集合體游離，需要使細胞等游離為所希望的程度，并從生物組織的其他部分分離。通過酶的離析，將細胞等從生物組織分離時，需要用膠原酶等蛋白質分解酶對細胞間基質進行處理。
生物組織由細胞和細胞間基質(細胞間物質)構成。細胞間物質是連接細胞的物質，其具有結構物和無結構物。結構物有膠原纖維、彈性纖維及網狀纖維等纖維。無結構物是填充在纖維之間的成分并被稱為基質的、溶膠或凝膠狀的物質，其有糖蛋白質及蛋白聚糖。
細胞間物質的代表為稱為膠原蛋白(Collagen)的蛋白質，其占生物體內總蛋白質重量的約1/3。膠原蛋白呈纖維結構，并被正式地稱為膠原蛋白纖維、膠原纖維。
組織大致分為上皮組織、支持組織、肌肉組織及神經組織4種。上皮組織為覆蓋身體或臟器表面的組織且細胞密度高、細胞間物質不介于其間。支持組織起到支持身體、臟器及細胞等的作用，并包括結締組織、軟骨組織、骨組織、血液及淋巴。肌肉組織為以收縮運動為目的的分化后的細胞的融合，細胞間物質所占的比例極少。肌肉組織雖然由肌細胞、結締組織、血管及神經構成，但主要的結構物為肌纖維。神經組織主要構成神經內膜和神經束膜，均含有大量細胞間物質(膠原蛋白)。
結締組織為支持組織之中的I種，是指脂肪組織和纖維性結締組織。作為纖維性結締組織的構成成分，有膠原纖維、彈性纖維。另外，纖維性結締組織大致分為疏水性結締組織和致密結締組織。疏水性結締組織是指采用膠原蛋白不規則排列的纖維性結締組織，并分布于皮下組織、粘膜組織、神經、血管外膜及小葉間組織等。
構成膠原蛋白的肽鏈的氨基酸具有如下特征:具有甘氨酸-氨基酸X-氨基酸Y”和甘氨酸每3個殘基重復的一級結構。已知人膠原蛋白有約30種分子種類存在。在體內存在最豐富的是纖維性的I型膠原蛋白。非纖維性的膠原蛋白IV也大量含有，并介由分子間二硫鍵互相連結，參與網狀組織的形成(非專利文獻I)。報告了在胰島和內分泌組織之間，存在膠原蛋白VI (非專利文獻2、3)。
關于組織分解用酶，就來自溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)的各種粗膠原酶而言，除了膠原酶以外，還包括各種蛋白酶(膠原蛋白分解活性及非特異性蛋白質分解活性)和非蛋白酶成分(磷脂酶等)。正在進行利用這種粗膠原酶從大部分生物組織的細胞及細胞簇的酶的分離。
已知胰島組織也通過選自來自溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)的2種膠原酶(ColG及ColH)、蛋白酶(嗜熱菌蛋白酶、分散酶或來自溶組織梭菌的中性蛋白酶(NP))的蛋白質分解酶來分解(專利文獻1、2)。例如，已知優選使用溶組織梭菌生產的2種膠原酶及I種中性金屬蛋白酶(非專利文獻4)。報告了從生物組織對細胞等進行酶的分離時，在分離的細胞等的收率及生物活性方面，2種膠原酶起著重要的作用(非專利文獻5)。
另外，報告了與酶混合物示出的α-N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)分解活性成比例，從人的胰臟的胰島分離數多(專利文獻I及非專利文獻6)。作為具有BAEE分解活性的酶，溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)產生的梭菌蛋白酶(CP)是已知的。
生物組織中的細胞間基質的狀態(特別是膠原蛋白的含量)根據物種、年齡、性別、組織、生活環境等的不同而不同。膠原蛋白在哪個組織的哪種狀態的基質中，含有怎樣的程度尚未明確。膠原蛋白從哺乳類至魚類廣泛地存在，由各個物種引起的結構膠原蛋白的不同也不明確。
認為對于特定類型的膠原蛋白是否在生物組織中的基質中存在，可通過使用針對各類型的膠原蛋白的抗體的免疫染色來決定。但是，由于膠原蛋白的種類多，膠原蛋白廣泛存在于多細胞動物，因此抗體的制造難等成為瓶頸，其實現困難。
現有技術文獻:
專利文獻
專利文獻1:國際公開第1996/00283號專利文獻2:國際公開第1998/24889號非專利文獻
非專利文獻 l:1noue et al.，J Cell B1l，97，1524-1539 (1983)
非專利文獻 2:SJ Hughes P McShane, Transplant Proceedings,37，3444-34445(2005)
非專利文獻 3:SJ Hughes，A Clark, P McShane, Transplantat1n,81(3)423-426(2006)
非專利文獻 4:E Linetsky et al.，Diabetes，46，1120-1123 (1997)
非專利文南犬 5:D Brandhorst et al.， Transplantat1n Proceedings，37(8)，3450-3451(2005)
非專利文獻 6:H Brandhorst et al.，Transplantat1n，87 (3)，370-375 (2009)
【發明內容】
發明要解決的課題
從生物組織分離細胞或細胞集合體時，不將作為分離對象的細胞等表面分解或損壞，通過蛋白質分解酶僅將構成生物組織的細胞間基質及臟器的各種結構蛋白質分解是不容易的。另外，如上所述，生物組織中的細胞間基質的狀態(特別是膠原蛋白的含量)根據物種、年齡、性別、組織、生活環境等的不同而不同。特別是關于膠原蛋白，年齡增加導致的物性的變化顯著。
雖然已知根據人的臟器的情況、年齡、性別、生活習慣、病歷等不同，對蛋白質分解酶的活性是不同的，但情況是至今未開發出決定最適合的分解酶的種類、量的方法，只能根據經驗決定酶的種類或酶反應時間來進行離析。關于胰島分離，醫務人員根據某協議將酶的量設為大致一定，僅將分解時間作為變量，通過目視確認胰臟的分解程度，并進行胰臟的酶處理。因此，通過作為對象的胰臟的狀態而獲得的胰島的數量和品質不統一。
鑒于上述情況，本發明的主要目的是提供一種能夠從生物組織中有效地穩定并分離具有高的生物活性的細胞的細胞分離方法。
解決課題的方法
為解決上述課題，本發明提供以下的方法。
[1]一種從生物組織分離細胞的方法，其特征在于，使用分解酶組合物，所述分解酶組合物通過在一定量的中性蛋白酶和/或來自梭菌屬(Clostridium, sp)的蛋白酶中，根據所述生物組織的主要蛋白質的組成加入該主要蛋白質的分解酶用量而形成。
[2]根據[I]記載的方法，其包括:決定所述生物組織的主要蛋白質的組成的步驟；在一定量的中性蛋白酶和/或來自梭菌屬(Clostridium, sp)的蛋白酶中，根據決定的組成加入所述主要蛋白質的分解酶用量，調制分解酶組合物的步驟；利用調制的分解酶組合物處理所述生物組織的步驟。
根據該方法，可以由生物組織