專利名稱：人脂肪來源的間充質干細胞在腎臟、眼底疾病中的用途的制作方法
人脂肪來源的間充質干細胞在腎臟、眼底疾病中的用途
技術領 域本發明一般涉及間充質干細胞的用途。具體而言，本發明涉及人脂肪來源的間充 質干細胞在腎臟和/或眼底疾病中的用途。
背景技術：
間充質干細胞(MSCs)由于其自我更新和多系分化的能力，被廣泛應用于多種疾 病的研究，人脂肪來源的MSCs (hAD-MSCs)由于其易獲得，易擴增且具有與骨髓源MSCs具有 類似的分化潛能，近年來成為再生醫學領域最為熱門的種子細胞。急性腎損傷以及由此引發的腎臟纖維化，是臨床上常見的病理過程。無論是各 種原發性腎小球疾病，還是糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等繼發性腎臟疾病都與腎臟纖維化 病變的程度密切相關。這些疾病能引起腎小管上皮細胞的凋亡、基底膜斷裂、腎間質炎 性細胞的浸潤、肌成纖維細胞的聚集，并在一些促纖維化因子的參與下，使細胞外基質 (extra-cellular matrix, ECM)成分生成增多、降解減少，腎間質纖維化產生，導致腎功能 嚴重受損。目前臨床上對腎臟纖維化的治療措施多集中在控制加劇腎功能惡化的危險因 素，如高血壓、高血糖、高血脂、高蛋白攝入等方面，而這不能從根本上改善病人的預后。視網膜變性疾病是眼科主要的致盲性疾病，代表疾病為視網膜色素變性 (retinitis pigmentosa, RP) 0視網膜色素變性為常染色體隱性遺傳為主的遺傳性疾病。 通過病理學觀察目前普遍認為，其主要致病機理為視網膜色素上皮細胞對視細胞外節盤膜 的吞噬消化功能障礙，致使外節盤膜崩解物殘留，堆積形成一層障礙物妨礙營養物質從脈 絡膜到視網膜的轉運，從而引起視細胞的進行性營養不良及逐漸變性和消失。但是引發這 一過程的原因，目前還不清楚，可能與基因異常、某些酶的缺乏及代謝障礙有關。目前臨床 對視網膜色素變性治療仍局限于使用血管擴張劑、維生素類、組織療法、神經營養、各種激 素等保守治療手段以延緩病情進展，還沒有行之有效的針對性治療手段。糖尿病視網膜病變(diabetic ratinopathy，DR)是糖尿病最常見和嚴重的并發癥 之一。世界衛生組織公布，糖尿病視網膜病變是全世界導致視力缺損和失明的第二大因素。 在美國，糖尿病視網膜病變占40歲以上成人失明原因的25%，糖尿病患者致盲的危險性是 非糖尿病的25倍。世界衛生組織已經將糖尿病視網膜病變確定為在世界范圍內造成視力 損害及失明的一個主要原因。長期以來，科研人員對DR的發病機制進行了大量的研究，但 迄今為止尚未完全闡明。特發性黃斑裂孔是正常眼自發形成的黃斑全層神經上皮缺失，不伴有眼外傷和其 他原發病因，其發病機制仍未完全闡明。從上個世紀70年代開始，人們一直致力于黃斑裂 孔治療的研究。并大幅提高了裂孔解剖閉合率。然而目前已發表的大規模臨床研究文獻 中，并沒有提出能夠達到100%裂孔閉合率的方法。分期較晚、裂孔重復裂開的復雜黃斑裂 孔仍然是眼底疾病治療的難點之一。但目前還沒有將hAD-MSCs應用于眼底疾病移植治療 的文獻發表。因此，人們一直尋找治療腎臟損傷相關疾病和眼底疾病的新的藥物和治療方法。
發明內容
本發明的一方面提供人脂肪來源的間充質干細胞在制備治療腎臟和/或眼底疾 病的細胞制劑中的用途。本發明中，人脂肪來源的間充質干細胞可治療的腎臟疾病包括急性腎損傷、腎臟 纖維化、腎小管上皮細胞損傷。本發明中，人脂肪來源的間充質干細胞可治療的眼底疾病包括視網膜變性、糖尿 病視網膜病變、視網膜裂孔。優選地，本發明人脂肪來源的間充質干細胞可治療的視網膜變性為視網膜色素變 性。在本發明中，用于治療腎臟和/或眼底疾病的細胞制劑可包含的人脂肪來源的間 充質干細胞數目可根據公知技術確定，優選地，每單位細胞制劑可包含1XIO5至1 X IO6個 人脂肪來源的間充質干細胞。本發明中，治療腎臟和/或眼底疾病的細胞制劑具有本領域公知的含義，例如用 于治療腎臟和/或眼底疾病的細胞制劑可以使用本發明提供的人脂肪來源的間充質干細 胞作為種子細胞。本發明的細胞制劑還可以包括用于治療腎臟和/或眼底疾病所需要本領 域公知的其他成分，如適合患者接納的材料或基質，該基質可作為細胞移植用的三維模板， 具有特定的孔徑，例如申請日為2004年6月7日的中國發明專利號為200480019202. 5，授 權公告號為CN100447186C的發明專利中所描述的基質。還可以包括生物可降解聚合物如 白蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、明膠等，并制作成治療用途的試劑盒的形式。本發明的細胞制劑滿足本領域技術標準，例如符合國家食品藥品監督管理局《人 體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則》等相關標準。優選地，本發明提供的人脂肪來源的間充質干細胞的免疫表型為⑶11a，⑶31， CD34, CD45, HLA-DR 為陰性，CD29, CD44, CD105, CD166, Scar-1, Flk-I 為陽性，并且低表達 MHC II類分子。本發明所提供的細胞制劑優選地為靜脈注射劑。在視網膜眼底裂孔的治療中，本發明所提供的細胞制劑優選地為視網膜下注射 劑。
