用于經導管修復的組織工程心臟瓣膜的制作方法

用于經導管修復的組織工程心臟瓣膜的制作方法
【專利摘要】本文公開了擊穿強度為2kgf至6kgf的單層組織薄片。由一個或多個瓣葉構成的瓣膜例如心臟瓣膜由單層組織薄片形成。本文公開了制備擊穿強度為2kgf至5kgf的組織薄片的方法。本文描述的超強組織薄片具有非常長的培養時間，例如超過20周。瓣膜包含一個或多個由本文描述的超強組織薄片制成的瓣葉，其可經由導管主動脈瓣膜植入術進行傳遞。
【專利說明】用于經導管修復的組織工程心臟瓣膜
[0001]優先權聲明
[0002]本申請基于35U.S.C.§ 119(e)要求美國臨時申請61/615，111的優先權，該臨時申請的申請日為2012年3月23日，其全文以引用的方式并入本文中。

【技術領域】
[0003]本文描述的技術通常應用于組織工程領域，修復心血管疾病損壞的組織，以及這些修復的血管內方法。更具體地，該技術涉及由組織工程材料制得的瓣膜，其可通過開放或透皮途徑傳遞，以及涉及瓣膜的制備方法。組織工程瓣膜可取代心臟瓣膜例如主動脈瓣、肺動脈瓣、三尖瓣和二尖瓣，以及靜脈瓣膜或胃瓣膜。

【背景技術】
[0004]人體包含大量不同類型的瓣膜，任一種瓣膜都可能在患者一生中由于疾病或某些遺傳異常而衰壞。人們特別關注的是心臟瓣膜，其衰壞可導致患者快速死亡。
[0005]治療心臟疾病的一個方面是手術置換心臟中四個瓣膜(任一個都可能受損或病變)的一個或多個。人的心臟有四個腔，每個腔都有單向瓣膜。四個瓣膜是不同的:主動脈瓣、肺動脈瓣、二尖瓣(或雙尖瓣)和三尖瓣。前兩種(也稱為半月瓣)調節通過動脈離開心臟的血流，而后兩種(也稱為房室瓣)控制流入心臟的血流。每種瓣膜的結構包括位于血管頸部與心臟肌肉連接的環形部分以及調節穿過環形物的血流的兩個或三個瓣，(在天然組織中)稱為尖瓣。
[0006]心臟瓣膜的置換通常經由瓣膜植入物進行。目前制造的大多數心臟植入物都是用以置換衰壞的心臟瓣膜，但也開發出一些瓣膜植入物以置換靜脈中的瓣膜。瓣膜植入物可完全由合成材料制造，其中它們常被稱為“機械瓣膜”。合成瓣膜具有局限性，它們隨時間使材料合生，還可形成血栓。瓣膜植入物的生命周期通常僅為15年左右，意味著較年輕的患者在他們的一生中可能需要兩次或以上的手術來置換瓣膜。因此，手術往往昂貴而復雜，需要壽命更長的瓣膜植入物。
[0007]瓣膜植入物還可完全由生物組織制造，或由合成成分和生物成分兩者制造。由生物組織制造的瓣膜常稱為“組織瓣膜”，其使用獲自尸體或動物來源的組織制造。組織瓣膜可以是獲自動物尸體的真實瓣膜，或由原來不存在于瓣膜中的組織產生的瓣膜。這樣產生的組織瓣膜結合了管狀或環狀結構(在本文其它地方稱為“管狀結構”)和兩個或多個瓣葉(leaflets)(該術語用來描述這些瓣膜的尖瓣)。在大多數這些瓣膜中，管狀結構通常由合成材料制造，但也可由組織或組織與合成材料的結合制造。管狀結構的作用是支承所述瓣葉，并將瓣膜連接至主動脈和/或心臟的壁。所述瓣葉經常由附著到管狀結構的生物材料制造，并形成瓣膜的尖瓣或瓣葉，打開時能使血液往一個方向流動，關閉時能夠防止血以相反的方向倒流。在許多情況下，管狀結構通過可折疊的支架提供，支架上連接有瓣葉。
[0008]用來制造組織瓣膜或結合了生物組分和合成組分的瓣膜的瓣葉的生物材料通常來源于尸體或動物(例如牛、馬或豬來源)的心包。這些異種材料最常經化學或物理變性(常稱為“固定”的過程)以最小化受者抵抗身體認為是異物的免疫反應，從而限制一旦植入后這種免疫反應對瓣膜的降解作用。固定也可用以加強或改變生物組織的機械性質。然而，固定的組織仍然被身體識別為異物。例如，固定的心包可觸發免疫反應或鈣化，導致瓣膜降解和衰壞。
[0009]有些瓣膜植入物由整個動物瓣膜制造(例如來自動物的心臟或靜脈)。動物瓣膜也經固定以減少免疫反應。但是，固定可促進鈣化，導致瓣膜衰壞，因此這仍然是不完善的解決方案。有時，瓣膜來自人組織捐獻者(即，異體或同種瓣膜)，但這些是有限的來源。
[0010]因此有多種不同類型的瓣膜植入物在使用。瓣葉所附著的管狀結構的形式和材料會帶來變化。在一些情況下，可以將織物“裙”與其它材料結合起來以充當管狀部分。有許多不同的設計在使用。在一種“漏斗”型結構中，僅有附著到支架的瓣葉。在另一種常見的組合中，三個瓣葉和合成(PTFE)管包含在支架內。在第三種實施方案中，已清潔并固定的動物(例如牛)瓣膜附著在支架內側；支架內側還可具有一管。在另一變形中，線框為縫合瓣葉和管提供了支撐。
[0011]給患者裝上心臟瓣膜通常是通過開心手術，或通過微創手術的，微創手術稱為經導管主動脈瓣植入術(TAVI)，其使用圍繞傳遞導管的折疊的瓣膜。微創血管修復技術具有許多明顯的優點，包括住院時間較短、手術創傷降低以及在某些患者群體中可觀察到較低死亡率和/或較少并發癥。這些優點快速推動了臨床采用經導管的方法。在心臟瓣膜修復中，與之前通過開心手術進行標準治療相比，TAVI顯著降低了某些患者群體的死亡率(參見，例如M.B.等人的“Transcatheter aortic-valve implantat1n for aortic stenosisin patients who cannot undergo surgery (不能手術的患者經導管主動脈植入用于治療主動脈狹窄)”，N.Engl.J.Med.，(2010) Oct 21 ;363 (17): 1597_607Epub 2010S 印 22)。在TAVI中，植入術包括進入中型動脈，其通常包括實施球囊瓣膜成形術(以破壞現有的瓣膜)，然后，需要將新的瓣膜通過進入血管路徑引入，布置在瓣膜位置處或附近，例如在心臟/主動脈交界處。TAVI是一個微創方法的例子，但根據患者的情況，已開發出依賴可折疊瓣膜的其它微創方法(經心尖、經皮等)。TAVI可用以置換主動脈瓣、肺動脈瓣、三尖瓣、二尖瓣，或靜脈瓣膜。
[0012]然而，與TAVI傳遞的瓣膜相關的并發癥仍然存在。目前的傳遞組件(折疊的瓣膜和布置導管)體積大，難以推動通過導向心臟較大血管的較小血管。同時還發現，即使與開心手術相比，這些手術受中風發病率較高以及大血管并發癥的困擾，這主要是由于瓣膜組件體積太大。因此，對于設計用于TAVI的裝置來說，最緊迫的挑戰是降低傳遞組件的截面積。然而，即使(合成)管狀結構可設計成盡可能薄，收獲的而非制造的生物組分(例如動物心包)僅能在一定的厚度范圍內可用。可以使用多種處理技術來制造較薄的組織，但是這些處理是具有挑戰性的，并且可能產生不了可接受的材料。固定的心包還可觸發免疫反應或鈣化，導致瓣膜隨時間降解和衰壞。已固定的心包還可能是堅硬的，彎曲性質差，可能難以壓入導管內。其在瓣膜中的使用壽命過程中也很容易剝離。
