皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢功能修復藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢功能修復藥物中的應用。具體提供了皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢功能修復或改善卵巢組織微環境的藥物中的應用，在制備促進卵巢顆粒細胞形成、促進卵泡發育轉錄因子表達和/或抑制卵巢組織中炎癥發生的藥物中的應用，以及制備促進卵巢損傷動物的體重增加和/或改善卵巢損傷動物生育能力的藥物中的應用。本發明拓展了皮膚來源間充質干細胞的應用范圍，為皮膚來源間充質干細胞的科學和有效利用提供了指導。
【專利說明】皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢功能修復藥物中的應用
[0001]【【技術領域】】
本發明涉及皮膚來源間充質干細胞的用途，具體地說，涉及皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢功能修復藥物中的應用。
[0002]【【背景技術】】
皮膚是人體中最大的器官，長期以來一直是作為研究細胞再生的一個潛在來源。皮膚來源間充質干細胞(SMSCs)是一種原始的、獨特的多能干細胞，可分化為三個胚層的細胞，包括神經細胞、脂肪細胞、胰島細胞、軟骨細胞和成骨細胞。其不僅具有多向分化的潛能外，其還具有組織相容性高、免疫抑制、基因修飾易感性、體外擴增能力強等優點，為臨床中疾病的治療及受損組織的修復帶來了新的希望。
[0003]Dyce等人曾報道，在離體實驗中發現皮膚來源間充質干細胞可以表達生殖細胞特異性蛋白并形成卵母樣的細胞(①Dyce Pff, W Shen, E Huynh, H Shao, DAVillagomez, G.M Kidder, WA King and J L1.(2011).Analysis of oocyte-like cellsdifferentiated from porcine fetal skin-derived stem cells.Stem Cells Dev.20:809-819.②Dyce Pff, L Wen and J L1.2006.1n vitro germline potential of stemcells derived from fetal porcine skin.Nat Cell Biol 8: 384 - 390.)。而且，該研究小組發現新生小鼠皮膚來源的干細胞具有分化成卵母樣細胞的能力，將該細胞移植入免疫缺陷小鼠中可形成卵母細胞(Dyce Pff, J Liu, C Tayade, GM Kidder, DH Betts and JL1.(2011).1n vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived fromnewborn mouse skin.PLoS One.6: e20339.)。以上研究表明，皮膚來源的干細胞具有分化為生殖細胞極大的臨床應用 潛能。
[0004]中國期刊《南方醫科大學學報》，2011年05期，刊出的論文“骨髓間充質干細胞對免疫損傷卵巢的修復作用”，方法是:6~8周齡的野生型健康ICR雌性小鼠隨機分為3組，每組各12只。A組不作任何處理，B、C組利用豬卵巢蛋白主動免疫建立免疫損傷卵巢模型。而后C組腹腔移植來自GFP轉基因小鼠的骨髓MSCs細胞，A、B組各注射等體積的PBS。MSCs移植后按既定時間處死小鼠，利用PCR檢測卵巢中GFP基因以判斷MSCs是否到達卵巢；通過對卵巢組織切片HE染色以及細胞凋亡分析來檢測MSCs是否對免疫損傷卵巢有修復作用及其機制。結果=PCR結果表明MSCs經腹腔移植可直接到達免疫損傷卵巢;MSCs移植可促進免疫損傷卵巢組織的修復；相應地，移植組顆粒細胞的凋亡比非移植組明顯減少。結論:腹腔移植MSCs可促進免疫損傷卵巢的修復，其機制可能與減少顆粒細胞凋亡有關。
[0005]但是目前關于皮膚來源間充質干細胞對卵巢功能修復的作用還未見報道。