圖1.流式細胞檢測hAD-MSCs表型及周期。A :hAD_MSCs表型。B 第三代hAD_MSCs 細胞形態(200X)。C hAD-MSCs細胞周期。圖2.病理學觀察。H&E染色結果顯示，移植組3天(B)，對照組3天(A)，移植組 21天(D)，對照組21天(C)，對照組6個月(E)，移植組6個月(F)，標尺為50 μ m。 圖3. Masson染色顯示膠原沉積。A 對照組10天；B 移植組10天；C 對照組6 個月；D 移植組6個月。E :I/R后10天和6個月移植組的膠原沉積量明顯低于對照組，(ρ < 0. 05)。標尺為 50 μ mo 圖4. hAD-MSCs和mBM_MSCs在損傷腎臟組織中的分布。A =RT-PCR檢測人特異性 β -actin表達，I/R后3天(3)，10天(5)，6個月(7)移植組腎臟被檢測，正常C57BL/6小鼠和同一時間點對照組腎臟(1，2，4，6)作為對照，hAD-MSCs作為陽性對照(8)。菲立磁的 普魯士藍染色顯示，I/R后3天(B)，腎臟皮質區小管⑶和間質(H)處有呈藍色顆粒樣的 陽性細胞存在，10天結果與三天類似(C)。抗人核抗體檢測結果與之類似(E，I)。β-gal, 綠色熒光蛋白抗體分別檢測Rosa鼠(F，G)和EGFP轉基因小鼠(J，K)來源的供體MSCs細 胞的分布情況。L-O為陰性對照。標尺為50 μ m。圖5.植入的hAD-MSCs在I/R模型腎臟中分化為腎小管上皮細胞。免疫熒光雙染 顯示，移植組3天腎臟中檢測到抗人核陽性的供體細胞(紅色熒光)，同時表達上皮細胞的 標志pan-CK (綠色熒光)(A-C)。對照組腎臟作為陰性對照(D-E)。標尺為50um。G =RT-PCR 檢測，1，正常C57BL/6小鼠腎臟；2，hAD-MSCs ；3，對照組3天；4，移植組3天；5，HK2細胞。 標尺為50 μ m。圖6.體外誘導培養hAD-MSCs可以分化為上皮樣細胞。A 誘導前梭形hAD-MSCs ； B hAD-MSCs誘導后呈多變形上皮樣；抗CK18抗體免疫熒光染色誘導后見陽性細胞(C，綠 色熒光)，誘導前hAD-MSCs，作為陰性對照(D)0 RT-PCR檢測誘導后細胞表達CD18 (2)， hAD-MSCs為陰性對照(1)，HK2為陽性對照(3)。標尺為50 μ m。圖7.移植細胞劑量與植入比例的關系。用人特異性β -actin進行RT-PCR檢測， 低劑量組和高劑量組的供體細胞植入比例沒有顯著差別。P < 0. 05。圖8. hAD-MSCs促進腎臟增殖。抗小鼠PCNA單克隆抗體免疫組化染色，陽性細胞 為棕色核陽性。A，B, C，D分別為對照組3天、移植組3天、對照組10天、移植組10天。免 疫熒光雙染抗人特異性核抗體(紅色熒光)和抗PCNA抗體(綠色熒光)，E-G為移植組3 天，H-J為對照組3天。標尺為50 μ m。圖9. hAD-MSCs促進腎臟BMP7高表達。抗小鼠BMP7單克隆抗體進行免疫組化染 色，DAB顯色，蘇木素復染，陽性細胞為棕色胞漿染色。A，B分別為對照組1天和移植組1天； C，D為對照組3天和移植組3天。E =RT-PCR結果顯示I/R后1天和3天移植組BMP7表達 明顯高于對照組。標尺為50 μ m。圖10 病理學觀察。hAD-MSCs移植后1天，移植組(B)和對照組(A)視網膜病理 結果顯示破壞程度沒有差別；移植后1周對照組(C)外核層出現塌陷，移植組破壞程度較輕 (D)；隨后2周、3周、6周移植組(F，H，J)的損傷修復情況均好于對照組(E，G，I)。標尺長 度為50 μ m。圖11 hAD-MSCs的植入和分化。A-C 抗人核陽性的供體細胞(紅色熒光)同時表 達RPE特異的標志MITF (綠色熒光)；D-F:抗人核陽性的供體細胞(紅色熒光)同時表達 感光細胞特異的標志Rhodopsin (綠色熒光)；G-I 抗人核陽性的供體細胞(紅色熒光)同 時表達血管內皮細胞特異的標志vWF (綠色熒光)。標尺為50 μ m。圖12. hAD-MSCs對BRB功能的影響。STZ模型小鼠的BRB出現滲漏，造模后3個月 BRB功能一直處于異常狀態。移植組從移植后1周開始，BRB功能有所恢復，之后的2周，4 周BRB功能逐漸恢復到正常水平(ρ < 0. 01)。 圖13. hAD-MSCs對血糖的影響。與對照組相比較，移植組的血糖從移植后1周下 降，到移植后4周，血糖水平接近正常值(ρ < 0. 01)。圖14. hAD-MSCs的植入和分化。A-C 抗人核陽性的供體細胞(紅色熒光)同時表 達感光細胞特異的標志Opsin (綠色熒光)，標尺長度50 μ m ；D-F 抗人核陽性的供體細胞(紅色熒光)同 時表達膠質細胞特異的標志GFAP (綠色熒光)，標尺長度50 μ m。圖15. OCT觀察。兔眼行裂孔術后的OCT檢查的結果A，2天；C，4天；E，12天；G， 20天；移植組分別為=B, 2天；D，4天；F, 12天；H, 20天。圖16.病理結果。術后1個月，H&E染色顯示，移植組(A)裂孔處組織略高于兩 側正常視網膜，可見細胞不規則排列；對照組(B)裂孔處低于正常視網膜組織，細胞排列無 序。C為正常兔眼視網膜結構。標尺為50 μ m。圖17.裂孔處細胞免疫熒光染色。術后1個月對照組裂孔處主要為GFAP陽性的 膠質細胞(A)，未見Opsin陽性和PKC陽性的細胞(D，G)；移植組除大量GFAP陽性的膠質細 胞外(B)，還可觀察到少量Opsin陽性(E)的感光細胞，極少量PKC陽性的雙極細胞(H)；正 常視網膜的GFAP (C)、Opsin (F)和PKC染色(I)。標尺為50 μ m。圖18. hAD-MSCs在視網膜裂孔的分布分化。hAD_MSCs移植后4周，可見少量抗人 核陽性(紅色熒光)供體細胞位于視網膜內核層，并且表達膠質細胞的標志GFAP(綠色熒 光)(A-C)。標尺為10 μ m。尚可見可見少量抗人核陽性(紅色熒光)供體細胞位于視網膜 外核層，并且表達感光細胞的標志Opsin (綠色熒光)(D-F)。標尺為50 μ m。
