一種胎盤源母體間充質干細胞的制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種胎盤源母體間充質干細胞的制備方法，包括以下步驟：（1）胎盤源母體間充質干細胞的分離；和（2）胎盤源母體間充質干細胞的培養。其中，步驟（1）使用了trypLETM酶溶液分兩步處理胎盤組織；步驟（2）使用無血清培養基。本發明的方法經過短串聯重復序列（STR）圖譜分析為完全母體來源，經染色體核型檢查，細菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細胞純度鑒定，細胞生物學功能鑒定為合格。因此，本發明方法獲得的胎盤源母體間充質干細胞不含異種蛋白，可以滿足臨床使用的需要，尤其適合母親自己使用，也為建立優良的胎盤源母體間充質干細胞庫提供了技術保障。
【專利說明】一種胎盤源母體間充質干細胞的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種間充質干細胞的分離、培養的方法，特別是指一種一種胎盤源母體間充質干細胞的分離、制備的方法。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于發育早期中胚層和外胚層的一類多能干細胞，最初在骨髓中發現，因其具有以下特點:1)造血支持作用。作為造血微環境主要細胞成分一基質細胞系的干/祖細胞，MSCs與造血干細胞共同移植可促進造血干祖細胞的植入。2)免疫調控。MSCs不表達⑶80，⑶86，HLA-DR等協同刺激分子，體外可抑制混合淋巴細胞反應，對于預防和治療異基因造血細胞移植后引起的移植物抗宿主病，治療自身免疫系統疾病有重要意義。3)基因治療。由于MSCs體外擴增、增殖能力強，可以作為基因操作的干細胞平臺，加之MSC具有對腫瘤的靶向性，在腫瘤的基因治療中有著十分誘人的前景。4)多向分化潛能。在體外特定的誘導條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于組織工程。
[0003]目前，從胎盤、臍帶獲得間充質干細胞常用多步多酶消化法，如:盧國輝等《盧國輝，張世忠，陳強，等.人胎盤底蛻膜間充質干細胞的分離培養及其多向分化潛能的實驗研究.南方醫科大學學報，2011; 31 (2):262-265》采用雙酶消化加密度梯度離心法從足月胎盤底蛻膜中分離出呈克隆樣貼壁生長細胞，表達典型的MSCs表面抗原，但由于胎盤組織比較復雜，同時存在母體和胎兒的細胞，盧國輝等并未檢測所得到的為母體細胞。
【發明內容】
[0004]有鑒于此，本發明的主要目的在于一種對細胞損傷小、更快的得到完全來自母體的胎盤源間充質干細胞的制備方法。
[0005]本發明的技術方案概述如下:
[0006]一種胎盤源母體間充質干細胞的制備方法，其特征是由下述步驟組成:
[0007](I)胎盤源母體間充質干細胞的分離:取胎盤小心剝離底蛻膜組織，先用機械方法處理成小于0.5-1平方厘米的小片，用組織塊1-5倍體積的trypLE?酶溶液37°C消化組織塊0.3-0.5小時，后清洗去除消化液，該步目的為了去除小組織塊表面可能粘連的胎兒組織。我們再將第一步消化后的殘留組織塊，再用組織塊1-5倍體積的trypLE?酶溶液37°C消化組織塊0.5-1小時，得到消化后的混合液，將混合液用濾網過濾得到單細胞為主的懸液；將細胞懸液離心；通過分兩步處理，我們可以得到很純的母體細胞。
[0008](2)胎盤源母體間充質干細胞的培養:將上述細胞按0.5-2X IOVcm2的密度接種到培養瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養箱中進行原代細胞培養。所用培養基為無血清培養基，細胞培養到80-90%融合時，用trypLE?消化，按分種率1:2—1:10接種到新培養瓶中培養。經過數次傳代，間充質干細胞得到純化，可以將細胞作為原代傳代細胞庫凍存到液氮中長期保存。
[0009]本發明的優點:
[0010]本發明提供一種對細胞損傷小、更快的得到完全來自母體的胎盤源間充質干細胞的制備方法，與現有技術相比至少有以下優點:
[0011]I)本發明的方法更加簡便快捷，并能獲得完全來自母體的細胞:
[0012]本發明的方法只使用了二步消化的方法，更加方便和快捷，較盧國輝等的多步多酶消化法的方法簡單，且能得到完全來自母體的細胞。
[0013]由于胎盤由羊膜、葉狀絨毛膜(也稱叢密絨毛膜)和底蛻膜構成。羊膜:構成胎盤的胎兒部分，是胎盤的最內層，羊膜是附著在絨毛膜板表面的半透明膜；葉狀絨毛膜:構成胎盤的胎兒部分，占妊娠胎盤的主要部分；底蛻膜:構成胎盤的母體部分，占妊娠足月胎盤很小部分，底蛻膜表面覆蓋一層來自固定絨毛的滋養層細胞與底蛻膜共同形成絨毛間隙的底，稱為蛻膜板，從此板向絨毛膜方向伸出一些蛻膜間隔，一般不超過胎盤全層厚度的2/3，將胎盤母體面分成肉眼可見的20個左右母體葉。
[0014]由于胎盤結構的復雜性，使用現有技術的多步多酶消化法會導致分離過程污染母體或胎兒的細胞，獲得的異源細胞可能會引起人體免疫反應等問題，而本發明的方法則可以獲得來源單一的組織干細胞，如本發明后續實施例所示，通過使用短串聯重復序列(STR)分析，(稱DNA指紋圖譜，能靈敏的檢測出細胞交叉污染)，可以證明即使在分離如胎盤這樣多重來源組織細胞，本發明的方法也可以獲得完全來自母體的細胞。