[0006]【
【發明內容】
】
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供皮膚來源間充質干細胞的用途。
[0007]為實現上述目的，本發明采取的技術方案是:
皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢功能修復或改善卵巢組織微環境的藥物中的應用。[0008]皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢顆粒細胞形成、促進卵泡發育轉錄因子表達和/或抑制卵巢組織中炎癥發生的藥物中的應用。
[0009]所述的卵泡發育轉錄因子是Nobox、Nanos3或Lhx 8。
[0010]所述的抑制卵巢組織中炎癥發生是指抑制促炎因子TNF-a、TGF-β、IL_8、IL_6、IL-1 β或IFNy的表達。
[0011]皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢損傷動物的體重增加和/或改善卵巢損傷動物生育能力的藥物中的應用。
[0012]所述的卵巢損傷動物是卵巢損傷小鼠。
[0013]所述的皮膚來源間充質干細胞為雄性來源。
[0014]本發明優點在于:
本發明通過采用鼠尾靜脈的方式將來自紅色熒光蛋白(RFP)轉基因小鼠(雌性/雄性)的皮膚間充質干細胞(F-SMSCs/M-SMSCs)注入到化療藥物誘導的卵巢早衰小鼠體內，交配實驗及小鼠產仔量分析評估小鼠卵巢功能情況，免疫熒光的方法示蹤其在卵巢組織中的分布及分化方向，實時定量PCR方法檢測其對卵巢組織微環境及卵泡發育的影響，研究發現:在細胞移植組中小鼠的體重明顯增加，并且生育能力得到明顯改善；RFP陽性的皮膚間充質干細胞可遷移到損傷的卵巢組織，并且分化為卵巢顆粒細胞(RFP+-AMH+);在細胞移植后第7天，卵巢組織中促炎因子TNF-a、TGF-P、IL-8、IL-6、IL-1 β及IFN Y的mRNA的表達明顯降低，而與卵泡發育相關的轉錄因子Nobox、Nanos3及Lhx 8的mRNA表達明顯升高。以上結果表明皮膚間充質干細胞在抑制卵巢組織中炎癥發生、修復卵巢組織微環境及促進損傷卵巢功能恢復方`面具有重要意義。
[0015]雖然現有技術報道了皮膚來源間充質干細胞可以表達生殖細胞特異性蛋白并形成卵母樣的細胞，以及骨髓間充質干細胞對免疫損傷卵巢具有修復作用，但是形成卵母樣的細胞并不代表就一定能促進卵巢的修復，另外，骨髓間充質干細胞不同于皮膚來源間充質干細胞，因此也并未給出皮膚來源間充質干細胞對卵巢具備修復作用的啟示，再者，以上現有技術并未提示皮膚來源間充質干細胞可以使得卵巢早衰小鼠的體重明顯增加并改善其生育能力，也未闡明皮膚來源間充質干細胞可分化為卵巢顆粒細胞，同時未發現骨髓間充質干細胞具有抑制卵巢組織中炎癥發生的作用，可見本發明拓展了皮膚來源間充質干細胞的用途，有助于將其應用于更多的領域。
[0016]【【專利附圖】
【附圖說明】】
附圖1AB⑶、圖1EF、圖1GH是皮膚間充質干細胞SMSCs的特點及分化。(A-B):雌性小鼠皮膚來源間充質干細胞(F-SMSCs) ; (C-D):雄性小鼠皮膚來源的間充質干細胞(SMSCs)；(E):流式細胞儀檢測F-SMSCs細胞表型，96%的F-SMSCs細胞表達CD73，3.4%的F-SMSCs表達0ct4，但不表達⑶45、⑶34及⑶14 ； (F):流式細胞儀檢測M-SMSCs細胞表型，92%的M-SMSCs 細胞表達 CD73，3.9% 的 M-SMSCs 表達 0ct4，但不表達 CD45、CD34 及 CD14 ； (G-H):在體外誘導分化條件下，F-SMSCs及M-SMSCs細胞能夠分化為骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞。Scale bars, 50 μ m0