具體實施例方式本發明中使用的儀器和試劑均是本領域技術人員公知的，可通過商業機構購買獲 得。本發明所使用的方法，如HE染色、Masson三色染色、免疫組化、菲立磁染色、免疫熒光 染色等均為本領域公知的方法，可通過教科書或相關文獻的描述進行，本發明說明書中有 描述的，參照本發明中描述的方法進行。實施例1 相關實驗方法1. 1、人脂肪來源的MSCs培養及擴增取成人的脂肪組織，用D-Hank’ S液反復沖洗，剪碎，0. 2% I型膠原酶37°C，消化 30分鐘，用大量D-Hank，S液洗滌終止I型膠原酶的作用，離心1000r/m，IOmin后，用100 目的濾網過濾，并用移液管反復吹打，使之成為單細胞懸液，計數，接種密度為2X 106/ml， 用完全培養基(含 58% DMEM/F12+40% MCDB-201、2%胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGFUOng/ ml PDGFUX 胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1 X 亞油 酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovineserum albumin, LA-BSA)，50 μ M β 巰基乙醇， 2mM L-谷氨酰胺，100 μ g/ml青霉素和100U/ml硫酸鏈霉素)，置37°C，5% CO2培養箱培養， 1天后換液，棄去未貼壁的細胞，以后每三天半量換液。當細胞達80 90%融合(約10天 左右)時，0.25%胰酶常規消化傳代。1. 2、小鼠骨髓來源的MSCs的分離與培養1、動物骨髓的取材。(1)用頸椎脫臼斷頸法處死小鼠。在無菌條件下取股骨和脛骨，除去骨表面附著的 肌肉組織，用D-Hank’ s液浸泡(或其它細胞培養用的平衡鹽溶液，添加青霉素100IU/ml， 鏈霉素 100ug/ml)。(2)用器械去除股骨近端和脛骨遠端，暴露骨髓腔。然后除去股骨、脛骨另一端的 骨骺，并用Iml注射器在骨端的生長面上開一個小孔。(3)用Iml注射器吸Iml含血清的基礎培養液，將針頭從上述小孔插入骨髓腔中，注入培養液，從骨的另一端收集沖洗出來的骨髓。(4)將收獲的全部骨髓用注射器反復抽吸，以打散組織成為細胞懸液。(5)收集細胞懸液，離心。用干細胞培養液重懸沉淀的細胞。2、接種及培養 (1)用干細胞培養液調節細胞密度。將6X IO7個骨髓有核細胞接種到T25培養瓶 中。在37 °C、5 % CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養。(2)原代接種后24小時，除去未貼壁的造血細胞，用D-Hank’S液換洗，半量換液。 以后每隔3 4天換液1次。(3) 12 14天后，當形成一些較大的細胞克隆時，用D-Hank’S液將培養的細胞洗 2遍。加入0. 25%胰酶(含0. 01 % EDTA)消化液，室溫消化，顯微鏡下觀察，待細胞變形時， 用含血清培養液或牛血清終止胰蛋白酶的作用。(4)用吸管輕輕吹打培養瓶的細胞貼附面，使細胞從培養瓶壁上脫離下來，制成細 胞懸液。(5)將細胞以培養基重懸，將懸液接種到新的培養瓶中，于37°C、5% CO2、飽和濕度 的CO2培養箱中培養。待傳代的細胞生長密度達到80% 90%時，即再次傳代。1.3、細胞周期的測定將人脂肪來源的間充質干細胞消化計數，1 X IO6細胞，70%冷乙醇4°C固定30min， PBS液洗滌細胞二遍，5 μ g/ml PI室溫染色5min，用流式細胞儀(FACSVantage型)檢測， ModFIT軟件分析結果。1. 4、流式細胞儀鑒定細胞的表型用間接免疫熒光法檢測成人脂肪來源的MSC的免疫表型。針對細胞表面抗原，細 胞用胰酶消化后，用含0. 5 %的牛血清白蛋白的PBS沖洗，加入一抗4°C孵育30min。一抗為 小鼠抗人的單克隆抗體CD105、CD29、CD34、CD31、CD44、CD45、HLA-DR、Flk-I。為檢測細胞 內抗原Flk-I，細胞與一抗孵育之前，用1 %多聚甲醛4°C固定15min，并在室溫下用0. 1 %的 皂角素透膜1小時。我們選用同種同型非相關IgG抗體作為陰性對照。細胞用洗液PBS洗 過后，加入FITC標記的二抗4°C孵育30min。細胞洗兩次，并懸浮在500ul的PBS中，置于 冰上待流式細胞儀檢測。1. 5、hAD-MSCs體外誘導為上皮樣細胞分離C57BL/6小鼠的腎小管上皮細胞，以5X105/ml密度重懸于DF12培養基中。 經IOGy照射后，置于培養箱中培養12小時。收集上清，與DF12以1 4比例混合，加入 20ng/mlHGF、10ng/mlFGF-4和2%胎牛血清作為誘導培養基。將第三代hAD-MSCs以2X IO4/ cm2密度接種，培養3周。未經誘導的hAD-MSCs作為陰性對照，人腎小管上皮細胞系HK2作 為陽性對照。1. 6、腎臟損傷模型和MSCs輸入雄性C57小鼠分為2組(20只/組)，8周齡，1 %戊巴比妥鈉腹腔麻醉，用無菌剪在 腹部右側剪開2cm左右的切口，暴露右側腎臟及周圍組織，用無損傷血管夾鉗夾右側腎蒂， 計時，在35分鐘松開血管夾，恢復血流。關閉腹腔，縫合切口。術中以及關腹前用無菌生理 鹽水補充液體。術后24小時內，移植組的小鼠經尾靜脈注射第3-5代的MSCs，lX106/只； 對照組術后僅尾靜脈輸注等量的生理鹽水。分別在I/R后3天、10天、3周、2個月和6個月斷頸處死小鼠，取出右側腎臟，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。另外一組腎臟則用液 氮冷凍，保存用于提取總RNA。1. 7、視網膜變性大鼠模型的建立及hAD-MSCs植入Lewis大鼠60只，80_100g，雄性，按50mg/Kg碘酸鈉的劑量經尾靜脈注射1 %碘 酸鈉液，一周后隨機分為6組，每組中5只大鼠經尾靜脈注射hAD-MSCs細胞懸液1ml，約 1 X IO7個hAD-MSCs，另5只大鼠注射等量的PBS液Iml作陰性對照。