專利名稱：炎癥因子TNFα刺激人ACAT1基因表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和基因治療領域，更具體而言，涉及炎癥條件下的人ACATl 基因表達調控研究領域。
背景技術：
動脈粥樣硬化是導致冠心病、中風等心腦血管病的最危險因子。由ACAT合成的膽 固醇酯在泡沫細胞內的聚集是動脈粥樣硬化病灶中形成的主要標志。 在動脈粥樣硬化形成過程中，酰基輔酶A :膽固醇酰基轉移酶(ACAT，
Acyl-coenzyme A :cholesterol acyltransferase， EC2. 3. 1. 26)起著重要的作用。 ACAT是人細胞內唯一催化長鏈脂肪酸和游離膽固醇形成膽固醇酯的酶，在生物
體內發揮重要的生理功能，是維持體內膽固醇及其脂類代謝平衡的關鍵酶之一。ACAT在
生命細胞游離膽固醇更新變化、維持血液膽固醇水平等平衡代謝中起關鍵作用，病理上與
膽固醇及其脂類代謝平衡紊亂引起的動脈粥樣硬化病變、高膽固醇血癥、老年性癡呆癥
(Alzheimer' s disease)等疾病直接相關，是國際前沿密切關注的極重要的篩藥靶標。 長期以來，篩選ACAT的特異的抑制劑成為一些制藥公司競相研究的熱點。 但這些抑制劑的特異性較差，毒副作用較大。而且，由于天然形式的ACAT蛋白還
沒有純化成功，因此尋找ACAT特異有效的抑制劑還很困難。所以，開展基因水平的工作，對
深入研究ACAT的作用機制與結構功能及其與相關疾病的關系，顯得極為重要，這也是目前
唯一切實可行的途徑。 ACAT包括ACAT1和ACAT2。 ACATl基因(Acatl)在人體組織細胞廣泛表達，而ACAT2 基因(Acat2)主要在肝腸組織細胞特異表達。 1993年，美國達特茅斯(Dartmouth)醫學院Chang TY實驗室首次克隆具有活性 功能的人ACATl cDNA(4011bp)，其開放閱讀框編碼550個氨基酸序列(Chang TY等，1993， J Biol Chem， 268 :20747-20755) 。 ACATl cDNA及其編碼的氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO :2所示。 發明人實驗室對ACAT進行了系統深入的研究，發表了人ACATl基因組DNA組織 結構、啟動子序列，并且發現人ACATl mRNA序列分別來自于兩條不同的染色體(Li BL等， J Biol Chem， 1999,274 :11060-11071);發現與動脈粥樣硬化發生密切相關的細胞因子 IFN-y和糖皮質激素地塞米松(Dex)可增強啟動子活性而提高人ACATl基因的表達(Yang JB，等，J Biol Chem， 2001 ，276 :20989-20998 ;Yang L等，Cell Res， 2004， 14 :315-323)。此 外，ACAT1在動脈粥樣硬化斑塊中高表達，特別是在單核/巨噬細胞中(Chang TY等，1997， An皿Rev Biochem，66 :613-638 ;Miyazaki A等，1998， Arterioscler Thromb VascBiol， 18 :1568-1574)。這些表明ACATl基因功能的重要性和復雜性。 TNFa是一種廣泛存在的炎癥因子，在應對外界感染、參與免疫應答以及阻止腫瘤 的發生中有著重要的作用(Aggarwal BB等，1996 ;Ware CF等，1996)。 人TNFa具有26kD跨細胞膜的前體形式，被酶解而加工成為17kD含有157個氨基酸的成熟形式，被分泌到細胞外(Vilcek J等，1991)。活化的淋巴細胞、巨噬細胞、內皮 細胞和平滑肌細胞都能分泌TNF a (Libby P等，1991)。 特別值得注意的是TNF a在動脈粥樣硬化斑塊中高量存在(Ware CF等，1996)。 近年來有報道認為，TNFa與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關(Bran紐L等，2004)。