專利名稱：間充質干細胞及其在抗hiv-1中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及干細胞治療領域，具體地說是一種間充質干細胞免疫調節劑，其主要成分是分泌表達角質形成細胞生長因子的間充質干細胞，可用于Hiv-I感染的治療。
背景技術：
間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是間質組織來源的具有亞全能分化潛能干細胞，既有調節外周免疫系統的功能，也能修復受損的中樞免疫系統，在免疫系統的發生和功能的維持中起著至關重要的作用。在自身免疫性疾病中，MSCs注射到體內后，不僅能夠遷移到受傷組織，抑制前炎癥因子的釋放，促進受傷細胞的存活，誘導外周免疫耐受，降低異常的免疫反應，更能夠修復受損的胸腺組織，從而減少自身反應性T細胞的產生，阻止疾病的進展。 角質形成細胞生長因子(keratinocytegrowth factor,KGF)是 Rubin 等(1989)從胚胎肺成纖維細胞培養上清中發現的，為FGF家族成員，即FGF-7。KGF由間質細胞產生，通過旁分泌機制分泌，與上皮細胞上的特異性受體相結合，與上皮創傷愈合、胚胎發育、腫瘤形成與發展及免疫重建關系密切。KGF在同種異體造血干細胞移植、自體造血干細胞移植及同種骨髓移植中能夠預防移植物抗宿主疾病和保持移植物抗白血病效應，保護胸腺上皮細胞，增強胸腺重建，改善移植后胸腺和外周血T淋巴細胞重建。KGF促進胸腺生成素生成，增加外周幼稚⑶4+ T淋巴細胞和T淋巴細胞依賴性抗體的數量,誘導胸腺上皮細胞(thymic epithelial cells,TECs)數目增加和胸腺內IL-7生成，重組皮質和髓質結構。KGF誘導體內幼稚TECs擴增、成熟和促進晚期各型細胞分化的信號途徑，包括P53和NF- K B途徑，導致與TECs功能和T淋巴細胞發育有關的靶基因轉錄，包括BMP-2、BMP-4、Wnt5b和WntlOb。應用KGF能夠降低細菌活力，抑制細菌生長，改善皮炎和胃腸道炎癥。在感染HIV-I病毒的患者中，缺乏抗病毒治療時，可導致胸腺細胞增殖、輸出數量和功能等降低。HIV-I可導致胸腺的破壞，降低了 T淋巴細胞免疫的重構和功能恢復，而使感染的患者加速了疾病的進程。病毒之所以很難清除，也和病毒對胸腺的破壞，減低了機體對病毒的特異免疫功能有關。以前治療艾滋病的藥物只是針對病毒感染，而不能修復受損的胸腺功能。
發明內容
發明人驚奇地發現，利用發明人獨創的微載體高密度培養技術生產的間充質干細胞能夠分泌表達高濃度的細胞因子KGF。發明人將上述MSCs輸注到裸鼠體內后，發現萎縮的裸鼠胸腺體積增大，胸腺實質增大，胸腺的組織結構向正常的皮髓質結構發育，同時胸腺內的胸腺細胞增多，并發育為成熟的T淋巴細胞，因此MSCs能夠促進胸腺的發育及其功能的維持。迄今應用最為廣泛的艾滋病靈長類動物模型是SIVmac或SHIV感染的印度恒河猴模型。發明人的實驗表明，MSCs能夠使感染了 SIVmac239病毒的恒河猴體內⑶4+和⑶8+T淋巴細胞均回升到一個較高的水平。MSCs聯合PMPA治療HIV-I感染的恒河猴，可降低病毒顆粒體在機體內存在，促進CD4+T細胞的增加，提高HIV-I感染者的生存率。因此，分泌表達KGF的間充質干細胞聯合藥物治療艾滋病，能夠在針對HIV感染的同時，修復受損胸腺的功能，增加成熟T細胞的輸出，此為本發明的優勢所在。故而，間充質干細胞作為一種新型的免疫調節劑，在艾滋病的治療中，通過重建被HIV-I感染的胸腺，增加T細胞向外周血中的輸出，增強特異性T細胞的免疫功能，達到抗病毒的效果，為艾滋病的臨床治療提供了一種有效的新策略。本發明一方面提供了一種分泌表達高濃度KGF的間充質干細胞，優選地，其為臍帶間充質干細胞。另一方面，本發明提供了一種制備所述分泌表達高濃度KGF的間充質干細胞的方法，其采用微載體培養系統。在一個特定的實施方案中，該方法包括以下步驟
(1)以I.2X IO5細胞/ml終體積的接種量將種子細胞接種到培養容器中，其中所述培養容器中包含經DMEM/F-12完全培養液包被的微載體和培養最終體積一半量的經過5%CO2，飽和濕度，37 °C培養箱平衡的DMEM/F-12完全培養液；
(2)接種后靜置于5%CO2，飽和濕度，37 °〇培養箱內，每隔30min以35rpm攪拌微載體2min，其中該2min從所有微載體均已懸浮開始計算，如此重復間歇式的攪拌培養持續8h ；
(3)間歇式攪拌培養后進行8天的連續攪拌培養，其中攪拌轉速為第I 5天40rpm，第6 8天60rpm ；