移植后1天、1周、2周、 3周、6周和3個月，分別將一組大鼠過量麻醉處死，手術顯微鏡下觀察大鼠眼底情況。摘除 眼球，10%中性福爾馬林溶液固定過夜，去除眼前節，梯度脫水，石蠟包埋，將眼球12點位 置向上做冠狀連續切片，分別作HE染色、免疫熒光檢測和免疫組化檢測。1. 8、STZ誘導的大鼠糖尿病模型的建立及hAD-MSCs植入60只大鼠空腹12h后，按60mg/kg的劑量腹腔一次性注射2% STZ溶解于的檸檬 酸緩沖液，PH值4. 2-4. 5)，7日后測血糖> 16. 7mmol/L，尿糖+++或++++者確定為糖尿病 大鼠模型。模型建立3月后，移植組尾靜脈注射hAD-MSCs，IX IO7/只，0. 5ml ；對照組以等量 的生理鹽水注射。1. 9、兔視網膜裂孔模型的建立及hAD-MSCs植入1、動物麻醉速眠新Iml肌肉注射，3%戊巴比妥Iml耳緣靜脈注射行基礎麻醉，鹽酸丁卡因滴 眼液滴眼表面麻醉。2、手術操作手術器械高溫消毒。連接灌注、氣液交換設備及玻璃體切除設備。將動物置于顯 微手術操作臺上，置左眼于手術顯微鏡操作視野下，鋪巾，充分散瞳。置開瞼器將眼瞼撐開， 用眼科剪打開結膜，固定鏡環，安放眼底鏡。在手術顯微鏡下檢查眼底有無異常。用尖刀于 耳側距角膜緣2. 5mm處做鞏膜切口，固定灌注頭。于鼻側同樣位置插入玻璃體切割頭，在手 術顯微鏡直視下充分切除玻璃體。玻切頻率450HZ，最大吸力400mmHg。玻璃體切除干凈 后，于視盤下方約2. Omm處，將毛細玻璃管小心插入視網膜下，緩慢注入生理鹽水，形成約 1. 5mm大小小泡，插入笛針垂直抵于小泡上，用最大負壓快速吸引，形成約1. 5mm左右大小 視網膜缺失。打開氣液交換開關，設送氣壓力40mmHg，充分氣液交換，笛針吸引使網膜復位。 取出灌注頭，縫合鞏膜切口、結膜。涂抹紅霉素眼膏預防感染。3、hAD-MSCs移植將細胞懸液混勻，用微量注射器吸取人hAD-MSCs懸液至需要 量，換氣鏡檢查眼底，在手術顯微鏡直視下將微量注射器于鞏膜切口處小心插入。在裂孔表 面緩慢注入hAD-MSCs懸液10 μ 1，細胞數約1 X IO5。4、對照組換用另一只微量注射器注入10 μ 1生理鹽水，方法同上。5、術中眼底檢查術中手術顯微鏡下觀察可見裂孔處網膜缺失，脈絡膜血管較正常，視網膜處更清 晰，裂孔周圍Imm范圍內網膜稍隆起，該處脈絡膜血管模糊不清。注入hAD-MSCs后，在玻璃 體內，網膜孔及附近網膜上方可見渾濁細胞懸液。1. 10、OCT和眼底檢查 手術后第2、4、8、12、20和32日對每只術眼行三維OCT檢查，掃描范圍裂孔周圍6mm視網膜。每只眼不同時間均取裂孔中心同一平面截取二維視網膜裂孔OCT圖像，比較 不同天數裂孔處視網膜厚度變化。比較相同天數hAD-MSCs移植組與對照組裂孔形態異同。 同時拍攝眼底彩照。1.11、RT-PCR1、將凍存的組織研磨碎后放入1. 5mLEp管中。2、加入Trizollml于Ep管中震蕩。3、加入氯仿200 μ L，劇烈震蕩15s，靜置20min。4、12000rpm，離心 15min。5、移取上清至新的Ep管中，加入等量異丙醇，混勻后靜置IOmin。6、12000rpm，離心 lOmin。7、去上清，用75%乙醇700ul洗沉淀，7500rpm離心5分鐘，棄上清，控干。加入去 離子水溶解RNA。8、測量RNA的純度和含量。9、取 2yL cDNA 模板，力口入 buffer 2 μ L, Mg2+(50mM) 1. 2μ L,5'和 3'引物各 1 μ L, dNTP 2 μ L，Taq酶0.2 μ L，純水10. 6 μ L，進行PCR反應。所用引物分別為β-actin F，5，-GCT CCT CCT GAG CGC AAG TA-3，R，5， -GAT GGA GGG GCC GGA CT-3，CK18 F，5，-CGC ATC GTC TTG CAG ATC GAC—3，R，5， -GCT GAG ACC AGT ACT TGT CCAG-3，human β—actin F，5，-CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA—3，R，5， -AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA-3，PCR條件為94°C IOmin ；94°C變性 40s，60°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，循環 34 次； 最后72°C延伸lOmin。10,PCR結果進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓75伏，時間30min。觀察電泳結果。1. 12、實時定量 RT-PCR我們應用Takara公司SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，在ABI7500實時定量PCR 儀上進行Real time RT-PCR實驗。為了防止提取的總RNA中污染基因組DNA，對實驗結果 產生干擾，我們所用的引物對均跨越內含子，引物序列如下human β-actin F，5，-CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA-3，；R，5， AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA—3，；BMP7F，5，-ACG GAC AGG GCT TCT CCT AC-3，，R，5， -ATG GTG GTA TCG AGG GTG GAA—3，。反應在25μ 1 體系中進行，包含 1μ 1 模板 cDNA，12. 5μ 1 2XSYBR Green I MasterMix, 0. 5μ 1 ROX校正染料，200nM上、下游引物。條件為95°C預變性IOs ；95°C變性 5s，60°C退火，延伸40s，循環40次。反應結束后，溶解曲線分析和瓊脂糖電泳證實產物的特 異性，每對引物的反應均包括一個無模板對照。我們以0-皿^11為內參，1 ^-7-(3為校正 器(calibrator)，采用2_[Δ 法來計算MCF_7_ih細胞基因表達的相對值，公式如下基因 的相對值=2_[ΔΔα]，AACt= ACtsample-ACtcalibrator ； Δ Ct = Ctgeneofinterest-Ct 0_actinO 我們 對每份模板的每個基因都設置了 3個重復孔，獨立的實驗重復至少3次。