[0017]附圖2AB⑶、圖2EF是不同實驗組中小鼠體重及生殖器官重量的比較。(A):12周齡小鼠的體型圖片(a:未經處理的對照組，b-c =F-SMSCs及M-SMSCs細胞處理組，d:正常對照組);(B):在整個實驗過程中，未經處理組小鼠的體重明顯下降，然而，從第2周開始，細胞移植組小鼠的體重明顯高于對照組(**，P <0.01)； (C):卵巢圖片(a:未經處理的對照組，b-c =F-SMSCs及M-SMSCs細胞處理組，d:正常對照組)；(D):細胞移植組中小鼠卵巢重量顯著增加(**，P <0.01); (E):細胞移植組的子宮重量明顯高于未治療的對照組(*，P < 0.05 ；*，P < 0.01) ; (F):在整個實驗過程中宮頸和陰道的重量無明顯變化(**，P < 0.01)。
[0018]附圖3是不同實驗組中小鼠交配實驗結果比較。(A):不同實驗組中小鼠產仔后代圖片；(B):細胞治療組與未治療組的產仔數量的比較。細胞移植組小鼠的產仔數量明顯高于未處理的對照組(**，P < 0.01)。然而，正常對照組小鼠產生的幼崽的平均數量仍高于細胞處理組(**，P < 0.01)。
[0019]附圖4是HE染色評估不同實驗組中小鼠卵巢修復情況。(A):在正常對照組，小鼠卵巢組織切片中有大量發育不同階段的卵泡；(B):在細胞未處理組，卵巢組織大量纖維化并且有大量凋亡細胞存在；(C-D):細胞移植后2個月的小鼠卵巢切片。
[0020]附圖5是RFP轉基因小鼠的皮膚間充質干細胞在化療藥物誘導卵巢早衰小鼠體內的表達情況。(A):細胞移植后第7天，將小鼠卵巢切片進行免疫熒光觀察。箭頭表示卵巢間質內的RFP陽性細胞。(B):細胞移植后第21天，在竇狀卵泡周圍可觀察到RFP陽性細胞，圖中星號表示竇狀卵泡。(C):細胞移植后第28天，卵泡周圍顆粒細胞中RFP陽性細胞。(D):細胞移植后2個月，在受體卵巢的竇狀卵泡中RFP與AMH雙標記的陽性細胞。
[0021]附圖6是皮膚間充質干細胞對卵巢炎癥反應的影響。(A):通過實時定量PCR分析卵巢組織中促炎癥和抗炎癥細胞因子基因mRNA的表達水平。在細胞移植后第7天，與未經處理的對照組相比細胞處理組小鼠卵巢組織中TNF-a、TGF-β、IL_8、IL_6、IL-1 β和IFN-y 基因 mRNA 表達水平明顯降低(*ρ < 0.05，#Ρ < 0.01，*#Ρ < 0.01)。(B):不同組別小鼠卵巢中卵母細胞特異基因的表達。結果顯示，細胞移植能夠明顯上調N0b0X、Nan0S3和Lhx 8基因mRNA的表達(#P < 0.01)。
[0022]【【具體實施方式】】
下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0023]實施例1
一、材料及方法
1、皮膚間充質干細胞(SMSCs)的分離
RFP轉基因小鼠來自于上海交通大學BIO-X中心發育與生殖研究室。從RFP轉基因成年雄性或雌性小鼠分離皮膚組織，放置于Hank’s平衡鹽溶液中(HBSS)，將其修剪成Imm2組織塊，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶37 ° C消化45分鐘。將該細胞接種于6孔板中，培養于DMEM / F12培養基中，含有15%胎牛血清(Gibco)、1%的谷氨酰胺(Gibco )、1%青霉素/鏈霉素(Gibco)和4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(Invitrogen)放置在含有5% CO2的37° C恒溫箱中。每4-6天將細胞進行傳代。
[0024]、流式細胞術分析
利用流式細胞儀對雌性-皮膚間充質干細胞(F-SMSCs)及雄性-皮膚間充質干細胞(M-SMSCs)細胞表面特異性標記物CD73、CD14、CD34、CD45以及0CT4進行分析。將SMSCs細胞(約I X IO6 cells)重懸在含有2%牛血清白蛋白的PBS中，分別加入PE標記的抗鼠⑶73及⑶14抗體，FITC標記抗鼠⑶34、⑶45及0CT4抗體，使用FC500流式細胞儀及Coulter CXP軟件進行分析。[0025]、皮膚間充質干細胞的體外誘導分化
采用人骨髓間充質干細胞的功能鑒定試劑盒誘導皮膚間充質干細胞分化。骨細胞和軟骨細胞分別使用羊抗鼠骨鈣蛋白多克隆抗體及膠原蛋白II抗原多克隆抗體進行標記。冰凍切片的油紅O染色為脂質染色。
[0026]、建立卵巢早衰動物模型