[0013]除了基于動物的組織外，近年來也已設計了來自基于人的組織的多種結構。據觀察，在抗壞血酸化合物存在下進行培養過程中，貼壁細胞如成纖維細胞，能夠在細胞之間和培養表面上沉積大量的細胞外基質蛋白。結果，可從培養支撐物剝離活組織的粘性塊并用在手術中，所述活組織的粘性塊由活細胞和這些細胞產生的細胞外基質蛋白組成(參見，例如，美國專利6，503，273)。
[0014]通常，細胞培養物持續數天至數周后會被微生物污染，細胞死亡，從培養表面剝離，或縮成小聚集體，任一聚集體會防止有活力結構的有效產生。然而，粘性組織薄片可使用成纖維細胞培養物持續4-5周以及長達7周產生(參見，例如，Lj Heureux, FASEBJ.，(1998), 12:47-56以及美國專利7，112，218)。這種方法與當時組織工程的一般想法相反，一般的想法是最小化培養時間，以降低污染的風險，減少總生產時間，從而降低成本。
[0015]由這些培養方法形成的活結構可用于產生活的且完全生物的結構例如具有高機械強度的血管，而不需要人工或其它外源性骨架(參見，例如，Lj Heureux, N.等人，“A completely b1logical tissue-engineered human blood vessel (完全生物的組織工程人血管)”，FASEB J.(《美國實驗生物學會聯合會會志》)，(1998), 12:47-56 ；Lf Heureux, N.等人，“Human tissue-engineered blood vessels for adult arterialrevascularizat1n (用于成人動脈血管重建術的人組織工程血管)”，Nature Med.(《天然藥物》)，(2006) Mar ；12(3):361-5.Epub 2006Feb.19 ;以及 McAllister 等人的美國專利7，166，464和7，112，218，全部文獻通過引用并入本文中)。制造和使用這樣的組織結構的方法有時被稱為自組裝組織工程(“TESA”)(參見，例如，Peck, Μ.等人的“Tissue engineering by self-assembly (自組裝組織工程)，，，Materials Today (《今日材料》)，14，218-224 (2011) ；Peck, Μ.等人，“The evolut1n of vascular tissueengineering and current state of the art (血管組織工程演變和本領域當前狀態)”，Cells Tissues Organs (《細胞組織器官》)，195，144-158，(2012)，兩份文獻均通過引用并入本文中)，或僅僅“組織工程”。
[0016]這種方法的一個主要優勢是，組織由天然的(即，未經修飾、未固定、未變性)細胞外基質制成，所述天然細胞外基質比合成材料或已固定的動物組織更相容。這種天然細胞外基質也是有利的，因為其可被身體重塑，并潛在地與患者一起生長。同樣，該基質不會引起顯著的降解性免疫反應，因其為人來源。另外，組織還可培養至包含活細胞(自體和/或異源)以改善重塑、免疫可接受性和/或其生理功能。
[0017]所得組織依靠培養支持物可具有不同的形狀和大小(薄片、條帶、線和顆粒，如美國專利6，503，273和7，166，464、美國專利申請公布2010-0189792以及國際專利申請公布W02012/145756中描述的，所有文獻通過引用結合到本文中)。以這種方式制造組織薄片的方法被稱為基于薄片的組織工程(SBTE)，其形成的基本構造塊是組織的平面薄片。使用SBTE從八周齡的組織薄片培養物產生完全生物的、活的自體人血管(參見，例如，V Heureux, N.等人，Nature Med.(《天然藥物》)，(2006)，12 (3): 361-5)。使用這種方法，機械性質類似于天然血管的組織工程血管可在體外構建，而不需要加入外源材料或合成骨架。長達三年的觀察點表明，這些完全生物的人移植物在人中是安全的(參見，例如，McAllister, T.N.等人,“Effectiveness of haemodialysisaccess with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentrecohort study (自體組織工程血管移植物的血液透析通路的有效性:多中心群組研究)”，Lancet (《柳葉刀》)，(2009), 373:1440-6 ；Garrido, S.等人，“Haemodialysisaccess via tissue-engineered vascular graft(經由組織工程血管移植物的血液透析通路)，，，Lancet, (2009), 374:201 ;L，Heureux, N.等人，“Tissue-engineered blood vesselfor adult arterial revascularizat1n (用于成人動脈血管重建的組織工程血管)”，N.Eng.J.Med.(《新英格蘭醫學雜志》)，(2007)，357:1451-3)。
[0018]在本文描述的技術之前，已構建了組織工程制備的存活瓣膜。包含組織工程部分的瓣膜僅為研究主題，并未用于人體。目前制備組織工程瓣膜的方法按照已在其它結構中嘗試和測試的方法進行，并涉及將合成骨架(其提供了必備的機械強度)與活細胞結合在一起。最有前景的工作已獲得植入同種動物的動物瓣膜，即用動物細胞產生的瓣膜。(參見，例如，Sutherland, F.W.等人，“From stem cells to viable autologoussemi lunar heart valve (從干細胞到活自體半月形心臟瓣膜)”，Circulat1n (《循環》)，111，2783-2791 (2005);以及 Sodian, R.等人，“Early in vivo experience withtissue-engineered trileaflet heart valves (組織工程三尖心臟瓣膜的早期體內經歷)”Circulat1n, 102, 11122-29，(2000)，兩篇文獻均通過引用結合到本文中。)這些瓣膜作為肺動脈瓣置換物植入，很可能是因為肺動脈的低壓是比其它地方更寬松的環境。
[0019]之前使用組織薄片產生心臟瓣膜的嘗試依靠將多層薄片堆疊在一起(參見，例如，美國專利申請10/198，628和10/495，748，兩篇專利均通過引用結合到本文中)。堆疊薄片主要是獲得比另一結構例如血管一般所需的更大的機械強度。堆疊前，每一薄片的培養時間據稱是少至三周(LaFrance，H.等人，美國專利申請10/198，628)，與以前組織工程使用的一般組織培養時間一致。但是，多層的使用涉及復雜的產生過程，并往往產生易于分層的瓣葉，因為堆疊的薄層缺乏粘附性。
[0020]因此，需要一種通過組織工程產生瓣膜例如心臟瓣膜的方法，其在使用過程中具有足夠的機械強度并且不會分層。