1. 13、伊文思藍法1、制備 伊文思藍在甲酰胺中不同濃度的標準曲線。2、按1. 33ml/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉。3、麻醉后將大鼠固定在解剖臺上，鈍性分離右側頸靜脈和頸動脈，分別留置靜脈 和動脈插管，用100IU/ml的肝素鹽水潤管。4、按45mg/kg的劑量從右側頸靜脈注射伊文思藍染料，10秒鐘注入。5、2分鐘后通過頸動脈取血0.2ml。6、注射后每20分鐘從頸動脈插管取血0. 2ml，直到120分鐘時自左心室取血得到 最終血漿濃度；7、打開大鼠胸腔，左心室灌注37 °C的檸檬酸鈉緩沖液(pH值4. 5)，壓力為 1 OOmmHg，2 分鐘；8、灌注后立即取出大鼠眼球，顯微鏡下分離出視網膜；9、視網膜在烘箱鐘干燥1小時，稱重后將視網膜置于0.3ml甲酰胺溶液鐘，70°C保 溫10小時；10、4°C離心，l2000rpm，45 分鐘，取出上清；11、取50ul上清用分光光度計測量620nm和720nm的吸光光度值，計算凈A值= A620nm-A720nm ；12、將各次動脈血標本混勻，4°C離心10000rpm，20分鐘，取上清液，用甲酰胺稀 1 500稀釋，分光光度計測量，同上；13、依照標準的伊文思藍在甲酰胺鐘的公式，計算各個標本中伊文思藍的濃度；根據下列公式計算BRB損傷情況
伊文思藍(Hg) /視網膜重量(g)_
伊文思藍的血漿平均濃度(ug) /血漿(ul) x2 (h)實施例2 人脂肪來源的間充質干細胞在腎臟缺血再灌注模型中的作用及機制的 研究2. 1、培養的hAD-MSCs的形態和表型從人脂肪中分離得到的MSCs在原代培養中，有兩類細胞，一種為成纖維細胞樣， 分散生長；另一種為內皮細胞樣，呈多角形，緊密生長。經過傳代，內皮樣細胞逐漸減少，傳 至第2代時，基本消失，視野中都為梭形細胞(圖1.B)。流式表型分析，hAD-MSCs高表達 ⑶29、⑶44、⑶105和Flk-I，而造血及內皮標志(⑶31、⑶34和⑶45)為陰性，并且其低表達 MHC II類分子(圖1. A)。細胞周期分析發現，多數hAD-MSCs都位于G0/G1期(圖1. C)。 我們分離培養的hAD-MSCs，具有多系分化潛能，免疫表型⑶11a，⑶31，⑶34，⑶45，HLA-DR 結果為陰性，⑶29，⑶44，⑶105，⑶166，Scar-1, Flk-I為陽性，體外誘導分化結果顯示， hAD-MSCs在體外可以分化為上皮樣的細胞，與體內實驗結果一致。2. 2、人脂肪來源的MSCs在I/R模型中的作用2. 2.1、病理結果我們的實驗采用了腎臟缺血再灌注模型，模型小鼠分為兩組，移植組和對照組，分 別在損傷后24小時內，經尾靜脈注射給予1 X 106hAD-MSCs和等體系的生理鹽水。移植后3天、3周、以及6個月，分別取兩組小鼠的右側腎臟進行病理檢測。H&E染色后觀察發現I/R 后3天，對照組腎臟近曲小管出現水腫，周圍有炎細胞浸潤，但是沒有顯著的壞死(圖2. A)； 而移植組腎臟形態結構基本正常(圖2. B)。3周后，對照組腎間質區大量炎癥細胞浸潤，小 管上皮細胞壞死，小管結構喪失，出現纖維化(圖2. C)；而移植組，腎間質區僅有少量炎癥 細胞，小管結構完整(圖2. D)。造模后6月，移植組的腎臟結構基本修復(圖2. F)，而在對 照組腎臟切片中可見腎小球聚集，形成纖維化修復(圖2. E)。2. 2. 2、膠原染色為了定量評估兩組小鼠的纖維化癥狀，進一步進行Masson三色染色，并通過膠 原沉積面積與組織總面積的比值(膠原沉積率)量化評估纖維化程度(圖3. E)。結果顯 示，I/R后10天處死的小鼠(對照組)腎臟出現大量膠原沉積(圖3. A)，膠原沉積率為 0. 37549士0. 03111 ；而在缺血再灌注損傷后給予hAD_MSCs治療的小鼠腎臟，10天后膠原 量明顯較對照組少(圖3. B)，膠原沉積率為0. 10997士0. 02045 ；相應的，I/R六個月移植 組的膠原沉積量為0. 54712 士0. 03190 (圖3. D)，遠遠低于對照組的0. 19217 士0. 06067 (圖
3.C)。由此可見，供者來源的hAD-MSCs植入一定程度上改善了腎臟缺血再灌注損傷的小鼠 腎臟組織，并且能夠減少膠原分泌積聚，有效的抑制了纖維化的形成。2. 3hAD-MSCs的植入與分化2. 3. 1、hAD-MSCs在模型小鼠腎臟組織中的分布我們將菲立磁標記的人脂肪來源的間充質干細胞(hAD-MSCs)移植到I/R模型小 鼠中。RT-PCR結果顯示，I/R后3天和10天，移植組腎臟表達人特異性的β-actin(圖