分 子水平的研究發現，TNFa能夠調控多種動脈粥樣硬化相關基因的表達，包括增加人血管內 皮細胞表達ICAM-1和VCAM-1而促進THP-1細胞與之黏附(Zhou Z等，2007)、提高與動脈 粥樣硬化斑塊破裂相關的胞外基質金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9)的表達 (Heidinger M等，2006)、調控細胞攝取膽固醇的清道夫受體(CD36， SRA和LOX-1)以及介 導細胞夕卜排膽固醇的ABCAl (ATP-binding cassette transporter A 1)的表達(Boyer JF 等，2007， HsuHY等，1996， Kume N等，1998， Gerbod-Giannone MC等，2006)。這些報道顯示 TNF a參與了動脈粥樣硬化的多個過程。 雖然，現有技術中已知人ACATl和TNFa在動脈粥樣硬化斑塊中含量都很高，且 在動脈粥樣硬化的形成過程中起著重要的作用，但是由于基因調控和生物化學過程的復雜 性，現有技術中并未給出TNF a與ACAT1 二者之間存在任何調控關系的啟示和報道。
綜上所述，本領域迫切需要明確與ACAT1基因表達相關的物質，通過基因水平的 研究明確其作用靶位，深入研究ACAT的作用機制與結構功能及其與膽固醇及其脂類代謝 平衡紊亂引起疾病(尤其是動脈粥樣硬化病變、高膽固醇血癥、老年性癡呆癥等)的關系。 這對于這些疾病的治療和藥物篩選顯得極為重要，也是目前唯一切實可行的途徑。
發明內容
本發明的目的正是揭示TNFa與ACAT1 二者之間的調控關系，并從基因水平上進 一步明確調控所涉及的功能性元件。 在本發明的第一方面，提供了一種TNFa剌激應答序列，其具有SEQ IDN0 :3所示 的序列，艮卩5' -CCTGGCAACCTGGGGACC A ￡￡A_3'。 在本發明的一個實施方式中，所述序列是SEQ ID N0:3所示的序列。
在本發明的另一個實施方式中，所述序列位于ACATl基因轉錄起始位點上游。
在本發明的一個實施方式中，所述序列為ACAT1基因轉錄起始位點上游 的-100 -79所示的區域。 在本發明的一個實施方式中，TNFa剌激作用于所述應答序列，并使得ACAT1基因 轉錄增強。 在本發明的第二方面中，提供了一種通過基因工程方法獲得的含有本發明所述的 TNF a剌激應答序列的細胞。 所述的細胞可通過如下方法獲得利用本發明的TNFa剌激應答序列進一步構 建相應含有該特異性區域與報告基因質粒系統，通過轉染各種細胞而整合進入細胞基因組 內，進一步的反復篩選可獲得穩定表達報告基因的細胞株。該細胞株具有應答TNFa剌激 的特征，進而可應用于大規模的新藥篩選研究。 由此，本發明還進一步提供了一種構建可應用于大規模新藥篩選的細胞的方法， 所述方法包括利用本發明的TNFa剌激應答序列構建含有該特異性區域與報告基因質粒 系統；通過轉染各種細胞而使所述系統整合進入細胞基因組內；進一步的反復篩選可獲得
4穩定表達報告基因的細胞株。 在本發明的第三方面中，提供了一種篩選治療膽固醇代謝異常相關疾病的藥物的 方法，所述方法包括 使候選藥物和TNF a同時與含有本發明的TNF a剌激應答序列的細胞接觸；
在相同條件下，使TNF a與含有本發明的TNF a剌激應答序列的細胞接觸，作為陽 性對照； 測定所述細胞中ACAT1基因的表達水平； 如果用候選藥物處理的細胞中ACAT1基因的表達水平與陽性對照相比有所降低，
則表明所述候選藥物可用作治療膽固醇代謝異常相關疾病的藥物。 在一個優選例中，所述藥物選自蛋白質藥物、多肽藥物、或核酸藥物。 在另一優選例中，所述候選藥物具有與所述TNFa剌激應答序列相對應的序列或結構。 在另一優選例中，所述細胞是通過基因工程方法獲得的含有本發明所述的TNFa 剌激應答序列的細胞。 在另一優選例中，所述膽固醇代謝異常相關的疾病選自動脈粥樣硬化、高膽固醇 血癥或老年性癡呆癥，優選所述疾病為動脈粥樣硬化。 在本發明的第四方面中，提供了一種篩選治療膽固醇代謝異常相關疾病的藥物的 方法，所述方法包括 使候選藥物與含有本發明的TNF a剌激應答序列的細胞接觸；
測定所述細胞中ACAT1基因的表達水平； 如果用候選藥物處理的細胞中ACAT1基因的表達水平與未用候選藥物處理的細
