人源血液或間充質干細胞分泌exosome的制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種人源血液或間充質干細胞分泌?exosome?的制備與應用。其過程為：從健康人體的血液或者干細胞培養上清液中提取間充質干細胞，經過體外培養、擴增，并利用低溫分離、純化等手段制備得到高純度、高生物活性的exosome。本發明所述的血液或間充質干細胞分泌的exosome按照比例加入到醫藥、保健品、化妝品中，開發成具有生物活性功能的產品，可以有效調控機體細胞信號轉導，激活細胞再生，增強健康細胞增殖、分化能力，進而調整生理性修復或者清除機體損傷，病變和衰老的細胞，從根本上改變機體的生理功能；?通過調節細胞免疫，進而有抗腫瘤療效。該血液或間充質干細胞分泌的exosome應用于醫學、保健和美容領域，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】人源血液或間充質干細胞分泌exosome的制備與應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及從健康人體的血液或者干細胞培養上清液中提取間充質干細胞，經過體外分離，從血清或培養液上清中提取獲得具有生物活性的exosome并應用。
【背景技術】
[0003]Exosome是一種由細胞分泌的納米量級的膜性小囊泡,50年前首次發現由綿羊的網狀細胞(reticulocytes)分泌,現已證實可以由多種細胞分泌,如:B細胞、樹突細胞、肥大細胞、T細胞、血小板細胞、施旺氏細胞、腫瘤細胞、精細胞等。尿液和血漿等多種體液中也發現exosome的存在。
[0004]Exosome具有特定的生物物理和生物化學特性。其直徑為40-100納米，蔗糖密度為1.13-1.19克/毫升,可以在100，OOOg的離心力下沉淀。不同細胞來源的Exosome所含有具體成分不同，一般而言，它含有以下幾種物質=MHC I類和(或)II類分子、熱休克蛋白、四跨膜蛋白、整合素、細胞骨架蛋白及生物酶類。
[0005]Exosome內各成分的特性決定了 exosome可以執行不同的生理功能。Exosome富含膽固醇、鞘磷脂、神經酰胺、蛋白質、RNA等生物活性因子，這些生物活性因子可以有效調控機體細胞信號轉導，進而生理性修復或者清除機體損傷，病變和衰老的細胞。Exosome的生理功能最初由Raposo G于1996年研究調節免疫通信時發現，由抗原呈遞細胞(APC)分泌，具有轉運MHC抗原呈遞復合物的作用。這項發現也提供了 exosome可用于疾病治療的理論依據。隨后的研究發現了 exosome更多的治療潛力。例如,exosome可以抑制腫瘤的生長；exosome可防止急性心肌梗塞和急性腎小管損傷等。近年來研究發現exosome與神經元的通信或發病機制有關。由神經元、星形膠質細胞和神經膠質細胞釋放的exosome可清除不需要的應激蛋白和阻止淀粉樣蛋白原纖維的形成，從而減輕阿爾茨海默氏綜合Exosome的旁分泌作用，使其作為替代傳統的間充質干細胞(MSC)成為再生醫學治療中應用的新技術成為可能。近年來，由各種干細胞所分泌的exosome在修復各種組織損傷方面的應用得到了廣泛的研究。Exosome中含有大量的生長因子，如血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板增殖因子(PDFG)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、腫瘤壞死因子(TNF-α )和腫瘤生長因子(TGF-β )等，具有抑制細胞凋亡和纖維化，促進血管發生和有絲分裂，介導免疫反應的作用。