4.A)。菲立磁的普魯士藍染色顯示，I/R后3天，腎臟皮質區小管(圖4. D)和間質(圖4. H) 處有呈藍色顆粒樣的陽性細胞存在，10天結果與三天類似(圖4. C)。因此我們選擇3天這 個時間點進行檢測。通過免疫組化方法，用抗人核抗體檢測人源細胞在小鼠腎臟的分布，結 果與之類似(圖4. E，I)。為了與研究報道有所比較，我們分別將Rosa鼠和EGFP轉基因小鼠骨髓來源的間 充質干細胞(mBM-MSC)，輸注到缺血再灌注損傷的模型鼠，分別定義為Rosa移植組(Rosa mice-donor group)和 GFP 移植組(EGFP mice-donor group)。分別在 I/R 后 3 天取各組的 腎臟組織進行檢測。通過免疫組織化學方法，用β _gal，綠色熒光蛋白抗體分別檢測Rosa 鼠(圖4. F，G)和EGFP轉基因小鼠(圖4.G，K)的供體MSCs細胞的歸巢情況，如圖所示， I/R后3天在腎皮質小管及間質處均可以看到陽性細胞分布。上述實驗結果提示植入受損腎臟組織的異體MSC可植入到在受損腎臟的間質和 皮質區小管。2. 3. 2、植入到腎臟的hAD-MSCs表達小管標志 在上面的結果中，觀察到植入的MSC分布在腎臟小管和間質中，為了進一步驗 證處于小管位置的外源性細胞的確分化為小管上皮細胞，用pan-CK和抗人核抗體對 hAD-MSCs移植后3天的腎臟組織切片進行免疫熒光雙染，結果顯示，分布于小管的抗人核 陽性的供體細胞(紅色熒光)pan-CK染色同時呈陽性結果(綠色熒光)，表明體內注射MSC 可以分化為腎臟小管上皮細胞(圖5.A-C)。為了驗證這一結果，用RT-PCR的方法檢測移 植后3天的腎臟組織，結果顯示，在移植后3天，移植組的人特異的β -actin表達，且同時 表達人特異的上皮表達基因CK18 ；對照組顯示為陰性(圖5. G)。說明我們移植到受體鼠的hAD-MSCs可以分布到缺血再灌注損傷的腎臟，并且表達上皮特異基因。上述結果表明移植 到受損腎臟組織的hAD-MSCs可以直接分化為腎小管上皮細胞，參與對損傷腎臟的修復。2. 3. 3、MSC可在體外誘導為上皮樣細胞因為對于MSC是否可以分化為腎小管上皮等上皮細胞存在較大爭議，將hAD-MSC 擴增后以腎小管上皮誘導培養基培養3周，光學顯微鏡觀察可見，經誘導的細胞形態明顯 改變，梭形細胞逐漸變短，最終成為典型的上皮樣多邊形細胞(圖6. B)，免疫熒光顯示約 60%的細胞表達pan-CK(圖6. C)，同時RT-PCR結果顯示CK18表達陽性(圖6. E)。這部分 結果證實了 MSC細胞群具有向上皮分化的潛能，與體內結果相互印證。2. 3. 4、植入細胞數量與分布比例的關系在確認了 hAD-MSCs在腎臟組織損傷早期確實能夠植入，并且能夠分化為腎小管 上皮細胞之后，我們猜想，引發對于細胞是否直接分化的爭論的根源可能與移植數量相關。 我們分別將1 X IO5和1 X IO6個菲立磁標記的hAD-MSCs經尾靜脈移植到模型鼠中，移植后 三天取材，進行普魯士藍染色和相對定量real time PCR檢測。普魯士藍染色顯示，兩組切 片的陽性細胞均在腎臟小管和間質分布，與之前結果相同，而高劑量組切片上陽性細胞數 量高于低劑量組，但以半定量RT-PCR量化結果發現，高劑量組人來源的看家基因表達量雖 然較低劑量略高，但沒有統計學差異(圖7)。以上結果說明移植細胞的數量與MSC在腎臟 組織分布有一定的比例關系，但是對于細胞分布和分化的性質不產生根本影響。2. 4促進增殖2. 4. 1、分化的hAD-MSCs并非直接參與修復的主要成員我們用PCNA抗體檢測了腎臟缺血再灌注后移植組和對照組細胞增殖的情況。免 疫組化結果顯示，I/R后3天，接受hAD-MSCs移植的小鼠(移植組)腎臟增殖細胞的數目 (圖8. B)明顯高于對照組(圖8. A)；而到第10天，實驗組增殖細胞的數量減少(圖8. D)， 對照組明顯增加(圖8. C)。這一結果表明，hAD-MSCs的確能夠通過促進增殖，加快腎臟組 織修復。為了確定向腎小管上皮分化的hAD-MSCs是否直接對受損腎臟進行了替代性修復， 這些增殖的細胞是否即是向腎小管上皮分化的hAD-MSCs，我們進行了 PCNA和抗人核抗體 的免疫熒光雙染。染色結果顯示，雙陽性的細胞占的比例很少，也就是說供體細胞本身很少 在大量增殖，但同時也可以觀察到，供體細胞較多分布的區域與增殖細胞較多分布的區域 是吻合的(圖8. E-G)。這些結果說明，hAD-MSCs可能通過直接分化為腎小管上皮細胞參與修復，但并不 是其修復受損腎臟組織的主要成員，而可能是在通過某些途徑激活內源性的修復，加快I/R 損傷后腎臟的修復中起重要作用。2. 4. 2、hAD-MSCs 的植入促進 BMP7 表達 實時定量RT-PCR方法檢測I/R后1天和3天，移植組和對照組腎臟組織中BMP7 表達，結果顯示，移植組BMP7的表達量明顯高于對照組(圖9. E)。我們進一步用抗BMP7抗 體進行了免疫組織化學染色，腎皮質的小管和腎小球的足細胞可見陽性結果(圖9. B，D)。 可見，hAD-MSCs的植入促進了損傷腎臟BMP7高表達，從而促進腎臟內源性修復。實施例3 hAD-MSCs在視網膜變性大鼠模型中的作用3. 1、hAD-MSCs移植后治療效果的病理評估正常大鼠視網膜色素上皮層完整，PRE細胞單層扁平，排列整齊連續，光感受器細胞外節縱行規律排列，視網膜各層清晰。碘酸鈉注射后，視網膜RPE細胞首先受到破壞， 如圖所示，注射后1天RPE細胞數量開始減少，光感受器細胞外節層排列開始出現紊亂。 hAD-MSCs移植組(圖10. B)，與對照組(圖10. A)視網膜破壞程度和修復情況基本沒有差 別。碘酸鈉尾靜脈注射后3天，對照組RPE細胞進一步減少，光感受器細胞外節層薄厚不均 勻，在RPE層上方的光感受器細胞外節層里有少量巨嗜細胞出現，同時在RPE層上方可見大 量細胞碎片堆積，視網膜外核層變薄，細胞核數量減少，可見外核層塌陷；同一時間點移植 組RPE細胞較多，光感受器細胞外節層薄厚均勻，在RPE層上方的光感受器細胞外節層里基 本不能觀察到巨嗜細胞的分布，RPE層上方少見細胞碎片，視網膜外核層較厚，細胞核數量 變化不明顯，外核層無明顯塌陷。碘酸鈉尾靜脈注射后7天，大鼠視網膜上大量光感受器細 胞外節進解，視網膜外核層塌陷。