選取6周齡ICR野生型雌性小鼠，通過腹腔注射白消安(30 mg/kg)和環磷酰胺(120mg/kg)建立卵巢早衰動物模型(參考 Meirow D, H Biederman, RA Anderson and WHWallace.(2010).Toxicity of chemotherapy and radiation on female reproduction.Clin Obstet Gynecol.53: 727-739.)。同樣選取年齡匹配雌性小鼠腹腔注射DMSO作為實驗對照組。所有動物實驗均在上海機構動物保健和使用委員會批準下進行。
[0027]、皮膚間充質干細胞移植，體重及組織器官重量評估及交配實驗
白消安和環磷酰胺化療藥物注射后I周，通過腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)將動物麻醉，將體積約為6 μ L含有皮膚間充質干細胞的細胞懸液(2 X IO6Cells)經鼠尾靜脈注入小鼠體內(F-SMSCs組:20只，M-SMSCs組:25只)，而對照組按照同樣方式給予同等劑量的細胞培液(15只)。
[0028]在細胞移植后的第1、2、3、4、5、6、7及8周將不同實驗組動物麻醉處死，收集組織器官(包括:腦、肺、心臟、肝臟、脾臟、脂肪、卵巢、陰道及子宮頸)并對收集的器官重量做好記錄，于-80度冰箱保存。
[0029]在化療處理后分別在細胞處理組、未處理組及正常對照組選取雌性小鼠進行為期一個月的交配實驗，并對每窩產量數量進行記錄。
[0030]、免疫熒光` 固定后的卵巢組織經OCT包埋制備成5 μ m厚度的切片，經PBS常規漂洗后在封閉液中室溫孵育30分鐘封閉非特異性抗原的活性后，切片分別入兔多克隆抗體RFP (1:200)、兔多克隆抗體AMH (1:200) 4°C孵育過夜，PBS漂洗后，入抗兔IgG-FITC及IgG- TRITC(1:200)避光孵育，PBS漂洗后封片。使用Leica DMI3000熒光顯微鏡觀察熒光信號。
[0031]、RNA 提取及 real-time PCR 分析
使用總RNA抽提試劑盒(天根公司)快速提取新鮮卵巢組織中RNA。將每個樣品中總量為50(^g RNA進行反轉錄合成cDNA，進行實時定量PCR，引物序列見表1。所有的反應在25μ?反應體系中進行。反應體系設置:95° C預變性5分鐘；95° C 30秒，60° C 30秒40個循環；72° C 30秒。PCR結束后對每個樣本中的循環閾值(CT)進行數據分析。mRNA水平的變化以18S RNA水平做內參。
[0032]表1 PCR 引物
【權利要求】
1.皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢功能修復或改善卵巢組織微環境的藥物中的應用。
2.皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢顆粒細胞形成、促進卵泡發育轉錄因子表達和/或抑制卵巢組織中炎癥發生的藥物中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的卵泡發育轉錄因子是Nobox、Nanos3 或 Lhx 8。
4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的抑制卵巢組織中炎癥發生是指抑制促炎因子 TNF- α、TGF- β、IL-8、IL-6、IL-1 β 或 IFN Y 的表達。
5.皮膚來源間充質干細胞在制備促進卵巢損傷動物的體重增加和/或改善卵巢損傷動物生育能力的藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的卵巢損傷動物是卵巢損傷小鼠。
7.根據權利要求5所 述的應用，其特征在于，所述的皮膚來源間充質干細胞為雄性來源。
【文檔編號】A61K35/32GK103816184SQ201410051261
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月14日 優先權日:2014年2月14日
【發明者】賴東梅, 程蔚蔚, 張秋婉, 董張麗 申請人:中國福利會國際和平婦幼保健院