胞相比有所降低，則表明所述候選藥物可用作治療膽固醇代謝異常相關疾病的藥物。 在一個優選例中，所述藥物選自蛋白質藥物、多肽藥物、或核酸藥物。 在另一優選例中，所述候選藥物具有與所述TNFa剌激應答序列相對應的序列或結構。 在另一優選例中，所述細胞是通過基因工程方法獲得的含有本發明所述的TNFa 剌激應答序列的細胞。 在另一個優選例中，所述膽固醇代謝異常相關的疾病選自動脈粥樣硬化、高膽固 醇血癥或老年性癡呆癥，優選所述疾病為動脈粥樣硬化。 在本發明的第五方面，提供了一種本發明的TNFa剌激應答序列在篩選通過結合 所述TNFa剌激應答序列來抑制ACAT1基因表達從而治療與膽固醇代謝異常相關的疾病的 藥物中的用途。 在本發明的一個實施方式中，所述膽固醇代謝異常相關的疾病選自動脈粥樣硬
化、高膽固醇血癥或老年性癡呆癥。 在一個優選例中，所述疾病為動脈粥樣硬化。 在本發明的第六方面中，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有通過本發 明的方法篩選出的藥物和藥學上可接受的載體。 在一個優選例中，所述藥物組合物還含有治療膽固醇代謝異常相關疾病的其它藥物。
應理解的是，本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1 :炎癥因子TNF a增強人血單核細胞ACATl mRNA轉錄。 人血單核細胞用RPMI1640+7%人AB血清培養基培養48小時，之后在同樣培養基條件下，用不同濃度(如圖所示)的TNFa剌激40小時，收集細胞抽提總RNA。運用定量PCR方法檢測人ACATl mRNA的含量。結果顯示為相對ACATl mRNA含量，ACATl基因的mRNA含量用各自的內標基因GAPDH的mRNA含量進行校正，然后以無TNF a剌激的樣品作為1. 0得到ACATl基因表達的相對比例。 圖2 :炎癥因子TNF a增強人ACATl mRNA轉錄具有細胞特異性。
人單核細胞株THP-1、U937和HL60以及非單核細胞株HeLa和HEK293在各自的合適培養基中，在有或無5ng/ml TNF a剌激的條件下培養40小時，收集細胞抽提總RNA。運用定量PCR方法檢測人ACATl mRNA的含量。結果顯示為相對ACATl mRNA含量，ACATl基因的mRNA含量用各自的內標基因GAPDH的mRNA含量進行校正，然后以無TNF a剌激的樣品作為1. 0得到ACATl基因表達的相對比例。 圖3 :炎癥因子TNF a增強人ACATl mRNA轉錄具有細胞因子特異性。
炎癥因子TNFa增強人ACATl mRNA轉錄具有細胞因子特異性。在RPMI1640+10%FBS培養基中，用如圖所示濃度的不同細胞因子M-CSF， GM-CSF， MCP-l， IL_6， IL-IO，IFN-y， IL-IP和TNFa剌激單核細胞株THP-140小時，收集各樣品細胞并抽提細胞總RNA。運用定量PCR方法檢測人ACATl mRNA的含量。結果顯示為相對ACATl mRNA含量，ACATl基因的mRNA含量用各自的內標基因GAPDH的mRNA含量進行校正，然后以無TNF a剌激的樣品作為1. 0得到ACATl基因表達的相對比例。 圖4 :人ACATl基因轉錄起始位點上游的TNF a剌激應答區域鑒定。 圖4A為帶有人ACATl基因轉錄起始位點上游片段(-125/+34)的熒光素酶表達質
粒pM50及其含有人ACATl基因轉錄起始位點上游不同缺失的衍生質粒pD52、pD53、pD34和
pD35的簡易圖譜。 圖4B為各種熒光素酶表達質粒應答TNF a剌激的熒光素酶活性分析，將圖4A中對應的各熒光素酶表達質粒用DEAE-Dextran法轉染THP-1細胞，轉染7小時后用5ng/ml TNF a處理，40小時后收集細胞，用細胞抽提物進行熒光素酶活性分析。各樣品用各自P-半乳糖苷酶活力來校正獲得樣品熒光素酶活力；再以沒用TNFa處理的作對照，計算出相對熒光素酶活力。 圖5 :應答TNF a剌激的人ACATl基因轉錄起始位點上游功能性順式元件。
圖中，-125 +34為人ACATl基因轉錄起始位點附近的一段序列，+1表示轉錄起始位點。在人ACATl基因轉錄起始位點上游存在-22bp的TNFa剌激應答區域(-100 -79，用框標出)，其中下劃線部分為類NF- k B順式元件，黑體劃線i是TNF a剌激增強人ACATl基因轉錄應答的類NF- k B順式元件的特征性位點。