[0021]本文背景的討論用于解釋技術的情況。在此并不承認所有涉及的材料在所附權利要求的 優先權日:是已經公開的，已知的或者是公知常識的一部分。
[0022]在整個申請的說明書和權利要求書中，詞語“包括(comprise)”及其變形，例如“包括(comprising) ”和“包括(comprises) ”并不意圖排除其它添加劑、成分、整體或步驟。


【發明內容】

[0023]本公開內容解決了患者瓣膜例如心臟瓣膜的修復問題。特別是，本公開內容包括單層組織薄片，其具有2kgf-6kgf的擊穿強度，可用在瓣膜植入物的構建中。本公開內容進一步包括制造這種組織薄片的方法，以及制造包含這種組織薄片的瓣膜植入物的方法。
[0024]在本文描述的技術中，與之前產生的薄片相比，組織薄片的培養時間延長3倍或以上。培養薄片超過24周的可行性已被證實，并且薄片的強度在這么長的培養時間內達到前所未有的強度。
[0025]本文描述的這種技術不限于通過微創技術引入的瓣膜。應理解，本文描述的任何瓣膜植入物可經由開放性手術方法弓丨入患者中。
[0026]本公開內容提供了擊穿強度為2kgf-6kgf的單層組織薄片。該單層組織薄片包括貼壁細胞和由這些細胞產生的細胞外基質。該單層組織薄片可通過培養25-52周的時間形成。
[0027]擊穿強度為2kgf_6kgf的單層組織薄片內可具有一條或多條細胞合成的線。
[0028]瓣膜植入物包括管狀結構及連接至管狀結構的兩個或多個瓣葉，其中兩個或多個的瓣葉每個都包含擊穿強度為2kgf-6kgf的單層組織工程薄片。
[0029]單層組織薄片可自身折疊一次或多次。
[0030]本公開內容包括制備組織工程瓣膜植入物的方法，該方法包括:培養擊穿強度超過2kgf的組織薄片；從該組織薄片切割兩個或多個的瓣葉；將兩個或以上的瓣葉附著到支架上，從而制成瓣膜植入物。
[0031]本公開內容進一步包括修復心臟瓣膜的方法，該方法包括:將組織工程心臟瓣膜折疊到導管上；以及將組織工程心臟瓣膜通過導管傳遞到位，其中，所述組織工程心臟瓣膜包括由組織工程薄片制成的兩個或多個瓣葉。
[0032]本公開內容還進一步包括制造單層組織薄片的方法，該方法包括:用一個或多個組織控制棒(tissue control rod)在培養皿中培養一細胞群超過20周，以制得包含細胞和由該細胞產生的細胞外基質的薄片；以及在此期間和兩周后，用與該細胞群相同的細胞系的細胞懸液接種薄片，其中所述接種進行2-6次。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1:顯示了正常人皮膚成纖維細胞的兩種細胞系的結果；每種情況下，右邊的柱是USTS。在左邊的圖中，如前所述，對于兩種細胞系中的每種，培養8周的薄片與25周齡的USTS進行擊穿強度比較。USTS顯示4.4-和5.8-倍的強度增加。在右邊的圖中，如前所述，培養8周的薄片與25周齡的USTS進行強度/厚度比的比較。USTS顯示2.7-和3.7-倍的強度/厚度比增加。
[0034]圖2:根據切割標記(頂部)將很大程度上干燥的USTS (底部)切割，以形成心臟瓣膜的三個瓣葉。每個半月瓣葉是單層的組織薄片。干燥過程令薄片看起來透明。切割標記包括組織分配以形成阿朗希烏斯小結(三瓣葉相遇的地方)。半月瓣葉通過一段組織連接在一起，所述一段組織將折疊以形成較厚的區域，用于安全縫合瓣葉的上面區域以形成接合處。這是許多可能的瓣葉設計中的一個例子，可根據本文方法和說明書構建。
[0035]圖3:來自圖2的相同切割USTS縫到PTFE制成的合成管狀結構上，以形成三尖瓣用于證明的目的(非植入物)。USTS是含水的，并且每一尖瓣由單層組織薄片制成。瓣葉彼此相鄰地縫合在一起以形成瓣葉的接合處，與管狀結構并列。尖瓣的自由邊緣相接觸以在接合區域處封住血管。
[0036]圖4:是反壓(backpressure)下從頂部看圖3的瓣膜(在體內，這是從主動脈觀察的圖)。反壓充斥尖瓣竇(cusps’ sinuses)并迫使它們閉合。瓣葉的接合處清晰可見。其它組織可以形成阿朗希烏斯小結或能夠在體外或在體內重塑過程中使組織收縮。
[0037]圖5:由USTS制成的組織工程瓣葉(底部)折疊以形成直邊，而細胞合成的線置于兩層之間以沿最大應力的軸提供額外的強度。顯示了兩種設計:在自然的設計中，纖維的組織與工程化的設計相比沒有那么對稱。USTS并不融合在一起。天然的牛心臟瓣葉顯示在頂部用于對比。
[0038]圖6:在縫合線牽拉測試過程中獲得的力與應變圖，該測試首先讓USTS收縮至其原始長度60%，然后用0.5%戊二醛交聯(三角形)，以及USTS在固定前不收縮(“X”)來進行。
[0039]圖7:在相同的線加強USTS樣品上進行的測試的縫合線牽拉結果。從不同的位置和從不同的方向牽拉進行縫合線。垂直于線，在材料內側相同的距離處向外牽拉縫合線I和2。縫合線I僅從組織牽拉，不穿過線。縫合線2比縫合線I需要多46%的力來拉出。縫合線3和4對比了將縫合線從組織薄片拉出和將縫合線縱向穿過線拉出。顯示的數據是每一縫合結構η個樣品的數據。每一根柱顯示為原始數字和百分比(例如，對于縫合1，±llgf 以及 15% )。
[0040]不同附圖中的相同標記符號表不相同的兀素。

【具體實施方式】
[0041]本文的技術涉及用于靜脈位置內的瓣膜，或置換心臟瓣膜，其中瓣膜的一個或多個部分通過組織工程制造。
[0042]應用基于薄片的組織工程進行瓣膜置換和修復具有許多優點。厚度受控的堅固生物組織薄片尤其適合產生用于導管傳遞的瓣膜，因為包含這種組織工程材料的瓣膜的截面積(通常稱為“截面”)比用外源或尸體組織例如心包制造的瓣膜的截面積要小。因為大體積物體例如瓣膜的傳遞總是在放置時對動脈或靜脈造成一些損傷，所以，小型物體可提供顯著的臨床優勢。因為組織工程材料是通過受控方法制造，所以，與收獲的組織相比，它們也具有提供的薄片厚度平均和結構均勻的優點(例如，它們不包含血管、脂肪沉積、鈣化點或其它缺陷)。這降低了對連續的質量控制(QC)監控和測試工程化組織的需要，提供了顯著的經濟優勢。此外，制造方法還保證了起始材料的無菌性，這是用例如來自屠宰場的材料不能完成的。由于組織在體外制造，其還可制備以滿足瓣膜生產的特定需求(例如，特定形狀、不同厚度和在需要的地方包含加強結構)，并以多種方式進行區域性調節(加強)。此外，組織工程還具有使用人組織代替外源組織的優點，這可具有免疫學、重塑和商業的優勢。且不論瓣膜設計或應用如何，由人組織制造的瓣葉不會被免疫系統大力排斥，并且能被積極地重塑和整合到接受者的周圍組織中。這通過避免鈣化和結構性降解改進了瓣膜的長期作用。因為組織是人的，所以不需要化學固定來抵抗生物降解機制。未經固定的人組織相比于固定的生物移植物較不容易鈣化，具有較好的機械性質(包括柔韌性)，較不容易形成血栓，將具有生長潛能并可整合到周圍組織中以獲得長期穩定性。在管狀結構也由完全的生物組織工程材料制成的設計中，免疫反應的缺少和積極的重塑會增加出現較好結果的可能性。最后，人制品比動物組織對患者更具吸引力。