實驗證明，在使用間充質干細胞所分泌的exosome治療急性腎損傷時，exos ome所含有的胰島素樣生長因子(IGF-1)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)扮演了關鍵性的角色。在免疫學方面，間充質干細胞分泌的exosome脂膜表面表達有多種膜蛋白，包括凝血因子(TF)，腫瘤壞死因子(TNF)，MHC I類和II類分子以及CCR5趨化因子受體等，’。通過這些表面分子，間充質干細胞可以調控T淋巴細胞，樹突細胞，天然殺傷細胞等免疫細胞的活性，從而起到抵抗炎癥的作用。[0006]除了可以減輕細胞移植的風險，exosome作為一種雙脂質膜囊泡，還有能力將小的可溶性生物因子如生長因子，趨化因子，細胞因子，轉錄因子，基因和RNA等轉運到正確的靶細胞，同時保持這些因子的穩定性、完整性和生物效價，防止被酶或化學品所分解。實驗表明，由MSC分泌的exosome，脂膜結構完整時可以保護所包裹的蛋白質和RNA不被胰蛋白酶和RNA酶降解；由MSC分泌的exosome可以在_20°C條件下存儲6個月而不會降低其心臟保護作用，。最近有科學家利用這一特性發明了用exosome作為載體向腦部運送SiRNA的治療方法。
[0007]此外，由于exosome與一些疾病的病理生理密切相關，因此可作為檢測一些疾病的方法。研究報道,血液中exosome的miRNA的可以用來指示和診斷卵巢癌；尿液中exosome的蛋白質可以作為反映急性腎損傷的診斷標志物。
[0008]因此，利用exosome調控機體細胞通信，進而激活自身細胞生理性修復或清除機體損傷，病變及衰老的細胞，在疾病防止與美容保健領域具有廣闊的應用前景。但exosome的體積小，密度低，提取過程繁雜、產量也低，從而制約了對exosome的進一步研究和應用。
[0009]鑒于上，我們研究開發從健康人體液或干細胞培養液上清中提取exosome，并在儲存中保持其生理活性的方法，利用這種生物活性物質激活人體自身細胞來生理性修復或替代集體損傷，病變和衰老的組織細胞。
【發明內容】
[0010]本發明的目的是:1、提供可以活化機體細胞的exosome ;2、提供可以活化機體細胞的exosome的制備方法；3、提供可以活化機體細胞的exosome的用途。 [0011]本發明的技術方案如下:
從健康人體的臍帶或胎盤組織中提取干細胞，利用無血清間充質干細胞培養基(不含動物源成分)進行體外培養，擴增，收集在培養過程中細胞培養上清液。或者從健康人體的血液中提取血清。利用差速離心的技術去除上清液或者血清中的雜質，最后用超速分離等現代生物技術手段取得高純度的含有豐富生物活性因子的exosome。
[0012]整個過程要求無細菌，真菌，病毒,衣原體和支原體等污染。
[0013]利用上述發明獲得的exosome富含膽固醇，鞘磷脂，神經酰胺，蛋白質和RNA等生物活性因子，可以調控機體細胞間信號轉導，激活自身細胞生理性修復或清除機體損傷，病變及衰老的細胞，提高機體的免疫力和抗衰老作用。該exosome可制成針劑,涂劑,膏劑,霜劑或粉劑等，在醫學，保健和美容領域具有良好的應用前景。
[0014]本發明具有明顯的優勢:第一，產品純度高，exosome不含有普通細胞提取產品可能含有的有毒的細胞因子，避免了潛在的安全隱患；第二，生物活性高，更易于被吸收，exosome通過細胞內吞作用攝入細胞，可以避免一些大分子生物因子(如蛋白質，RNA)被細胞的磷脂雙分子膜所阻擋，不容易被細胞吸收的問題；第三，具有較高的生物穩定性，易于保存和運輸，exosome可在_20°C條件下存儲6個月而不會降解，并且其脂膜結構可以保護所包含的蛋白質和核酸的穩定性，避免生物因子被體內外的酶和化學物質降解。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]我們已成功的從人體心肌細胞中提純出exosome見圖1.A):經免疫印跡(Westernblot)分析exosome的分子生物學特征；B1_2):經生物分析儀分析監定出我們分離的(exosome)為高純度；C):電子顯微鏡鏡下顯示exosome超微結構。