具體實施例方式
本發明人經過長期而深入的研究發現炎癥因子TNF a可特異性地增強人ACATl基因轉錄，且TNF a是通過人ACAT1基因轉錄起始位點上游的功能性順式元件對ACAT1的轉錄起到剌激作用。這些研究結果表明了TNFa與動脈粥樣硬化早期病變一泡沫細胞形成直接相關，因而顯示本發明為膽固醇代謝異常疾病提供更為直接的潛在篩藥靶標。在此基礎上，本發明人完成了本發明。 如本文所用，"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由構成"、"基本上由構成"、和"由構成"；"主要由構成"、"基本上由構成"和"由構成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。 如本文所用，術語"TNF a剌激應答序列"和"TNF a剌激應答區域"可互換使用，均表示具有SEQ ID N0:3所示序列的區域。TNFa可作用于本發明的所述剌激應答序列，并使得ACAT1基因轉錄增強。該序列優選位于ACAT1基因轉錄起始位點上游(例如ACAT1基因轉錄起始位點上游的-100 -79所示的區域)。 如本文所用，術語"ACAT"是酰基輔酶A :膽固醇酰基轉移酶(Acyl-coenzymeA :cholesterol acyltransferase)的縮寫。ACAT1基因(Acatl)作為ACAT中的一類在人體
組織細胞廣泛表達，且與膽固醇及其脂類代謝平衡紊亂引起疾病具有密切聯系。 具體而言，本發明人首先發現，在動脈粥樣硬化斑塊存在的炎癥因子TNFa特異
性增強人單核細胞分化過程中ACAT1基因表達。TNFa處理分化過程中的人血來源單核細胞和人源單核細胞株(THP-l、 U937和HL60)，均可檢測到顯著增強ACAT1基因的轉錄；而TNFa處理非單核細胞株(HeLa和HEK293)，對人ACATl基因轉錄無明顯影響。這些結果表明，TNFa增強人ACATl基因轉錄具有細胞特異性，提示TNFa特異性增強分化過程中的人單核細胞ACAT1基因轉錄而提高ACAT1的表達與酶活性，從而導致大量膽固醇酯合成堆積而形成動脈粥樣硬化早期病變 一 泡沫細胞。 本發明人進一步發現，在動脈粥樣硬化斑塊存在的其它細胞因子如M-CSF、GM-CSF、MCP-1、IL-1 P 、IL-6、IL-10和IFN-y (Alain T等，2006)的單一性處理，均未觀察到明顯增強人單核細胞ACAT1基因轉錄。這些結果表明，TNFa增強人ACAT1基因轉錄具有細胞因子特異性，提示TNFa在動脈粥樣硬化斑塊形成過程發揮特異的病理效應。
本發明人還進一步證明了 TNF a剌激是通過人ACAT1基因轉錄起始位點上游的應答序列，而發揮增強人單核細胞ACAT1基因轉錄功能作用。通過人ACAT1基因轉錄起始位點上游不同缺失的熒光素酶報告基因質粒轉染表達分析，發明人發現人ACATl基因轉錄起始位點上游存在一個22bp的TNFa剌激應答區域(-100 -79)。它的具體序列見圖5的標記框內序列(SEQ IDN0:3，5' -CCTGGCAACCTGGGGACCACCA-3')，其中下劃線部分為類NF- k B順式元件；與NF- k B順式元件的通用序列(5' -GGGRNNYYCC-3' ， R為嘌呤、N為任何堿基、Y為嘧啶)相比，黑體劃線i是TNF a剌激增強人ACAT1基因轉錄應答的類NF- k B順式元件的特征性位點(圖5)。這些說明，炎癥因子TNFa剌激人ACATl基因轉錄，是通過對應的功能性順式元件而導致特異的動脈粥樣硬化病理效應。 綜上所述本發明的發現，發明人證明了 TNFa與動脈粥樣硬化早期病變 一 泡沫細胞形成直接相關，因而顯示本發明為膽固醇代謝異常疾病提供更為直接的潛在篩藥靶標。同時，將促進深入闡明有關膽固醇代謝平衡生理功能與病理變化機理，可為相關臨床、藥物研究等提供理論依據和重要基礎。總之，本發明的上述幾方面發現，不但為治療膽固醇代謝異常疾病(如動脈粥樣硬化引起的冠心病、中風等疾病)提供新的途徑，而且在基礎理論研究上具有重要意義。 利用發明人發現的人ACAT1基因轉錄起始位點上游存在的這個22bpTNF a剌激應答區域(-100 -79)，可進一步構建相應含有該特異性區域與報告基因質粒系統，通過轉染各種細胞而整合進入細胞基因組內，進一步的反復篩選可獲得穩定表達報告基因的細胞株。該細胞株具有應答TNFa剌激的特征，進而可應用于大規模的新藥篩選研究。