外核層，甚至內核層直接貼附在Bruch’ s膜上，整個視網 膜切面呈拱橋樣改變，周邊視網膜亦受累，中央視網膜較周邊視網膜受損明顯(圖10. C)； 同一時間點移植組大鼠視網膜上光感受器細胞外節發生形變，視網膜外核層局部位置出現 凹陷，結構基本保持完整(圖10. D)。碘酸鈉尾靜脈注射后7天，視網膜損傷達到峰值，在移 植后2周、3周、6周，受損眼球病理結構沒有發生明顯改變(圖10.E，G，I)，而移植組進一 步修復(圖10. F，H)，在移植后6周，結構基本恢復(圖10. J)，與正常鼠眼類似。從以上結果可見，移植后1周、2周、3周、6周、12周移植組視網膜RPE細胞、光感 受器細胞數量、光感受器細胞層厚度、視網膜外核層塌陷程度和數量，均好于對照組。 3. 2、hAD-MSCs在視網膜變性大鼠體內的分布、分化和療效觀察hAD-MSCs移植后1周、2周、3周均可見視網膜RPE層和脈絡膜毛細血管層有 hAD-MSCs存在，并且整合到宿主的RPE層和毛細血管內皮中，表現出RPE細胞和血管內皮 細胞特有形態，第3周時還可見一些hAD-MSCs存在于視網膜光感受器細胞層。6周和3個 月時僅見視網膜光感受器細胞層散在hAD-MSCs存在。第1、2周，hAD-MSCs雖然整合到宿 主脈絡膜毛細血管和視網膜外層，但是并沒有表達宿主靶細胞特有的標志。到第3周，可見 hAD-MSCs分布于視網膜光感受器細胞層、RPE層和脈絡膜毛細血管層，并且表達光感受器 細胞標志Rhodopsin、RPE細胞標志MITF、血管內皮細胞標志vWF(圖11)。實施例4 干細胞在糖尿病視網膜病變中的應用4.1、hAD-MSCs 對 BRB 功能的改善BRB在DR早期開始損傷，我們采用了伊凡思藍染色方法來檢測糖尿病大鼠BRB 功能的改變。如圖12所示，與正常大鼠(7.0士0.6)相比細胞移植前DR大鼠BRB水 平(20. 8 士 3.1)明顯上升；hAD-MSCs移植后1周，移植組(9. 9 士 1.5)滲漏水平較對 照組(20. 2 士 2. 8)有所下降；植入后2周結果與1周類似，移植組對照組9.8 士 1.6vs 19. 5士4. 0 ；移植后4周，移植組基本恢復正常，達到8. 0士 1. 2，而對照組依然維持在較高水 平19. 2士0. 3。由此可見，hAD-MSCs的輸入對于BRB滲漏水平明顯改善，顯著提高了 BRB的 功能。4. 2、血糖改變我們分別觀察DR在細胞植入后1周、2周和4周血糖的變化(圖13)，結果顯示，植 入后1周，移植組DR大鼠的血糖(19. 7士4. 9ml/L)較對照組(21. 9士3. 2ml/L)有所下降，但 二者之間沒有明顯的統計學差異。細胞植入后2周，移植組血糖進一步下降(14. 5士4. 9ml/ L)，而對照組沒有變化(24. 3士2. 9ml/L)。到第4周移植了 hAD-MSCs的大鼠血糖下降到10. 6士4. 5ml/L ；對照組血糖一直維持在高水平(22. 1 士2. lml/L)。hAD_MSCs的植入確實可 以降低DR大鼠的血糖水平，可能對于減輕視網膜損傷有一定的作用。4. 3、hAD-MSCs在視網膜細胞的分化及分布我們之前的研究顯示，hAD-MSCs可以分布在多種損傷的組織，這里我們使用抗人 核抗體，通過免疫熒光方法檢測供體細胞在眼底的分布狀況。熒光顯微鏡下觀察發現細胞 移植后一周，植入細胞在視網膜的內核及外核層都有分布。隨后，抗Rhodopsin、抗GFAP和 抗人核的免疫熒光雙染顯示，分布在視網膜的供體細胞也表達感光細胞和膠質細胞的的標志。實施例5 在視網膜裂孔疾病模型中的應用5.1、三維 OCT 檢查視網膜裂孔術后第2日，手術眼內氣體基本吸收完全，行兔眼三維OCT及眼底檢 查顯示裂孔大小約1. 5mm左右，邊緣整齊近圓形，網膜復位無脫離，裂孔處RPE層無損傷。 術眼玻璃體清，OCT成像清晰，術眼視網膜裂孔周邊網膜復位良好，視網膜裂孔邊緣及裸露 RPE層均無新生組織形成(圖15.A)。眼底檢查示裂孔范圍視網膜呈蒼白色，遮擋脈絡膜 血管。hAD-MSCs移植組與對照組受體眼三維OCT檢查圖像基本相同，未見明顯細胞團堆積 (圖 15. B)。術后第4日，對照組的術眼視網膜裂孔邊緣界限消失，修復組織出現，新生組織在 裂孔邊緣最為豐富，向裂孔中心逐漸減少，裂孔中心處修復組織薄，厚度約為正常視網膜厚 度的1/5 (圖15. C)。hAD-MSCs移植組的術眼視網膜裂孔邊緣也始修復，孔中心厚度達約為 正常視網膜的1/2(圖15. D)。眼底檢查視網膜裂孔處呈乳白色，余視網膜正常。術后12日，對照組與hAD-MSCs移植組視網膜裂孔均進一步修復。hAD-MSCs移植 組裂孔中心厚度即恢復到與正常視網膜基本相同(圖15. F)，對照組裂孔中心厚度為正常 的1/2 (圖15. E)。眼底檢查較前無明顯變化。術后20日對照組裂孔中心厚度仍僅約為正 常視網膜的2/3 (圖15. G)，且不再有明顯變化。眼底檢查較前無明顯變化。術中對照組2只小鼠術后裂孔邊緣的視網膜未完全復位，裂孔邊緣翹起，邊緣貼 附于RPE層處出現新生修復組織，而翹起處無修復組織出現，至術后3周裂孔均仍未閉合， 于裂孔局部注入hAD-MSCs懸液10 μ 1 (約1 X IO5)，移植后術眼裂孔修復，修復過程與干細 胞移植組一致。5. 2、病理檢查術后1個月，HE染色結果顯示，對照組視網裂孔處組織厚度較正常視網膜略薄，正 常視網膜各層結構不清晰，基本被膠原纖維樣組織所替代，裂孔處細胞的細胞核形態為近 圓形或長圓形，部分為長桿狀(圖16. A)。hAD-MSCs移植組術后1個月，裂孔修復組織略高 出兩側正常視網膜，裂孔處細胞的細胞核多為不規則圓形，基本不存在長桿狀細胞核(圖 16. B)。5. 