miR-218-5p化合物作為慢性疼痛標志物和在治療炎癥性慢性疼痛藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種應用miRNA制備抑制炎癥性性疼痛藥物，尤其是涉及miR-218-5p化合物的用途，包括：(1)篩選miR-218-5p靶標基因并通過報告基因進行驗證，利用完全弗氏佐劑(CFA)制作炎性慢疼痛模型小鼠；(2)利用miR-218-5p模擬物增加該miRNA在炎癥慢性疼痛小鼠脊髓表達量；(3)利用Western?blot法檢測miR-218-5p對CFA致炎癥慢性疼痛的SYNGR1蛋白表達的抑制作用；(4)檢測miR-218-5p抑制炎癥慢疼痛狀態的脊髓神經元活動標記物c-fos的表達。本發明工藝簡單成本低，采用miR-218-5p有效的抑制了炎性慢性疼痛，為慢性疼痛的防治提供有效干預靶點。具體是miR-218-5p化合物作為慢性疼痛標志物的用途和在制備治療慢性疼痛藥物中的用途。進一步對慢性疼痛病人的血液臨床標本進行了定量分析，表明miR-218-5p能作為慢性疼痛發生的標志物。
【專利說明】miR-218-5p化合物作為慢性疼痛標志物和在治療炎癥性慢性疼痛藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微小RNA分子的用途，尤其是涉及miRNA在炎性慢性疼痛中的用途，具體是一種miR-218-5p化合物作為慢性疼痛標志物和在治療慢性疼痛藥物中的應用，屬于生物醫學材料【技術領域】。
【背景技術】
[0002]疼痛是臨床上最常見的癥狀之一，長期存在的病理性疼痛伴發著心理和情緒疾病給慢性疼痛患者在生活上帶來了難以忍受的折磨。據統計，全球慢性疼痛的患者高達3.2億，全世界各國政府投入了大量的人力及每年上千億美元的財力試圖去攻克這一難題，僅在中國就存在數以億計的疼痛患者，這無疑是人類目前迫不及待需要解決的難題。
[0003]神經細胞中含miRNA較其他組織細胞多，miRNA在突觸部位的選擇性聚集或缺失，可以調節突觸局部的基因表達和蛋白合成，影響神經細胞突觸功能。神經系統疾病，比如帕金森、精神分裂癥、老年癡呆、亨廷頓病、神經母細胞瘤等都與miRNA表達和功能異常相關。
[0004]盡管miRNA與慢性疼痛關系的研究尚處起步階段，但已有少量基礎研究提不miRNA可能參與痛覺調制。miRNA為新藥的開發提供了一個全新思路，很可能是一個有效的藥物標靶。Bai等人通過對大鼠咀嚼肌內注射完全弗氏佐劑(CFA)造成炎癥性肌肉疼痛動物模型，并利用熒光實時定量PCR(qPCR)與原位雜交技術對不同時間點三叉神經節內神經元特異的 miRNA 的表達分析發現，患側 miR-10a、miR_29a、miR-98、miR_99a、miR_124a、miR-134及miR-183等較健 側均有不同程度的表達水平下調，這表明炎癥性疼痛與神經元特異的miRNA表達水平之間存在著一定聯系。隨后,Favereaux等研究了 miR-103介導慢性疼痛的發生過程，發現CFA疼痛小鼠脊髓背角miR-103表達明顯降低，當脊髓背角miR-103過表達時，鈣離子通道 Cavl.2-LTC(Cav1.2-comprising L-type calcium channel)的表達則明顯降低，小鼠痛閾顯著升高。
[0005]關于miR-218_5p作為一種慢性疼痛疾病臨床診斷標志物和在制備治療慢性疼痛藥物中的應用目前尚未見報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種miR-218_5p化合物作為慢性疼痛疾病臨床診斷的標志物及其應用。采用化學合成的miR-218-5p有效的降低炎性慢性疼痛閾值，并抑制神經元活動標志蛋白c-fos的表達，從而進一步明確了炎性慢性疼痛的發病機制，為防治提供有效的干預靶點。
[0007]本發明的另一目的在于提供miR-218_5p化合物作為制備治療慢性疼痛藥物的應用。
[0008]本發明的一種應用miRNA制備抑制炎癥性性疼痛藥物，包括:
[0009](I)篩選miR-218_5p靶標基因，并進行驗證，利用完全弗氏佐劑對小鼠足底進行注射，制作炎性慢疼痛模型小鼠；
[0010](2)利用miR-218-5p模擬物增加該miRNA在小鼠脊髓的表達量；
[0011](3)利用Western blot法檢測miR-218_5p模擬物對CFA誘導的SYNGRl蛋白表達的抑制作用；