實施例 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。 實施例l.細胞培養、刺激和總RNA (Total RNA)的制備及定量PCR(aPCR)分析
1.細胞及其培養 人血單個核細胞購自上海市血液中心，其中單核細胞的分離根據(ChengW，等1995)的方法進行。人血單核細胞用RPMI 1640+7X人AB血清培養基(lOOii g/ml卡那霉素、50U/ml鏈霉素和2g/L碳酸鈉)培養。 THP-1、U937和HL60細胞系購自ATCC(美國馬塞諸塞州，Manassas, USA)，用RPMI1640+10% FBS培養基(100 ii g/ml卡那霉素、50U/ml鏈霉素和2g/L碳酸鈉)培養。
HeLa和HEK293細胞系購自ATCC，用DMEM+10% FBS培養基(100 ii g/ml卡那霉素、50U/ml鏈霉素和2g/L碳酸鈉)培養。 上述細胞的培養條件均為95%濕度，5% C02，37°C。
2.細胞的剌激 將分離到的人單核細胞在RPMI 1640+7X人AB血清培養基中貼壁培養48小時，然后加入不同濃度的TNFa (分別為0，2. 5， 5， 10， 20ng/ml)剌激40小時，并收集細胞以抽提RNA。 細胞特異性實驗中，單核細胞株THP-1、 U937和HL60以及非單核細胞株HeLa和HEK293用5ng/ml TNF a剌激40小時，并收集細胞以抽提RNA。 細胞因子特異性實驗中，用不同濃度的細胞因子30或90ng/ml的M-CSF，80或240ng/ml的GM-CSF， 10或30ng/ml的MCP-1， 5或15ng/ml的IL-6， 10或30ng/ml的IL-IO，10或30ng/ml的IFN- y ， 5或15ng/ml的IL-1 P禾P 5或15ng/ml的TNF a分別剌激THP-1細胞40小時，并收集細胞以抽提RNA。 3.總RNA (Total RNA)的制備及定量PCR(qPCR)分析 在剌激細胞40小時后，用Invitrogen公司的Trizol Reagent抽提細胞總RNA (total RNA)，測定260nm的光吸收，計算其濃度。cDNA的合成采用20 y 1體系(4 y g總RNA為模板，O. 5iig寡(dT)12—18為引物，4111 2.5,1/L dNTP，4iU 5X第一鏈緩沖液(first strand buffer)，由1 ii 1 (200U/ii 1，購自Promega公司)莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(moloney murine leukemia virus reversetranscriptase， Promega)進行逆轉錄反
8應。在50 ill PCR反應體系中進行定量PCR反應，該體系中含有liil逆轉錄合成的cDNA
模板，10mM Tris-HCl， pH8. 3，50mM KC1， 1. 5mM MgCl2，0. 5mM dNTP，O. 5mM各對引物和5U的
Taq DNA聚合酶(TAKARA)。定量PCR(qPCR)所采用的儀器為Brilliant SYBR GreenqPCR
Master Mix禾口 Mx3005PTM定量PCR儀(Stratagene)。 擴增人源ACAT1基因產物的引物為 SEQIDN0:4:5' -GATGAAGGAAGGCTGGTGC-3';禾口 SEQIDN0:5:5' -GGAAGCTGGTGGCAGTGTAT-3'。 擴增人源GAPDH基因產物的引物為 SEQIDN0:6:5' -ACCCACTCCTCCACCTTTG-3';禾口 SEQIDN0:7:5' -CTGTAGCCAAATTCGTTGTCAT—3'。 人ACAT1 mRNA含量用內標基因GAPDH的mRNA校正，然后以無TNF a剌激的樣品作為1. O，得到ACAT1基因表達的相對比例。