[0015]2)本發明采用trypLE?進行消化組織，trypLE?消化細胞不需要用血清中和，對細胞損傷小，能最大可能的 保護間充質干細胞，不受損傷；，使其具有更高活率，如本發明后續實施例所示，本發明方法獲得的間充質干細胞可以更加有效進行成脂、成骨誘導分化。
[0016]3)本發明的間充質干細胞的培養和擴增方法中使用了無血清培養基，而現有技術中培養間充質干細胞為采用含2-20%血清的培養基，具有導致血清源性污染，批次間差異大、某些殘留的異種蛋白可能引起人體免疫反應等風險。
[0017]而本發明采用的無血清培養基(Serum Free Medium, SFM)是全部用已知成分組配的不加血清的合成培養基，為在含有細胞所需營養和貼壁因子的基礎培養基中加入適宜的促細胞生長因子，在保證細胞良好生長和提高細胞培養質量的同時，可避免血清批次間的質量變動，避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染，因此，特別適合在制藥生產的中的用途。
[0018]最后，本發明方法獲得的胎盤源母體間充質干細胞不含異種蛋白，可以滿足臨床使用的需要，尤其適合母親自己使用，也為建立優良的胎盤源母體間充質干細胞庫提供了技術保障。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為人胎盤源母體間充質干細胞形態圖；
[0020]圖2為人胎盤源母體間充質干細胞STR圖譜分析；
[0021]圖3為人胎盤源母體間充質干細胞流式表型圖；
[0022]圖4為人胎盤源母體間充質干細胞的成脂誘導分化圖；
[0023]圖5為人胎盤源母體間充質干細胞的成骨誘導分化圖；[0024]圖6為人胎盤源母體間充質干細胞抑制Y -干擾素分泌的能力檢測結果圖。【具體實施方式】[0025]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0026]實施例1人胎盤源母體間充質干細胞的分離、培養及原代傳代細胞庫凍存
[0027](I)用磷酸緩沖液(PBS)反復沖洗胎盤后,小心分離胎盤底蛻膜部分,再用PBS反復沖洗，去除殘留的血液，剪碎至小于0.5-1平方厘米的小塊；
[0028](2)根據組織塊的總體積加入I倍體積的trypLE? (Invitrogen, USA)混合酶溶液37°C消化組織塊0.3小時，在消化過程中用轉子攪拌；然后清洗去除消化液，再將第一步消化后的殘留組織塊，再用組織塊2倍體積的trypLE?酶溶液37°C消化組織塊0.5小時，得到消化后的消化液，
[0029](3)步驟(2)獲得的消化液用篩網過濾，先后用100目及200目的濾網過濾，去除未消化的組織；
[0030](4)離心，獲得細胞:離心機的轉速為1500g/min離心15min，獲得人胎盤源母體間充質干細胞；
[0031](5)將上述人胎盤源母體間充質干細胞按I-2X IOVcm2接種于塑料培養瓶，采用無血清培養基(L0NZA)，置37°C，5%C02培養箱培養，3_5天后換液，棄去非貼壁細胞，以后每3-4天半量換液。待細胞80%融合，trypLE?消化，按1:3傳代。
[0032](6)將P2代細胞用trypLE?消化，計數，用配制好細胞凍存保護液按3X IO6細胞/ml濃度重懸細胞，分裝入凍存管凍存；
[0033](7)取部分凍存細胞，用本領域所熟知的方法進行短串聯重復序列(STR)圖譜分析，染色體核型檢查，細菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細胞純度鑒定，細胞生物學功能鑒定，將所有項目合格的原代傳代細胞庫長期凍存備用。
[0034]結果:我們獲得的細胞形態為均一的長梭形(圖1)，進行短串聯重復序列(STR)圖譜分析，確認為母體來源細胞(圖2，以同一來源胎兒源的臍帶間充質干細胞為對照(圖2左半部分)，證明得到的胎盤源間充質干細胞為母體來源細胞(圖2右半部分))，將細胞進行流式檢測分析，其流式表型符合間充質干細胞特征(圖3)。
[0035]因此，可以確認獲得了一種母體來源的間充質干細胞。
[0036]實施例2人胎盤源母體間充質干細胞的擴增和制劑制備
[0037](I)從實施例1獲得的合格的原代傳代細胞庫取出含3X IO6細胞的凍存管，在37°C解凍復蘇細胞；
[0038](2)用無血清培養基(LONZA)按2X IOVcm2的密度接種到培養瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養箱中進行培養，細胞到80-90%融合時按1:3傳代，經過3次傳代；
[0039](3)在第三次傳代細胞融合度達90%時，用trypLE?消化細胞，計數，用配制好細胞保護液按合適濃度重懸細胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環境保存。
[0040](4)取部分細胞重懸液制劑用本領域專業人事熟知的方法進行細菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細胞純度檢查，細胞活力檢測、內毒素檢測、相關殘留物檢測。
[0041]結果:獲得的細胞無細菌、真菌和病毒的病原微生物污染，細胞純度檢查，細胞活力檢測、內毒素檢測、相關殘留物檢測均合格。
[0042]實施例3人胎盤源母體間充質干細胞的成脂和成骨誘導分化