3、修復后裂孔的細胞分型為了進一步了解裂孔修復的情況，我們分別采用GFAP(膠質纖維酸性蛋白，glial fibrillary acidic protein，GFAP)，R0PSIN，PKC抗體對膠質細胞、感光細胞和雙極細胞進 行了標記。結果顯示，對照組術眼裂孔處只有GFAP陽性細胞在裂孔修復組織、脈絡膜視網 膜粘合處廣泛分布，走向與RPE層平行(圖17.A)。裂孔處雙極細胞標記抗原PKC、感光細胞標記抗原Opsin免疫熒光檢測均為陰性(圖17. D. G)。而移植組術眼裂孔處除大量無序 分布的GFAP陽性的膠質細胞外(圖17. B)，可見少量Ropsin陽性的感光細胞(圖17. E)和 PKC陽性的雙極細胞(圖17. H)分布。這個結果提示，移植組和對照組均主要以膠質細胞修 復為主，但同時移植組有少量感光細胞及雙極細胞分布，而對照組僅為膠質修復。5. 4、植入的MSC在損傷部位的分布及分化我們用抗人核抗體檢測植入的hAD-MSCs在裂孔處的分布情況。如圖所示，裂孔處 可見少量散在分布的抗人核陽性的供體細胞。進一步通過免疫熒光雙染檢測供體細胞的分 化，結果可見，部分供體細胞表達GFAP抗原(圖18. A-C)，同時少量供體細胞表達Opsin (圖 18. D-F)，而PKC抗原陽性的細胞和與抗人核陽性的細胞沒有重疊。上述結果說明，供體來 源的間充質干細胞通過直接分化參與了模型小鼠眼損傷的修復，但僅局限于很小的數目， 對于裂孔的修復不起決定性作用。序列表<110>中國醫學科學院基礎醫學研究所<120>人脂肪來源的間充質干細胞在腎臟、眼底疾病中的用途<130>890136CG<160>10<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gctcctcctg agcgcaagta20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2gatggagggg ccggact17<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcatcgtct tgcagatcga c21<210>4<211>22<212>DNA <213>人工序列
<400>4gctgagacca gtacttgtcc ag 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5ctggaacggt gaaggtgaca20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6aagggacttc ctgtaacaat gca 23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7ctggaacggt gaaggtgaca20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8aagggacttc ctgtaacaat gca 23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9acggacaggg cttctcctac20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10atggtggtat cgagggtgga a2權利要求
1.人脂肪來源的間充質干細胞在制備治療腎臟和/或眼底疾病的細胞制劑中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中所述的腎臟疾病包括急性腎損傷、腎臟纖維化、腎 小管上皮細胞損傷。
3.根據權利要求1所述的用途，其中所述的眼底疾病包括視網膜變性、糖尿病視網膜 病變、視網膜裂孔。
4.根據權利要求3所述的用途，其中所述的視網膜變性為視網膜色素變性。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的用途，其中每單位所述的細胞制劑包含IXlO5 至IXlO6個人脂肪來源的間充質干細胞。
6.根據權利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的人脂肪來源的間充質干細胞 是種子細胞。
7.根據權利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的人脂肪來源的間充質干細胞 免疫表型為 CDlla，CD31, CD34, CD45, HLA-DR 為陰性，CD29, CD44, CD105, CD166, Scar-I, Flk-I為陽性，并且低表達MHC II類分子。
8.根據權利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的細胞制劑為靜脈注射劑。
9.根據權利要求3所述的用途，其中所述的細胞制劑為視網膜下注射劑。
全文摘要
本發明涉及人脂肪來源的間充質干細胞在腎臟、眼底疾病中的用途。本發明提供人脂肪來源的間充質干細胞在制備治療腎臟和/或眼底疾病的細胞制劑中的用途，所述的疾病可以是急性腎損傷、腎臟纖維化、腎小管上皮細胞損傷、視網膜變性、糖尿病視網膜病變或視網膜裂孔等。本發明的細胞制劑可促進腎臟構和受損眼球病理結構的修復，具有良好的效果。
文檔編號A61P13/12GK102048756SQ20091020932
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月4日 優先權日2009年11月4日
發明者于偉鴻, 晁緯靜, 李康華, 楊治坤, 王旭倩, 董方田, 趙春華, 趙潺, 閆曦, 韓欽 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所