[0012](4)檢測miR-218_5p抑制炎癥慢疼痛狀態的脊髓神經元活動標記物c-fos的表達。
[0013]所述步驟⑴中的CFA注射量為40微升。
[0014]所述步驟(2)中的miR-218-5p模擬物為包含miR-218_5p核酸序列“莖一環”結構的發夾狀結構，其主序列如下附表1 (I)。
[0015]作為疼痛抑制基因，miR-218_5p能顯著抑制慢性疼痛的發生。對慢性疼痛病人的血樣標本進行定量分析發現，miR-218-5p在病人血樣中的表達也是明顯下調。研究結果表明通過檢測或干涉神經中樞中miR-218-5p的表達可為慢性疼痛的診斷或治療提供新的方案。
[0016]有益效果:
[0017]本發明工藝簡單，成本低，采用化學合成的miR-218_5p有效的降低了炎癥慢性疼痛熱激閾值，從而進一步明確了炎性慢性疼痛的發病機制，為防治提供有效的干預靶點及藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為CFA狀態下小鼠脊髓miR-218_5p差異表達；
[0019]圖2為鞘內注射miR-218_5p模擬物降低CFA小鼠疼痛閾值；
[0020]圖3為計算機軟件分析顯示SYNGRl的3’非翻譯區存在一個miR-218_5p的作用靶點；
[0021]圖4為miR-218-5p能夠抑制攜帶SYNGRl靶序列螢光素酶的相對活性；
[0022]圖5為miR-218_5p能夠抑制神經可塑性相關基因SYNGRl蛋白水平的表達；
[0023]圖6為miR-218_5p能夠有效減少炎癥狀態脊髓神經元標志物c_fos的表達。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0025]1、CFA慢性關節炎疼痛模型制備及脊髓水平miR-218_5p表達:
[0026]SPF級雄性6周昆明雄性小鼠在異氟醚麻醉下，圍繞左后足足跖關節部選擇兩點皮內注射無菌完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA ;Sigma公司)40 μ 1，該注射濃度可誘導產生關節炎。在注射后的24小時即出現熱和機械痛覺閾值的降低并可維持3周以上。
[0027]MiR-218-5p的表達分析:運用miRNA檢測試劑盒對miR-218_5p進行熒光定量分析，結果顯示，CFA三天小鼠脊髓表達量發生顯著下調表達(附圖1)。[0028]2、采用miR-218_5p模擬物在體過量表達脊髓miRNA。
[0029]采用合成miR-218-5p的RNA序列。先將miR-218_5p用脂質體包裹:脂質體與5%葡萄糖液按2:3比例混勻后，迅速加入等體積的miR-218-5p (25 μ Μ)溶液，充分混勻，室溫下靜置10分鐘后應用，即為脂質體miR-218-5p混合物。再將混合物進行鞘內注射:每只小鼠每天麻醉后，注射2次miR-218-5p (25 μ Μ)，每次10 μ 1，每次時間12小時，注射后注射器停留組織內60s，共2天，最后一次注射2h后開始檢測。
[0030]疼痛行為監測:熱痛覺過敏:將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上,按Hargreaves法用熱輻射刺激以照射大鼠足底緊貼玻璃板部位。記錄照射開始至大鼠出現抬足時間，截止時間為20s。每只動物測定3次，取其平均值，每次測定時間間隔5min。結果表明，鞘內注射miR-218-5p模擬物后可顯著降低疼痛閾值(附圖2)。
[0031]3、miR-218_5p靶基因的篩選方法
[0032]運用Ta rgetScan, PicTar等軟件檢索miR-218_5p可能的祀基因，發現SYNGRl基因的3’非翻譯區(3’UTR)含有I個miR-218-5p的靶位點(附圖3)，靶位點序列見附表I (2)。選定神經可塑性相關基因SYNGRl作為候選被調控基因。
[0033]4、報告基因驗證SYNGRl是miR-218_5p的靶基因
[0034]構建psiCHECK2-SYNGRl-3’ UTR重組質粒，與miR-218_5p模擬物共轉染工具細胞293T，轉染24h后凍融細胞一次，用專用裂解液裂解細胞，每孔10ul，吹打均勻，充分裂解后樣品備用。采用Promega公司的螢光素酶檢測試劑盒,在1.5ml離心管中加入LAR工工50ul和裂解液5ul混勻，酶標儀檢測螢火蟲螢光素酶；加入50ulStop&Glo溶液滅活螢火蟲螢光素酶，酶標儀檢測海腎螢光素酶。結果顯示，轉染scRNA對螢光素的表達無影響。而轉染miR-218-5p模擬物后螢光素的表達分別下降了約40%左右(見附圖4)。