4.實驗結果與結論 炎癥因子TNF a對分離到的人血單核細胞ACAT1 mRNA轉錄的作用結果如圖1所示。結果顯示用TNFa處理分化過程中的人血來源單核細胞，可檢測到顯著增強ACATl基因的轉錄。 細胞特異性實驗中，炎癥因子TNFa對不同細胞的ACAT1 mRNA轉錄的作用結果如圖2所示。結果顯示TNFa處理分化過程中的人源單核細胞株(THP-1、U937和HL60)，均檢測到顯著增強ACAT1基因的轉錄。而TNF a處理非單核細胞株(HeLa和HEK293)，對人ACAT1基因轉錄無明顯影響。 上述結果表明TNFa增強人ACAT1基因轉錄具有細胞特異性，提示TNFa特異性增強分化過程中的人單核細胞ACAT1基因轉錄而提高ACAT1的表達與酶活性，從而促進大量膽固醇酯合成堆積而形成動脈粥樣硬化早期病變 一 泡沫細胞。 細胞因子特異性實驗中，不同細胞因子(M-CSF， GM-CSF， MCP-l， IL_6， IL_10，IFN- y ， IL-1 P禾P TNF a )對單核細胞株THP-1的ACAT1 mRNA轉錄的作用如圖3所示。
結果顯示在動脈粥樣硬化斑塊存在的其它細胞因子如M-CSF、 GM-CSF、 MCP-l、IL-1 P 、 IL-6、 IL-10和IFN-y (Alain T等，2006)的單一性處理，均未觀察到明顯增強人單核細胞ACATl基因轉錄，而TNFa則可顯著提高ACAT1的表達與酶活性。這些結果表明，TNFa增強人ACATl基因轉錄具有細胞因子特異性，提示TNFa在動脈粥樣硬化斑塊形成過程發揮特異的病理效應。 實施例2.熒光素酶報告基因表達質粒的構建 根據現有技術的記載構建帶有人ACAT1基因轉錄起始位點上游片段(-125/+34)的熒光素酶表達質粒pM50(Yang JB等，2001)。進一步利用PCR使該表達質粒5'-端缺失，從而產生一系列分別包含有-100/+34和-78/+34的人ACAT1基因轉錄起始位點上游不同缺失的熒光素酶表達質粒。 以pM50質粒為模板，分另U 以弓l 物(SEQ ID NO:8:5 ' _AAAGGTACCACTGGCAACCTG_3 ')禾口 (SEQ ID N0:9:5 ' -AAAGGTACCATAGGATGCTCAGCC-3 ')為正向引物，以通用引物GLP2 (SEQ ID NO : 10 :5' -CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3')為反向引物，進行PCR擴增。產物經過雙酶切后，接
9入pGL-2E載體(購自Promega公司)的Kpn I和Nhe I位點，分別獲得目標質粒pD52和pD53。 包含3'-端缺失的人ACATl基因轉錄起始位點上游片段(-125/-79)的熒光素酶表達質粒的構建同樣以pM50質粒為模板，以通用引物GLPl(SEQ ID NO:11 :5 ' -TGTATCTTATGGTACTGTAACTG-3 ')為正向引物，以引物(SEQ ID NO :12 :5' -AAAGCTAGCTGGTGGTCCCCA-3')為反向引物進行PCR擴增。產物經過雙酶切后，接入pGL-2E載體的Kpn I和Nhe I位點，獲得目標質粒為pD34。 其中，有 一 段特殊的3 ' _端缺失的人ACAT1基因轉錄起始位點上游片段(-125/-101)由合成的兩段互補的寡核苷酸鏈(SEQ ID NO :13 :5' -CAAGGGGCGGGGAGGTGGGCGGAG-3'，和SEQ ID NO :14 :5' -CTAGCTCCGCCCACCTCCCCGCCCCTTGGTAC-3')退火而成，隨后接入pGL_2E載體的Kpn I和Nhe I位點，獲得目標質粒為pD35。 上述質粒的簡易圖譜如圖4A所示。 實施例3. DNA轉染和人ACAT-1某因轉錄表汰活件分析 用DEAE-Dextran法轉染THP-1細胞，按照Mackman等描述的方法修改進行(Mackman N等，1991 ;Yang JB等，2001)。轉染時，先用PBS洗滌細胞兩次，然后使每4X 106個細胞在lml STBE(25mM Tris-HCl， pH7. 4， 5mM KCl，0.7mM CaCl2， 137mM NaCl，0.6mMNa2HP04， 0. 