[0043]生產適用于制造血管的組織薄片的方法已在其它地方描述，參見，例如美國專利7，166，464和6，503, 273，其通過引用結合到本文中。通過使用貼壁細胞例如成纖維細胞，將其接種到細胞培養基上，并在抗壞血酸化合物存在下在體外培養數周，可獲得堅固的薄片。已發現，培養4-8周的薄片已足以產生組織工程血管(參見，例如，L’ Heureux等人，FASEB J., 12:47 - 56 (1998)；以及 L’ Heureux 等人，Nature Med.(2006) 12 (3):361 -5)。一旦薄片獲得所需應用足夠的強度，其可被合適地操作。
[0044]在使用人組織薄片的初始工作中，它們通常培養4-5周(參見，例如，L’ Heureux等人，FASEB J.，12:47 - 56(1998))。在后期的研究和隨后的臨床試驗中，通常使用培養8周的薄片(參見，例如，L’Heureux 等人，Nature Med.(2006) 12 (3): 361 - 5，McAllister 等人,Lancet, (2009), 373:1440-6 ；Garrido 等人,Lancet, (2009), 374:201 ;以及 L’Heureux等人，N.Eng.J.Med.，(2007)，357:1451-3)。
[0045]超強組織薄片
[0046]采用本文的技術開展組織工程來制造瓣膜，已由以下事實實現:細胞事實上可在無菌條件下培養非常長的時間，大大長于之前預期的，以形成組織薄片，本文所稱的超強組織薄片(USTS)。因此培養時間可從4個月延長至12個月。生產組織工程材料用于制造瓣膜的其它培養時間包括:20周、24周、25周以及時間范圍25-30周、30-40周以及40-52周。時間還可用天來表示，例如:120-150天；135-145天；160-170天；170-180天；200-220天；210-280天；280-350天；以及300-365天。可以假定，每一范圍的上下端點可用任何其它引用的端點互換，以提供本文完全描述的其它培養時間范圍(例如210-300天)。通過本發明方法產生的組織薄片在本文中被稱為USTS。這是具有高強度特征并包含單層組織的組織薄片。
[0047]USTS的強度還可通過在培養周期內連續接種細胞改進。通常，與薄片生長來源相同的細胞系的細胞懸液可接種在拓展中的薄片上。可以與開始培養的密度相同的細胞密度來接種，或以高得多的細胞密度，例如起始濃度的5倍、10倍或20倍進行接種。這種額外的接種可在培養的任何時間進行，但通常在開始培養后2周以及培養結束前4周進行。這種額外的接種可在培養時間內進行許多次，例如2-6次，但優選2-3次。
[0048]培養可發生在生物反應器內，例如美國專利7，744，526中描述的。培養還可輔以使用一種或多種物體，被不同地稱為組織控制棒或組織操作設備或其它類似的機械設備，所述機械設備可輔助薄片在生物反應器中形成，錨定薄片以防止意外的薄片剝離或收縮，或從生物反應器中移除后幫助操作薄片。合適的機械設備包括金屬夾鉗，例如L型(包括直角)構造的，以及連續的金屬環例如圈。當組織薄片收縮時，在使用兩個或多個夾鉗來限制生長組織薄片的地方，優選防止夾鉗相互重疊。例如，可采用一些形式的機械限制來防止多兩個夾鉗顯著地從它們的初始構造移動，從而保持組織薄片繃緊。由于培養時間長，以及為了避免該時間內污染的風險，生物反應器通常是可封閉的培養瓶，或頂部具有狹窄開口的培養瓶。
[0049]可通過采用本文描述的延長的培養時間在體外產生的組織薄片，其具有超過之前描述的任何其它體外產生的組織薄片的機械強度。之前不理解的是，這樣長的培養時間會導致所得組織的機械強度增加。例如，由多薄片或薄片的多層形成的卷狀或層狀結構的機械強度在7周的培養時間后并不增加(參見，例如，L’Heureux等人，FASEB J., 12:47-56 (1998)和美國專利申請10/198，628)。
[0050]為成功生產這種機械性強的組織工程結構，如本領域技術人員理解的，需要對組織培養裝置進行高度的監督和管理，主要是避免在培養時間內發生污染的可能性。由這些條件可產生由均勻的組織單層組成的非常堅固的組織，而不用依靠堆疊或融合方法，其使用短時間培養的組織的多個薄片來產生復合組織。
[0051]迄今為止，涉及堆疊和融合的組合的方法是用組織薄片制造強機械性結構的標準方法。(參見，例如，L’Heureux 等人，FASEB J., 12:47 - 56 (1998) ;L’Heureux 等人，N.Eng.J.Med.(2007)，357:1451-3 ;Michel, M.等人，“Characterizat1n of a newtissue-engineered human skin equivalent with hair(與頭發相當的新組織工程人皮膚的表征)”，In Vitro Cell Dev.B1l.-Anim., (1999)，35:318-26 ;L，Heureux, N.等人，“Ahuman tissue-engineered vascular media:a new model for pharmacological studiesof contractile responses (人組織工程血管媒介:收縮反應的藥理研究新模型)”，FASEBJ., (2001) ； 15:515-24.；Haraguchi, Y.等人,“Regenerative therapies using cellsheet-based tissue engineering for cardiac disease (使用基于細胞薄片的組織工程用于心臟疾病的再生療法)”，Card1l.Res.Pract.，(2011): 845170，全部通過引用納入本文中。)這些方法具有數個缺點:1)它們形成的組織可能堅固，但是厚，并因此難以在靜脈內定位；2)它們依賴于薄片融合在一起(漫長的、不可預見的并且常是不完整的方法，依賴于細胞活性和施加的力)；以及最重要地，3)所得組織薄片堆疊在心臟瓣膜運作的環境那樣苛刻的環境中容易分層。