[0035]5、利用Western blot法檢測miR-218_5p模擬物對CFA誘導的SYNGRl蛋白表達的抑制作用
[0036]制備CFA炎性慢疼痛小鼠，鞘內注射miR-218_5p模擬物，2天后取小鼠脊髓腰膨大區蛋白樣品進行電泳。電泳時，按每孔20ug蛋白上樣量等量上樣。以150V電泳1.5h，100V電壓下轉膜lh。將膜放入自封袋中，加入5 %脫脂奶粉/TBST，完全浸泡膜并封口，于室溫下振蕩封閉lh。加入TBST稀釋后SYNGRl或對照GAPDH抗體一抗(抗血管緊張素I型受體抗體按1:1000稀釋，抗GAPDH抗體按1:1000稀釋)，4°C振蕩孵育過夜。吸凈一抗，TBST漂洗膜5min X3 ;加入稀釋后的二抗(均為1:5000稀釋)，水平搖床室溫孵育lh。吸凈二抗，TBST漂洗膜，5min X3，等體積混合ECL (AB液)，充分覆蓋濕潤NC膜表面，靜置Imin ;于暗室中用保鮮膜將NC膜封好，將X光片平放于NC膜上顯影并記錄數據。結果可見，在CFA的刺激下，脊髓腰膨大區SYNGRl蛋白的表達量明顯升高。然而鞘內增加了 miR-218-5p模擬物的表達量后，CFA誘導的SYNGRl蛋白的表達量明顯下降。(見附圖5)
[0037]6、免疫組化檢測鞘內注射miR-218_5p模擬物c_fos表達
[0038]石蠟切片置于67°C烘箱中，烘片2小時，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘(3X3’)。取一定量pH = 6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2X3’。每張切片加I滴3% H202，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3X3’。去除去PBS液，每張切片加I滴相應的第一抗體(c-fos抗體)，室溫下孵育2小時。PBS沖洗3X5’。除去PBS液，每張切片加I滴聚合物增強劑，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3 X 3’。除去PBS液，每張切片加I滴酶標抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3X5’。除去PBS液，每張切片加I滴新鮮配制的DAB液(二氨基聯苯胺)，顯微鏡下觀察5分鐘。蘇木素復染，0.1% HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。鞘內增加了 miR-218-5p模擬物的表達量后，CFA誘導 的c-fos蛋白的表達量明顯下降。(見附圖6)
【權利要求】
1.一種miR-218-5p化合物作為慢性疼痛疾病標志物。
2.一種應用miRNA制備抑制炎癥性慢性疼痛藥物，包括: (1)篩選miR-218-5p靶標基因，并進行驗證，利用完全弗氏佐劑對小鼠足底進行注射，制作炎性慢疼痛模型小鼠； (2)利用miR-218-5p模擬物增加該miRNA在小鼠脊髓的表達量； (3)利用Westernblot法檢測miR-218_5p模擬物對CFA誘導的SYNGRl蛋白表達的抑制作用； (4)檢測miR-218-5p抑制炎癥慢疼痛狀態的脊髓神經元活動標記物c-fos的表達。
3.根據權利要求2所述的一種應用miRNA制備抑制炎癥性慢性疼痛藥物，其特征在于:所述步驟(1)中的CFA注射量為40微升。
4.根據權利要求2所述的應用miRNA制備抑制炎癥性慢性疼痛藥物，其特征在于:所述步驟(2)中的miR-218-5p模擬物為包含miR-218_5p核酸序列“莖一環”結構的發夾狀結構，其主序列如下:5’ -ACAUGGUUAGAUCAAGCACA-3’。
【文檔編號】A61P29/00GK104031999SQ201410251115
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月7日 優先權日:2014年6月7日
【發明者】曹君利, 李燕強, 楊俊霞 申請人:徐州醫學院