5mM MgCl2)中與1. 5 ii g樣品DNA、0. 75 ii g內標DNA、 150 ii g DEAE-Dextran混勻，并在37。C下作用15分鐘。離心去上清，用PBS洗滌兩次，去除殘留的DEAE-Dextran，然后加入12ml RPMI 1640 (含10% FBS)培養7小時后，用5ng/ml TNF a按實施例1所述方法進行處理，培養40小時后收集細胞。 將所收集的細胞用預冷PBS洗兩次，然后加入200 iU裂解緩沖液，混勻后靜置3 0分鐘，4 °C ， 12 ， 000r p m離心5分鐘，取出上清液即為細胞抽提物。熒光素酶活性分析時，取60 iil細胞抽提物，加60 iil熒光素酶分析緩沖液(luciferase assay buffer,Promega公司)，混勻，于1分鐘內計數熒光粒子。所用熒光粒子計數器(Auto Lumat BG-Pluminometer， MGM instrument Inc.)為PE公司產品。 取30 ill細胞抽提物，加入30 ill 13 _半乳糖苷酶分析緩沖液(P-galactosidaseassay buffer, clontech)，在室溫下反應60分鐘。用熒光粒子計數器(Auto LumatBG-P luminometer, MGM instrument Inc.)測定IO秒鐘內的粒子數。[O104]相對熒光素酶活力的計算公式為
^ 口 #AJA^lffl^、V^+I 樣品熒光粒子計數樣叩滅光素酶活力一 樣品p半錯魏活力計數
相對熒光素酶活力=ff5liil^(倍)
對照熒光素酶活力 測定時同一批樣品之間的P-半乳糖苷酶基因轉染效率(P-半乳糖苷酶活力O.D.^/對應的蛋白量)的波動應小于15%，每一實驗作三份平行樣品。轉染含人ACAT1基因轉錄起始位點上游的不同片段的熒光素酶報告基因質粒的樣品組，以沒用TNF處理的樣
10CN 101787365 A 相對熒光素酶活力。 實驗結果如圖4B所示，其中-100 -79區域的缺失，使得TNFa的剌激增強效應
消失，而其它區域的缺失均不影響TNFa的剌激增強效應。該結果表明人ACAT1基因轉錄
起始位點上游存在一個22bp的TNFa剌激應答區域(-100 -79)。 實施例4.人ACAT1某閔轉錄起始份點卜.游的TNFa刺激應答區域的鑒定應用實施例2中構建的系列含5' _端缺失和3'-端缺失的人ACATl基因轉錄
起始位點上游不同缺失的熒光素酶表達質粒轉染THP-1細胞，按實施例3的方法處理后測
定得到各質粒轉染細胞應答TNFa剌激的情況。 結合序列缺失與熒光素酶檢測結果，確定人ACAT1基因轉錄起始位點上游-100 -79的22bp是應答TNF a剌激的效應區域(如圖5)。它的具體序列見圖5的標記框內序列(SEQ ID N0:3，5' -CCTGGCAACCTGGGGACC A CCA-3')，其中下劃線部分為類NF- k B順式元件。與NF- k B順式元件的通用序列(5' -GGGRNNYYCC-3' ， R為嘌呤、N為任何堿基、Y為嘧啶)相比，黑體劃線4是TNF a剌激增強人ACAT1基因轉錄應答的類NF- k B順式元件的特征性位點(圖5)。 以上結果表明，炎癥因子TNFa剌激人ACAT1基因轉錄，是通過對應的功能性順式元件而促進特異的動脈粥樣硬化病理效應。 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。 序列表 〈110〉中國科學院上海生命科學研究院
〈120〉炎癥因子TNFa剌激人ACAT1基因表達
〈130>090343
〈160>14
〈170>PatentIn version 3.3
〈210>1
〈211>3407
〈212>DNA
〈213>寡核苷酸
〈220〉 〈221>CDS 〈222>(64). (1713)
11
〈400>1 AOgcttcccggctctgccctcttggccgaagt gcccgctgcc gggegeggge ctcagacaat
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12
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14