[0052]通常通過用圓頭活塞確定擊穿薄片所需要的力來評估薄片強度。之前已報到過，采用活塞頭8 -1Omm,薄片擊穿強度可高達800 -1, OOOgf (參見,例如，V Heureux等人,Nature Med.(2006) 12 (3): 361 - 5 ;美國專利 7，166464 ；7.504，258 和 8，076，137 ;以及Peck, Μ.等人，“Tissue engineering by self-assembly (自組裝組織工程)，，MaterialsToday, 14，218-224，(2011))。根據此測量方法，測得的擊穿強度根據使用的工具而變化。通過以下獲得此處引用的值:用9.6_直徑的圓頭活塞(球)測量以及通過用夾鉗設備固定的組織薄片驅動以提供具有25_直徑的薄片暴露圓形部分。當用較小的尖端例如Imm尖端測量時，測定值可能會更低。通過本文描述的延長的細胞培養技術，可證明薄片擊穿強度可重復地達到2kgf,并常超過4kgf (圖1),并可進一步超過5kgf。這與本文描述的方法一致，當用1mm球測量時，可制得擊穿強度在5-6kgf之間的USTS。這表示，強度是本領域其它地方描述的那些培養較短時間的組織的2.5-5倍。事實非常意想不到，純粹由培養的細胞獲得的完全生物薄片而不需任何外源性支架或不需化學或物理改性就可達到這種強度，這在以前從來未顯示過，并且與其所屬領域中的常規想法相反。正是這意料之外的強度使得能夠使用單層USTS創建非常強的組織，而其他人則會假定需要融合的多層組織薄片。
[0053]本文描述的USTS的厚度難以精確地測量，因為該組織是可壓縮的，并且當例如試圖夾起來以測量其厚度的時候會變薄。但是，厚度范圍在200-400微米對于瓣葉是合理的。較厚的薄片，比如說厚達500-600微米的薄片也是可能的,而厚度小至150微米的較薄組織也是可能的。一般來說，所得USTS的厚度通常是通過培養時間的長度來控制。
[0054]此外，由本文描述的方法產生的USTS不僅出人意料地比本領域之前描述的薄片要強，而且還具有比那些薄片的強度/厚度比高大約300% (見圖1)。這對于設計適用于TAVI的截面積減少的心臟瓣膜是至關重要。由于本技術的一個目標是為了減少瓣膜的截面面積(截面直徑)，因此使用具有更好的強度/厚度比(即，較薄，但具有與之前使用的材料相同的強度)的瓣葉材料是達成這個目標的好方法。
[0055]USTS意想不到的強度允許單層瓣葉設計成足以媲美天然組織。為描述材料的強度，工程師使用一定量，稱為極限拉伸強度(UTS，或“應力”)。此定量是“材料性質”或“固有”定量，即，其依賴于尺寸，并描述單軸拉伸試驗中破壞材料每單位橫截面積需要的力。天然的人主動脈瓣葉據報道最大的UTS為2.6土 L 2MPa。(參見，例如，Balguid，A.，Rubbens，Μ.P., Mol, Α.等人，“The role of collagen cross-links in b1mechanical behav1r ofhuman aortic heart valve leaflets—relevance for tissue engineering(膠原交聯在人主動脈心臟瓣葉生物力學性能中的作用-對于組織工程的相關性)”，Tissue Eng.(《組織工程》)，2007 ;13:1501-11。)本文描述的USTS的UTS經測定為4.7±0.6MPa左右，無任何化學或物理修飾。初步數據表明，使用簡單的甲醛固定，此強度可再增加30%。同樣，USTS由于高含水量而高度可壓縮。使用壓縮的厚度，其UTS增加了大約3倍。再次，這種非常高的強度“密度”使得USTS獨特地適合需要薄和粘合結構的組織工程應用，所述結構也是非常堅固，例如對于瓣膜，且特別是設計用于TAVI的瓣膜。異種牛心包的UTS是壓縮的USTS的大約2倍，但考慮到天然組織的UTS，瓣葉生產可能不需要這么高的強度(參見，例如，Vincentelli, A.等人，J.Heart Valve Dis.1998 ;7:24-9)。目前，在選擇用于 TAVI應用的正確心包方面需要大量的努力。至今，小牛和豬的心包都有使用。特定的材料可通過辨別整個心包囊中最薄的點進行選擇。心包可以是比組織工程薄片每單位厚度更強的材料，但是不能獲得任意厚度的心包，因此在選擇合適的樣品時需要大量的質量控制。
[0056]單薄片設計還具有利于瓣膜形成的優點。形成超強組織薄片的獨特能力使組織工程能夠解決之前不能成功解決的應用。例如，在美國專利申請10/198,628中，體外產生的用于制造心臟瓣膜的組織薄片依靠每瓣葉至少堆疊和融合五(高達九)薄片，但甚至這是否會產生足夠的強度都從來未經證實。形成堆疊的薄片僅培養了3周。沒有公開內容描述以這種方式構建的瓣膜的所得特性；應用中也沒有提供任何機械或功能數據。因為本文的方法不依靠堆疊和融合策略來達到足夠的強度，所以可以構建不容易分層的優良瓣膜。即使在固定的動物組織制得的生物瓣膜中，植入后瓣葉的分層也已成為一個問題，這表明組織薄片的堆疊尤其不適合用于瓣膜中(參見，例如，Mirnajafi, A., Zubiate, B.和Sacks, M.S., “Effects of cyclic flexural fatigue on porcine b1prosthetic heart valveheterograft b1materials,(豬生物假體心臟瓣膜異種移植物生物材料上的周期性彎曲疲勞作用)”J.B1med.Mater.Res.，A 94，205 - 213 (2010))。例如，已發現天然豬瓣膜的瓣葉由3層制成(兩較厚較強的層將較弱的層夾在中間)。盡管瓣膜天然地在動物的生命周期中不容易分層，但是在人應用中固定瓣膜會使其變硬，移除一些細胞組件，從而使其弱化。
[0057]一旦形成，具有足夠強度的組織工程薄片可切成瓣膜組件例如瓣葉的形狀。在優選的實施方案中，單個USTS在體外產生，并用以產生瓣膜的每一瓣葉。組織工程領域的技術人員將獲知，在可通過例如USTS形成瓣葉的地方，對于TAVI或其它應用，存在大量瓣膜設計。本文描述的組織薄片可用以產生組件，以將合成瓣膜置換成任何類型的心臟瓣膜，包括:主動脈瓣、肺動脈瓣、三尖瓣、二尖瓣或靜脈瓣膜。本文中，使用組織薄片的合成瓣膜可設計成可折疊的并通過導管傳遞，或設計成通過開放性手術技術進行傳遞。瓣葉附著到的結構可以是可折疊的支架、自膨脹的支架或由金屬線和/或生物兼容性聚合物制成的不可折疊框架。此結構還可由生物可降解聚合物、組織薄片、另一USTS或細胞合成的線制成(例如，如美國專利申請公布2010/0189792)。組織薄片附著到的結構可發揮雙重作用，作為傳遞裝置(例如，支架)的一部分，以及作為瓣膜管狀部分的一部分。在一些情形中，支架還可提供彈簧似的結構以幫助打開和閉合瓣膜。
[0058]USTS比之前制造的薄片在形成用于TAVI的瓣膜方面適合得多，因為用在TAVI中的瓣膜在折疊和布置時緊緊地合攏，這個過程因此容易使由融合堆疊制成的層狀薄片分層。此外，本文描述的單USTS比任何之前報道的體外產生的組織薄片具有更高強度的每單位厚度。結果，與通過堆疊多層較薄薄片形成的瓣葉相比，USTS形成更薄的瓣葉，其具有相同或更大的強度。因此，用于TAVI的瓣膜可產生比堆疊的薄片更小的截面形狀(或用動物例如牛的心包)。組織工程領域的技術人員將承認，為瓣膜組件提供較小的截面形狀是開發改進的下一代技術中最重要的工作之一(如果不是最重要的話)。
[0059]瓣膜設計