[0043](I)成骨分化檢測:選取第4代胎盤底蛻膜間充質干細胞，常規消化離心后制成單細胞懸液，按2 X IO4/孔接種于24孔板，待細胞融合達70%時更換成骨培養基(Hyclone公司)，然后每3d換液I次,21d后菌素紅染色檢測成骨情況。
[0044](2)成脂分化檢測:選取第4代胎盤底蛻膜間充質干細胞，常規消化離心后制成單細胞懸液，按2 X IO4/孔接種于24孔板，待細胞融合達70%時更換成脂培養基(Hyclone公司)。然后每3d換液I次，21d后油紅O染色檢測成脂情況。
[0045]結果:成脂誘導的細胞連續培養，隨著時間的延長，脂滴逐漸增大融合，培養3周時，可見融合成團的脂滴充滿整個細胞，經油紅O染色可見被染成紅色的脂滴(圖4)。成骨誘導后培養3周以上，細胞基質礦化物逐漸出現，形成多層小結結構，可見明顯鈣化結節，經茜素紅染色后呈深紅色(圖5)。由圖可以看出，本發明獲得細胞更加有活力，具有更佳的成脂和成骨誘導分化能力。
[0046]實施例4人胎盤源母體間充質干細胞對活化淋巴細胞的Y-干擾素分泌抑制試驗
[0047]經供者授權同意后，無菌條件下采集健康供者外周靜脈血10ml，分離單個核細胞備用。將融合度為80-90%的胎盤源母體間充質干細胞以銫源照射20Gy，以2X IO4/孔和5 X IO3/孔兩種濃度接種于96孔板，在37°C，體積分數5%C02，飽和濕度培養箱中培養lh，待細胞貼壁后每孔加入IX IO5人外周血單個核細胞，2 μ L植物血凝素(10mg/L)與人胎盤源母體間充質干細胞共培養。72h后1600r/min離心lOmin，采集上清。ELISA檢測培養上清中Y-干擾素水平。
[0048]結果:經檢測人胎盤源母體間充質干細胞在1:5和1:20的濃度時均可以明顯抑制活化淋巴細胞分泌Y-干擾素的能力，在1:5時抑制率在75%。(圖6)。
[0049]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種胎盤源母體間充質干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)胎盤源母體間充質干細胞的分離:取胎盤組織，先用機械方法處理成組織塊小片，用trypLE?酶溶液37°C消化組織塊，清洗去除消化液后，再用trypLE?酶溶液37°C消化組織塊，得到消化后的消化液，過濾后將細胞懸液離心，即獲得胎盤源母體間充質干細胞； (2)胎盤源母體間充質干細胞的培養:將上述步驟(I)獲得的細胞按0.5-2X IOVcm2的密度接種到培養瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養箱中進行原代細胞培養，細胞培養到80-90%融合時，用trypLE?消化，按分種率1:2—1:10接種到新培養瓶中培養；經過數次傳代后，將細胞作為原代傳代細胞庫，凍存到液氮中長期保存。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中胎盤組織為來自母體的底脫膜部分。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中使用機械方法獲得組織塊小片的大小為小于0.5-1平方厘米。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中第一次用trypLE?酶溶液37°C消化組織塊的處理時間為0.3-0.5小時；第二次用trypLE?酶溶液37°C消化組織塊的處理時間為0.5-1小時。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中過濾方法為濾網過濾。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述濾網的目數為100目-200目。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中細胞培養所用培養基為無血清培養基。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中傳代次數為1-5代。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中凍存所用的凍存保護液含5-10%的DMSO和1-10%的人血清白蛋白和適量DMEM/F12，也可以使用商業化的凍存保護液。
10.一種如權利要求1-9任意一項所述的方法獲得的胎盤源母體間充質干細胞。
11.根據權利要求10所述的胎盤源母體間充質干細胞，其特征在于，所述的胎盤源母體間充質干細胞經過短串聯重復序列(STR)圖譜分析為母體來源；經染色體核型檢查，細菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細胞純度鑒定，細胞生物學功能鑒定為合格。
12.如權利要求1-9任意一項所述的方法獲得的胎盤源母體間充質干細胞在組織工程、制備治療免疫系統疾病的藥物以及組織再生修復中的應用。
【文檔編號】A61K35/50GK103451150SQ201310196516
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年5月24日 優先權日:2013年5月24日
【發明者】韓之海, 王濤 申請人:北京漢氏聯合生物技術有限公司