參考文獻
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[0016]實施例1,血清中exosome的提取。人體血液來源廣泛，并含有大量的exosome。從健康人的血液中分離去除血細胞和纖維蛋白原，得到血清。利用差速離心的技術去除血清中的細胞碎片和雜質，然后在低溫下超速離心血清，去除上清，所得沉淀即為exosome，重懸于PBS中保存于_20°C。具體過程如下:
采集健康人體血液，離心去除血液中的血細胞和纖維蛋白原，獲得血清，血清應為淡黃色液體。
[0017]1.用等量的磷酸緩沖液(PBS)稀釋血清。
[0018]2.800g離心血清10分鐘，保留上清，棄沉淀，去除血清中的細胞
3.2000g離心10分鐘，保留上清，棄沉淀，去除血清中的死細胞
4.1OOOOg離心30分鐘，保留上清，棄沉淀，去除血清中的細胞碎片
5.1OOOOOg離心70分鐘,保留沉淀,棄上清,上清中含有exosome和雜蛋白
6.用PBS溶液重懸沉淀，雜蛋白溶解于PBS溶液
7.1OOOOOg離心70分鐘,保留沉淀,棄上清,上清中成分即為純化的exosome
8.重復一次以上清洗雜蛋白步驟
以上所有步驟均需要在4°C下，使用低溫離心機完成
9.將純化所得的exosome低溫保存于_20°C冰箱，或長期保存于_80°C冰箱中。
[0019]實施例2，細胞培養上清液中exosome的提取。以人間充質干細胞(MSC)為例，人間充質干細胞來源于健康人體的骨髓、胎盤和臍帶組織中，可以在體外條件下穩定培養，細胞活性強，分泌旺盛，其細胞培養上清液中含有大量的exosome。同時，間充質干細胞分泌的exosome來源單一穩定，并且可以使用現代生物技術手段轉染表達需要的蛋白，可操控性強。
[0020]1.從健康人體的骨髓，胎盤或臍帶血分離間充質干細胞，用無動物源成分的合成
培養基培養。
[0021]2.收集細胞培養過程中的更換的培養上清液，_20°C冷凍保存。
[0022]3.將細胞培養過程中收集的上清液融化，混合，800g離心10分鐘，保留上清，棄沉淀，去除培養液上清中的細胞
4.2000g離心10分鐘，保留上清，棄沉淀，去除培養液上清中的死細胞
5.1OOOOg離心30分鐘，保留上清，棄沉淀，去除培養液上清中的細胞碎片6.1OOOOOg離心70分鐘,保留沉淀,棄上清,上清中含有exosome和雜蛋白
7.用PBS溶液重懸沉淀，雜蛋白溶解于PBS溶液
8.1OOOOOg離心70分鐘,保留沉淀,棄上清,上清中成分即為純化的exosome
9.重復一遍以上清洗雜蛋白步驟
以上所有步驟均需要在4°C下，使用低溫離心機完成
10.將純化所得的exosome低溫保存于_20°C冰箱，或長期保存于_80°C冰箱中。
[0023]實施例3，免疫吸附法純化細胞培養上清液中的exosome。此方法利用抗原抗體反應，通過吸附exosome表面的特異性抗原來達到純化的目的，具有方法快捷，純度高和易于進行后續的生化分析的優點，但是成本較高。
[0024]1.同實施例2中方法，獲得細胞培養上清液
2.4°C低溫條件下下以2000g離心10分鐘，保留上清液，去除沉淀中的細胞碎片。
[0025]3.用 PBS 清洗抗體包被的磁珠(antibody-coated Dynabeads)
4.用磁鐵沉淀清洗后的磁珠，棄除所有上清液
5.將獲得的磁珠和步驟2中獲得的上清液混合均勻，4°C低溫下孵育24小時
6.用磁鐵收集已經吸附有exosome的磁珠
7.用PBS清洗獲得的磁珠，`重復三次去除可能殘留的蛋白和雜質