[0060]本領域技術人員將認識到，USTS非常適合用于許多不同的瓣膜設計。USTS可如本文其它地方所描述那樣來構建，不需要堆疊和融合步驟，其中可存在使用組織薄片的瓣膜設計，所述組織薄片自身折疊以形成兩個，或多達4個組織層。在此情況下，由于USTS的固有強度，組織的這些層不需要例如通過細胞的作用(例如之前LaFrance等人描述的美國專利申請10/198，628)或通過壓縮(例如美國專利7，521，431中描述的)彼此融合。在一些設計中，USTS的部分可使用外源粘合劑膠合在一起。在一些設計中，USTS的部分可與縫合材料或其它類型的線、手術鉗、激光焊接或其它本領域已知的方法連接在一起。有許多理由需要多層組織，包括但不限于:1)將USTS裹在支架或瓣膜的其它非生物組件上；2)增加瓣葉的機械強度；3)形成較厚或較強的區域以更容易或有效地將USTS縫合到自身或瓣膜的另一組件，以及4)形成瓣膜的管狀結構。
[0061]由于多種原因，包括增加機械強度、改進縫合強度或松弛度，改進接合，或改進血液動力學，USTS還可被集中、起皺或打褶，以形成組織密度的區域改變，獨立于堆疊薄層。(參見圖2-4)。接合是瓣膜操作過程中瓣葉相互閉合過程的名稱。當血在一個方向上流動時，瓣膜的葉打開；當血壓降低，瓣葉密封以防止血液倒流的線是接合線。
[0062]包括USTS的瓣膜還可包括組織工程的細胞合成線。這種線的例子描述在美國專利申請公布2010-0189792中。可定向和區域性地添加這些線以增強USTS，形成較強的瓣葉、將一個或多個USTS縫合在一起，或將瓣葉縫合到其它不同的組件上，例如血管支架或瓣膜的管狀結構(見圖5)。
[0063]瓣膜可整個由生物組織形成，所述生物組織在體外由以下兩種或多種的任意組合產生:通過其它地方描述的方法產生的組織薄片，例如美國專利6，503，273、本文描述的USTS、細胞合成線和接種到瓣膜材料上以覆蓋它們的細胞，或放置于組織材料層間來接種再生細胞群的細胞(例如，通過在層內側引入骨髓細胞以將其重新填充)。用于此目的的合適再生細胞實例包括但不限于:肌成纖維細胞、肌細胞或其前體、平滑肌細胞或其前體、巨噬細胞、間充質干細胞、脂肪來源的干細胞、誘導的多能細胞、不同類型的未分化細胞或任意前面的細胞類型的組合。以這種方式產生的瓣膜相對于由尸體組織、非人組織，或合成材料，或那些材料的組合制成的植入物具有顯著的優勢。瓣膜還可包含USTS與任何其它現有的瓣膜假體組合，其中一個或多個瓣葉被USTS置換、加強或修復。瓣膜可利用本領域已知的任何方法用USTS組裝，所述方法使用組織薄片例如心包作為起始材料。
[0064]成纖維細胞是生產USTS的優選的細胞類型，這些薄片也可使用其它細胞類型來產生，例如但不限于:肌成纖維細胞、肌肉細胞或其前體、平滑肌細胞或其前體、巨噬細胞、間充質干細胞、脂肪來源的干細胞、誘導的多能細胞、不同類型的未分化細胞或任意前面的細胞類型的組合。使用的細胞系可以是有限細胞系、半連續細胞系或連續細胞系。某些干細胞在免疫原性方面具有關鍵優勢。但是，如本文描述的基于薄片的組織工程方法，是不限于特定細胞類型的。任何細胞類型或細胞類型的組合可用于產生具有足夠強度的薄片。此夕卜，自身不產生USTS的細胞還可以與產生USTS的細胞混合，以提供所需的優點，例如但不限于:加速的USTS生產、改進的機械性質、免疫兼容性、提供代謝或分泌活性、增加血液兼容性(例如通過將內皮細胞放在薄片上以避免薄片材料上的血液凝固)，以及限制血栓形成或有利于體內組織整合、重塑或表現。
[0065]制成USTS的細胞可來自患者(自體)、捐獻者(同種異體)或動物(異種)。薄片還可使用經遺傳修飾的細胞以:分泌特定因子、增殖更快或更久、具有更好的存活率、具有更低的營養需求、促進愈合、處理缺陷、治愈疾病或具有其它優勢。特別令人感興趣的是使用經遺傳修飾的細胞產生細胞外基質(ECM)成分的量比未修飾細胞通常產生的量要大。以這種方式產生的ECM成分可包括但不限于:膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、腱生蛋白、原纖蛋白、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸肝素、硫酸角蛋白和多功能蛋白聚糖。同樣，細胞可經修飾以產生該細胞天然不會產生而由其它細胞類型或其它活生物體產生的基質(例如，絲、殼聚糖、纖維素)。最后，細胞可經遺傳修飾以產生在自然界找不到的ECM成分，例如，具有修飾的氨基酸序列的ECM分子或長度在自然界通常找不到的ECM分子。
[0066]此外，薄片可在外源性元素存在下培養，所述外源性元素變成薄片的一部分，并最終變成所得瓣葉或瓣膜的一部分。這些元素可在薄片生長期間的任意時間添加。所述元素包括結構例如蛋白聚集體、天然或合成纖維如合成縫合線或腸線和礦物質，以及塑料或金屬裝置。它們可包括的物品例如:針、吻合器、藥物傳遞裝置和磁性或電子裝置，例如射頻識別標簽。除了提供識別的方法，這些設備還可用來方便或增強基于USTS的進一步操作、機械強度、儲存、手術用途或結構的愈合。特別關注的是通過生長到薄片內，將細胞合成線(或條帶)納入，如申請PCT/US07/85148所描述的。
[0067]通常，薄片通過在5%:95%的CO2:空氣混合體中，于37°C下在培養基的許可基質上培養貼壁細胞來獲得，所述培養基包含鹽、糖、脂肪、蛋白質、生長因子和抗壞血酸化合物。大量培養條件可導致USTS形成，包括但不限于:使用動物或人血清或血清提取物作為蛋白質、脂肪、生長因子或其它生物大分子的來源，其可促進細胞生長和/或ECM生產；使用合成的、純化的或重組的生長因子、脂肪、蛋白質、糖或其它生物大分子，其也可促進細胞生長；使用所謂“無血清”培養基，其具有重要的調節優勢；使用較低或較高濃度的氧氣、CO2或其它氣體；使用25°C _45°C之間的溫度；使用pH范圍為4.0-10.0之間的培養基；使用帶表面圖案的培養基質以改善細胞附著、細胞生長、細胞定向、細胞表型、細胞外基質沉積，或在薄片內產生區域性差異；使用經覆蓋的培養基質以改善細胞附著、細胞剝離、細胞生長、細胞定向、細胞表型、細胞外基質沉積，在薄片內產生區域性差異或特定細胞的篩選；使用帶有特定幾何形狀的培養表面以促進瓣膜形成或在薄片厚度、強度、組織構成方面產生區域性差異。
[0068]薄片和瓣膜處理:
[0069]由于本文描述的技術不依靠堆疊和融合策略，USTS在其納入到瓣膜組件階段不需要是活的。因此，USTS可在組裝過程的任意步驟之前、之后或中間滅活。滅活可以是完全或部分滅活，并且其可通過本領已知的一種或多種方法達到，包括但不限于:干燥；加熱；冷卻；冷凍；添加化合物例如酸、酶、抗體、洗滌劑、鹽、毒素或溶劑；或施加各種形式的能量，包括但不限于超聲、基于電磁或顆粒的輻照、機械力例如離心、流體流動或滲透壓。滅活可具有其它作用，或為除了滅活本身外的目的實施，例如但不限于:增加機械強度；降低免疫原性；或改善移植結果。