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16
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<212〉DNA 〈213〉寡核苷酸
〈400>5
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〈210>10 〈211〉23
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〈210>11 〈211>23 〈212>DNA 〈213〉寡核苷酸
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〈400>13
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<210>14 〈211>32 〈212>DNA 〈213〉寡核苷酸
〈400>14
ctagctccgc ccacctcccc gccccttggt ac 3權利要求
一種TNFα刺激應答序列，其具有SEQ ID NO3所示的序列。
2. 如權利要求1所述的TNFa剌激應答序列，其特征在于，所述序列是SEQID NO :3所 示的序列。
3. 如權利要求l所述的TNFa剌激應答序列，其特征在于，所述序列位于ACATl基因轉 錄起始位點上游。
4. 如權利要求l所述的TNFa剌激應答序列，其特征在于，所述序列為ACATl基因轉錄 起始位點上游的-100 -79所示的區域。
5. 如權利要求l-4中任一項所述的TNFa剌激應答序列，其特征在于，TNF a剌激作用于所述應答序列，并使得ACATl基因轉錄增強。
6. —種通過基因工程方法獲得的含有權利要求l-5任一項所述的TNFa剌激應答序列的細胞。
7. —種篩選治療膽固醇代謝異常相關疾病的藥物的方法，所述方法包括 使候選藥物和TNF a同時與含有權利要求1-5中任一項所述的TNF a剌激應答序列的細胞接觸；在相同條件下，使TNFa與含有權利要求1-5中任一項所述的TNF a剌激應答序列的 細胞接觸，作為陽性對照；測定所述細胞中ACATl基因的表達水平；如果用候選藥物處理的細胞中ACATl基因的表達水平與陽性對照相比有所降低，則表 明所述候選藥物可用作治療膽固醇代謝異常相關疾病的藥物。
8. —種篩選治療膽固醇代謝異常相關疾病的藥物的方法，所述方法包括 使候選藥物與含有權利要求1-5中任一項所述的TNF a剌激應答序列的細胞接觸； 測定所述細胞中ACATl基因的表達水平；如果用候選藥物處理的細胞中ACATl基因的表達水平與未用候選藥物處理的細胞相 比有所降低，則表明所述候選藥物可用作治療膽固醇代謝異常相關疾病的藥物。
9. 權利要求l-5中任一項所述的TNFa剌激應答序列在篩選通過結合所述TNF a剌激應答序列來抑制ACATl基因表達從而治療與膽固醇代謝異常相關的疾病的藥物中的用途。
10. 如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述膽固醇代謝異常相關的疾病選自動 脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或老年性癡呆癥。
全文摘要
本發明涉及炎癥因子TNFα刺激人ACAT1基因表達。具體而言，本發明涉及一種TNFα刺激應答序列，其具有SEQ ID NO3所示的序列，即5′-CCTGGCAACCTGGGGACCACCA-3′。本發明還進一步涉及包含本發明序列的構建細胞、該序列在藥物篩選中的用途、篩選藥物的方法以及包含篩選所得藥物的藥物組合物。本發明為膽固醇代謝異常疾病提供更為直接的篩藥靶標，為深入闡明有關膽固醇代謝平衡生理功能與病理變化機理、臨床、藥物研究等提供了重要基礎。
文檔編號C12N15/11GK101787365SQ20091004583
公開日2010年7月28日 申請日期2009年1月23日 優先權日2009年1月23日
發明者宋保亮, 李伯良, 楊新穎, 熊纓, 陳佳, 雷磊 申請人:中國科學院上海生命科學研究院