8.以上獲得的樣品低溫保存于-20°C冰箱，或長期保存在-80°C冰箱中，用于生化分析。
[0026]實施例4、純化的exosome的生物活性驗證
將純化的所得exosome配置成15微克/毫升濃度，加入培養基中，利用此培養基培養正常傳代至第8代的骨髓、臍帶或胎盤間充質干細胞(此代細胞的增殖能力減弱，活性降低)，顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，并于第3天收集細胞，與對照組相比，添加exosome的組別，間充質干細胞增殖能力顯著增強。
[0027]實施例5, exosome在醫療領域中的應用
將純化后的exosome按照l:10(Tl:1000比例稀釋加入皮膚外用敷料或者皮膚外用藥方中，可以激活細胞再生，顯著促進傷口的愈合。特別是在治療難愈的淺表組織創傷方面，如燒傷，褥瘡，體表炎癥以及糖尿病和手術導致的傷口不愈等，具有明顯的療效。
[0028]對于心肌梗塞，腎損傷、各部位腫瘤疾病等，將純化后的exosome按照1:100~1:500比例稀釋制成注射液，進行病灶部位局部注射，可活化靶組織，促進靶組織新陳代謝，增強健康細胞增殖、分化能力，修復或清除衰老，死亡或腫瘤化的細胞，從根本上改變病灶的生理狀況。
[0029]實施例6, exosome在保健和美容領域中的應用
將純化的exosome按1:100~1:1000比例稀釋加入注射液中制成保健品,進行靜脈注射，可活化機體干細胞，修復或清除受損與衰老的細胞，改善新陳代謝，提高機體抵抗力，延緩衰老，減緩腫瘤細胞的增殖。
[0030]將純化的exosome以100~200微克/毫升加入到護膚品或沐浴液中，外用于皮膚，可活化皮膚干細胞，促進皮膚細胞增殖、分化，修復或清除衰老的皮膚細胞，從根本上改變皮膚的生理機能。
[0031]將純化的exosome以20~40微克/毫升加入到眼藥水中，外用于眼部，可活化眼角膜細胞，修復或清除衰 老的角質細胞，從根本上改變角膜的生理機能。
【權利要求】
1.人源血液或間充質干細胞分泌exosome的制備與應用，其特征是血液或間充質干細胞分泌的exosome通過以下方法制得:1)采集血液一差速離心分離一低溫超速純化一獲得高純度血清含有的exosome ；2)提取間充質干細胞一體外培養、擴增一收集細胞培養上清液一融化培養上清液并混合一差速離心分離一低溫超速純化一獲得高純度干細胞分泌的exosome ；3)提取間充質干細胞一體外培養、擴增一收集細胞培養上清液一融化培養上清液并混合一低溫離心、免疫吸附法純化一獲得高純度間充質干細胞分泌的exosome，其兩者應用領域為醫學、保健和美容。
2.根據權利I要求所述的血液，其特征是來源于健康人體。
3.根據權利I要求所述的血液分泌的exosome，其特征是健康人體血液經差速離心分離、低溫超速純化獲得。
4.根據權利I要求所述的間充質干細胞，其特征是來源于健康人體的骨髓、胎盤和臍帶組織，經體外培養獲得。
5.根據權利I要求所述的間充質干細胞，其特征是體外培養、擴增所用的特定培養基為無血清間充質干細胞培養基(不含動物源成分)。
6.根據權利I要求所述的血液或間充質干細胞分泌的exosome應用于醫學、保健和美容領域，其特征是按照比例加入到醫藥、保健品、化妝品中，可以有效調控機體細胞信號轉導，激活細胞再生，增強健康細胞增殖、分化能力，進而調整生理性修復或者清除機體損傷，病變和衰老的細胞，從根 本上改變機體的生理功能；通過調節細胞免疫，進而有抗腫瘤療效。
【文檔編號】A61K35/50GK103767985SQ201210402915
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月22日 優先權日:2012年10月22日
【發明者】王義剛, 趙柏松 申請人:吉林省霍普金斯藥物研究院有限責任公司