[0070]此外或作為替代，USTS還可去細胞化(即，移除細胞碎片)。其可在組裝過程任意步驟之前、之后或中間去細胞化。去細胞化可以是完全的或部分的。去細胞化可通過本領域已知的任何方法達到，例如但不限于:使用溶劑、酸、化合物、酶、洗滌劑、滲透壓或它們的任意組合，包括使用相同的方法進行重復處理。此過程可用不同的機械處理、流體灌注或暴露到不同能量來源或它們的任意組合來改進。
[0071]除此以外或作為替代，在組裝過程的任意步驟之前、之后或中間，USTS或所得瓣膜可用生物試劑進行覆蓋，例如但不限于:外源性細胞外基質蛋白、抗血小板或抗血栓形成試齊U、天然或重組DNA或RNA、轉染試劑、抗體、生長因子、抗生素、抗增殖劑或它們的片段，或它們的任意組合。在組裝過程的任意步驟之前、之后或中間，還可用新的細胞接種USTS或所得瓣膜。該細胞可以是與用于USTS生產的那些相同或不同的類型，或細胞群的組合。這些細胞還可以是通常自身不會形成USTS的細胞，例如內皮細胞、間皮細胞、角化細胞、神經元、膠質細胞、胰島細胞、肝細胞或其它可提供所需優點的細胞。這些細胞可來自患者(自體)、非自體人細胞(同種異體)、動物細胞(異種)、經遺傳修飾的細胞(人或動物)或它們的任意組合。
[0072]本領域技術人員將進一步理解，固定可用一系列廣泛的化學試劑在不同的靜態或動態條件下(例如壓力、溫度、灌注、拉伸、壓縮)處理不同的時間段。
[0073]此外或作為替代，USTS或所得瓣膜可用差不多強大的交聯試劑處理包括醛，其可用以實現完全或部分的滅活、降低免疫原性作用、減緩生物降解、改善機械性質或附著化學或生物化合物。在組裝過程的任意步驟之前、之后或中間可使USTS交聯。其可在機械應力下交聯以獲得所需機械性質、獲得所需物理尺寸、改進移植、愈合、功能性或其它所需性質。
[0074]可以使活的USTS在培養過程中收縮，以改善其一個或多個機械性質。一種這樣的性質是柔軟度(與剛度相對)或彈性，其對于促進瓣膜組裝以及改善瓣膜功能性是重要的。此外，縫合的固定強度(材料抵抗縫合線牽拉，即縫合針跡劃開的能力)也可通過收縮得到改善。可通過將USTS切離任何組織操作設備例如L鉗來使其在培養時收縮，例如通過解開相互鎖定的L型鉗或通過將L型鉗切離(L型鉗的使用在下文實施例1中描述)。可在USTS生產過程中的任何時間開始收縮，并可在培養物中進行數天至數周的時間。收縮還可通過將薄片的邊緣固定在一定尺寸進行限制。收縮還可限制在薄片特定的軸或方向。可使用在薄片培養過程中以受控方式改變尺寸的任何鉗夾設計。模式復雜的收縮能夠區域性地調節薄片的機械性質和纖維方向。這種區域性調節對改進縫合固定強度是有利的。此外，可有意地產生各向異性的機械性質以改善瓣葉的性能或模擬天然組織生物力學。培養過程可在收縮發生后繼續。收縮可用多個步驟實現，在多個時間間隔后，鉗夾更加地靠近。一些步驟可包括增加鉗夾的距離，從而有效地拉伸薄片。收縮后或收縮過程中交聯的薄片特別受到關注，其提供了具有有利機械性質例如彈性和強度的彈性組織。
[0075]活USTS還可在培養過程中通過動態施加力到薄片上進行機械調節。本領域技術人員將理解，有許多方法施加動態力，這些力可用不同強度和頻率施加，并且這些力可在不同方向上施加。對于那個目的，可使用許多不同類型的生物反應器。
[0076]USTS的其它用途
[0077]USTS的獨特強度在其它應用中也有用的，例如靜脈瓣、經覆蓋的血管支架、血管內移植物、血管移植物、血管補片、心臟補片、裂孔疝補片、骨科補片、軟組織修復或置換、隔膜修復設備、韌帶或肌腱修復或置換、皮膚創傷修復或置換，或許多其它的健康相關應用中的任一種(這些地方現在使用的是(生物的或合成的)材料薄片)。
[0078]實施例
[0079]實施例1:由活組織USTS形成的瓣膜
[0080]此實施例描述了使用USTS形成瓣膜的一種方法。在此實施例中，所得瓣膜是活組織，其排除了使用終端滅菌或固定步驟。因此，所有組裝步驟都用無菌液體和儀器在無菌環境下進行。對于USTS、細胞類型、細胞來源、細胞年齡、細胞系、培養條件、瓣葉形狀、瓣葉數量、縫合材料、縫合方法、瓣膜框架類型或瓣膜的意圖用途，此描述并不意圖限制此發明的范圍。本領域技術人員可容易地認識到，該方法可進行不同的修飾而不會背離本發明的范圍和精神。
[0081]通常，薄片通過在T-225cm2燒瓶中培養正常人皮膚成纖維細胞而獲得。細胞以10，000個細胞/cm2的密度接種在DMEM中，其補充有Ham F12(20% )、胚胎克隆牛血清(20% )、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U)、鏈霉素(100mg/ml)和抗壞血酸鈉(500mM)，并于37°C培養在5%:95%的CO2:空氣混合物中。每周3次將用過的培養基換成新鮮的培養基。大約一周后，在燒瓶中引入由0.D.線(304不銹鋼)制成的兩個L型互鎖鉗。這兩個L型鉗有效地在燒瓶周圍形成框架，在培養過程中，框架將埋入USTS中并有效地將其錨定。在燒瓶外并置于其下的框架可用以放置磁鐵以將L型鉗固定到位。這些鉗是如美國專利7，504，258中描述的組織操作裝置，該專利通過引用并入本文中。在25周的培養周期后，用熱絲將燒瓶切開，在埋入的L型鉗幫助下移出薄片。將濕薄片放在切割表面，并用模具切割成3個瓣葉。整個過程均通過培養基保持瓣葉潤濕。用6-0PTFE縫合線將瓣葉縫到管狀支架上(大約28mm的0.D.)。如果瓣膜將于同一天植入的話，活瓣膜于4°C儲存在培養基中。如果植入稍后進行，將活瓣膜于37°C置于5%:95%的CO2:空氣混合物中。瓣膜曲附(crimped)在傳遞球囊周圍，成薄片并無菌包裝(packaged)。按照介入性心臟病的標準醫療操作瓣膜傳遞至目標解剖位置。
[0082]實施例2:冷凍保藏的瓣膜
[0083]在此實施例中，瓣膜不是活的。如實施例1所描述的生產USTS，但在25周培養時期結束時移除培養基，用無菌蒸餾水(WFI “注射用水”，Hyclone)清洗薄片，并將燒瓶儲存在-80°C冰箱中。此儲存時期可以是短期(例如，數小時)至長期(例如，數年)。需要時，將燒瓶解凍，如實施例1所描述的將薄片用于瓣膜組裝。因為在冷凍保存過程中沒有特別注意保持細胞活力(例如，沒有使用冷凍介質，沒有控制冷凍速度)，因此，僅有少數(如果有的話)細胞存活。瓣膜可用簡單的磷酸鹽緩沖鹽水于4°C下長時間儲存，直至植入。這種儲存條件將導致所有細胞死亡。當準備用于植入患者體內時，瓣膜曲附在傳遞球囊周圍，成薄片，并無菌包裝。按照介入性心臟病標準醫療慣例將瓣膜傳遞至目標解剖位置。
[0084]實施例3:脫水瓣膜
[0085]此實施例描述了制備無活性瓣膜的另一種方法。如實施例1所描述的生產USTS，但在25周培養時期結束時移除培養基，用無菌蒸餾水(WFI “注射用水”，Hyclone)清洗薄片，并使薄片脫水。將脫水薄片長時間(數小時至數年)儲存于室溫、4°C或-80°C。需要時，將WFI吸到燒瓶中，并使薄片復水(通常I小時至24小時)。然后，如實施例1所描述的將薄片用于瓣膜組裝。正常的人細胞經脫水不會存活。瓣膜可用簡單的磷酸鹽緩沖鹽水于4°C下長時間儲存，直至植入。將瓣膜曲附在傳遞球囊周圍，成薄片，并無菌包裝。按照介入性心臟病標準醫療操作將瓣膜傳遞至目標解剖位置。
[0086]實施例4:無菌瓣膜
[0087]在此實施方式中，無活性瓣膜在非無菌條件下組裝，而經最終滅菌。使用無菌技術產生USTS并如實施例2或3中描述的進行無菌儲存，然后非無菌操作組織，但仍然處于與生產用于人體移植的醫療器械相當的清潔度水平下。這極大地簡化了組裝過程，部分是因為組裝可在具有受控的空氣的潔凈室內進行，而非無菌操作臺中。一旦組裝好瓣膜，將瓣膜曲附到傳遞球囊周圍，成薄片，并包裝。最后的組裝是使用25kGy劑量的Y輻照進行滅菌。
[0088]實施例5:折疊USTS形成的瓣葉
[0089]在此實施方式中，以單片形式從USTS中切出瓣葉及其鏡像的形狀。將此單片沿對稱線(虛構的鏡子)折疊以形成最終的瓣葉。由兩層USTS有效地制成此瓣葉。瓣葉的自由邊緣是USTS折疊的地方。這是此方法的重要特性，因為自由邊緣是最容易分層的瓣葉邊緣，因其它邊緣將縫合在一起并縫合到瓣膜支架。此瓣葉設計不需要瓣葉的兩層融合來形成功能性瓣膜。此瓣葉設計可按照實施例1-4描述的任一方法用來建立瓣膜。
[0090]實施例6:三層瓣葉
[0091]在此實施例中，產生三層瓣葉。首先，如實施例5中描述的，以單片的瓣葉及其鏡像的形狀切出一塊USTS。然后，從USTS切出瓣葉的形狀并放在第一片上面，以第一片的對稱線對齊瓣葉的自由邊緣。瓣葉準確地覆蓋第一片的一半。然后，如實施例5描述的折疊第一片。此瓣葉設計不需要瓣葉的三層融合來形成功能性瓣膜。此瓣葉設計可按照實施例1-4描述的任一方法用來建立瓣膜。
[0092]實施例7:收縮的USTS
[0093]在此實施例中，USTS能夠在培養時收縮，可通過將其切離L型鉗并通過固定距離將兩相對的邊緣重新附著，從而能夠在一個方向上收縮一定水平。例如，28周齡的USTS可從其L型鉗釋放，并能夠在培養時收縮7天，然后在0.5%戊二醛溶液中固定24小時(以提供交聯)。在圖6中，顯示了在戊二醛固定前縫合線牽拉試驗的結果，該試驗將收縮的USTS的行為與未收縮的USTS的行為進行對比。可觀察到兩種結果。首先，收縮的組織更兼容，因為對于給定的力，其比未收縮的組織拉伸更多(在此情形中高達20% )。第二，收縮的組織更能抵抗縫合線牽拉(更高的縫合線固定強度)，因為拉出縫合線需要的極限力比未收縮薄片高許多(70% )。
[0094]實施例8:結合USTS的細胞合成線
[0095]此實施例展示了細胞合成線如何通過與USTS結合用以改進瓣葉生產。細胞合成線是紡織品狀的產品，由培養的人成纖維細胞產生的細胞外基質構建(如美國專利申請12/515，397所描述的)。這些線可以以各種尺寸和強度產生，并可納入到瓣葉設計中，所述瓣葉設計用于模擬宏觀上在天然心臟瓣尖中可見的厚膠原纖維(見圖5)。這些線的策略性放置可將一些機械負載直接轉移到瓣膜框架(即，用于可折疊瓣膜的支架，或用于不可折疊瓣膜的由各種聚合物/金屬/織物/組織制成的環狀或管狀結構)。在一個實驗中，在15周將細胞合成的線接近置于薄片上，將該結構進一步培養10周。此時，線埋入了 USTS中，并在戊二醛(?1%)中固定組織。圖7顯示了縫合線牽拉實驗的結果，表明在USTS中，力口入細胞合成線可改進縫合線固定強度46%至117%，取決于線的取向。或者，線可縫在USTS內以提供支撐而不需要嵌入。線還可用作縫合線材料，以將瓣葉組裝到瓣膜框架或支架，或將瓣葉縫合在一起。
[0096]實施例9:
[0097]在此實施例中，細胞合成的線與實施例5中產生的兩層瓣葉結合。細胞合成線可放在USTS的兩層之間，并大致平行于自由邊緣，以提供周邊支撐。不同的布置是可以的(圖5)。將細胞合成線的末端固定在瓣膜框架或支架上。這可通過將線綁到框架或支架上，或將線縫合而達到。在此實施方式中，不將線埋入USTS中。
[0098]本文引用的所有文獻均通過弓I用以其整體結合到本文中。
[0099]前面的描述是為了說明本技術的不同方面。而不旨在以本文記載的實施例來限制所附的權利要求的范圍。本發明現已完整公開了，本領域技術人員應當明白，在不背離所附權利要求的精神或范圍下，可以做出多種改變和修改。
【權利要求】
1.一種單層組織薄片,其具有2kgf至6kgf的擊穿強度。
2.根據權利要求1所述的單層組織薄片，其包括貼壁細胞和由貼壁細胞產生的細胞外基質。
3.根據權利要求1所述的單層組織薄片，其通過培養25-52周的時間形成。
4.根據權利要求1所述的單層組織薄片，其通過培養25-30周的時間形成。
5.根據權利要求1所述的單層組織薄片，其進一步包含一條或多條組織工程線。
6.一種瓣膜植入物，其包括: 管狀結構；以及 與管狀結構連接的兩個或多個瓣葉， 其中，所述兩個或多個瓣葉中的每個瓣葉包含擊穿強度2kgf至6kgf的單層組織工程薄片。
7.根據權利要求6所述的瓣膜植入物，其中，所述單層組織薄片自身折疊，使得每個瓣葉由兩層組織構成。
8.根據權利要求6所述的瓣膜植入物，其進一步包含一條或多條細胞合成線。
9.制備組織工程瓣膜植入物的方法，所述方法包括: 培養擊穿強度超過2kgf的組織薄片； 從組織薄片切割出兩個或多個瓣葉；以及 將所述兩個或多個瓣葉附著到支架上，從而形成瓣膜植入物。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述培養包括培養組織薄片20-52周的時間。
11.根據權利要求9所述的方法，其進一步包括在切割前使組織薄片脫水。
12.根據權利要求9所述的方法，其進一步包括在瓣膜形成后對其滅菌。
13.根據權利要求9所述的方法，其進一步包括在培養過程中使薄片收縮。
14.由權利要求9所述的方法產生的瓣膜植入物。
15.—種修復心臟瓣膜的方法,所述方法包括: 將組織工程心臟瓣膜折疊到導管上；以及 將組織工程心臟瓣膜通過導管傳遞到位， 其中所述組織工程心臟瓣膜包含由組織工程薄片制成的兩個或多個瓣葉。
16.制備單層組織薄片的方法，所述方法包括: 在培養皿內放置一個或多個組織控制棒，培養細胞群超過20周，制得包含細胞和由這些細胞產生的細胞外基質的薄片；以及 在培養期間以及培養兩周后，使用與所述細胞群相同的細胞系的細胞懸液接種薄片， 其中，所述接種進行2-6次。
【文檔編號】A61F2/24GK104302245SQ201380025715
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年3月25日 優先權日:2012年3月23日
【發明者】N·勒赫, T·麥卡利斯特, N·迪塞爾 申請人:細胞移植組織工程有限公司