(4)接種24小時后，用經過平衡的DMEM/F-12完全培養液將培養容器內培養液補至最終體積；
(5)從接種后的第4天開始，每天吸出40%培養容器中的上清，用經過平衡的新鮮DMEM/F-12完全培養液補足系統中培養液的體積，經過無菌操作所取出的上清收集于無菌容器中，置于-20 °C低溫保存；
(6)培養至第8天后，將培養容器從培養箱中取出，靜置，待微載體全部沉降后，取出上清，并與培養過程中所有取出的上清一并收集于無菌容器中，置于_20°C低溫保存；
(7)加入200mLD-Hank’ s緩沖液對微載體進行清洗,在60rpm的轉速下,攪拌微載體3min,后靜置，吸去緩沖液，如此重復3遍；
(8)待吸去全部緩沖液后，加入1%膠原酶溶液40mL，輕輕晃動培養容器，使微載體與膠原酶溶液混勻，靜置于5% CO2，飽和濕度，37°C培養箱內15min;
(9)消化結束后，取出培養瓶，加入IOOmLD-Hank’s緩沖液，并用移液管反復輕輕吹打微載體，使細胞全部脫落，靜置5min，待微載體全部沉降后，用移液管吸出上層細胞溶液至離心管中，如此重復3遍；
(10)將離心管于IOOOrpm離心5min，棄去上清，沉淀即為所述間充質干細胞。本發明在第三方面提供了一種免疫調節劑，其活性成分包括分泌表達高濃度KGF的間充質干細胞。優選地，所述免疫調節劑還含有人血白蛋白和抗聚集劑，更優選地，所述抗聚集劑為肝素鈣。本發明公開了分泌表達高濃度KGF的間充質干細胞在制備促進胸腺發育及其功能維持的藥物中的用途。同時，本發明還公開了分泌表達高濃度KGF的間充質干細胞在制備治療HIV-I感染的藥物中的用途。其中，所述間充質干細胞通過重建被HIV-I感染的胸腺，增加T淋巴細胞向外周血中的輸出達到抗病毒效果，優選地，所述T淋巴細胞為CD4+ T淋巴細胞。在優選的實施方案中，分泌表達高濃度KGF的間充質干細胞和抗HIV病毒藥物(PMPA)聯合用于HIV-I感染的治療。本發明米用微載體培養技術高密度培養間充質干細胞，提供的極大的培養表面積/體積比提供了很高的細胞產量，從而富集了其分泌的細胞因子。相對于其他類型的單層培養而言，微載體培養需要相當少的空間，就可生產大量的細胞或細胞產物。微載體系統使培養參數如pH、氣體壓力等極好控制，這就使得貼壁依賴型細胞能夠在一個擁有所有懸浮培養優點的系統中生長，改進的控制能夠使各種過程設計的培養系 統環境均一。微載體培養的監測和取樣比其他任何一種用于大量貼壁依賴型細胞生產的技術都簡單，從而為細胞的大規模培養和獲得高濃度的分泌物提供了可能。微載體培養系統在一定程度上克服了傳統平面培養和轉瓶培養的不足，具有很多優點(I)兼具單層培養和懸浮培養的優勢，且是均相融合；(2)細胞所處環境均一 ；(3)環境條件如溫度、PH和CO2等容易測量與監控；(4)具有較高的比表面積；(5)培養操作可系統化、自動化，降低了污染發生的機會。尤其令人預料不到的是，采用本發明的培養方法生產的間充質干細胞分泌表達高濃度的KGF，在促進胸腺發育及其功能維持，以及治療HIV-I感染中具有顯著效果。
圖I根據ELISA方法檢測培養液中KGF的含量。圖2各組裸鼠的新鮮未固定胸腺照片。圖3各組裸鼠6周時胸腺組織冰凍切片的蘇木精和伊紅染色(H&E staining)結果。圖4治療組和未治療組在H&E染色中的胸腺實質面積隨時間變化情況。圖5治療組和未治療組的UEA-I表達隨時間變化情況。顯微鏡放大倍率為200 X，照片中，藍色為DAPI染色，紅色為UEA-I免疫熒光。圖6各組裸鼠不同時間的胸腺組織冰凍切片的⑶4和⑶8免疫熒光情況。顯微鏡放大倍率為200 X，照片中，紅色為CD4免疫熒光，綠色為CD8免疫熒光。圖7實驗期間各組動物體重變化情況。圖8實驗期間每組各4只動物血漿SIV病毒RNA載量的測定結果。圖9實驗期間各組動物外周血淋巴細胞百分比變化的測定結果。
具體實施例方式實施例I臍帶間充質干細胞的高密度培養
I.臍帶間充質干細胞高密度培養的種子細胞來源于天津和澤干細胞科技有限公司生產的臍帶間充質干細胞，批號G2012098，代次P3代。2.細胞高密度培養過程需要用到的材料(DD-MEM/F-12 培養基
(2)D-Hank’ s 緩沖液
(3)胎牛血清
(4)微載體選用GEHealthcare公司生產的Cytodex3型微載體。其出廠標準為微載體基質為交聯葡聚糖，載體表面覆蓋一層較薄的變性膠原；密度為1.04g/ml ;顆粒大小d50=175 u m, d5_95=141 u m-211 u m ;所提供培養面積為2700cm2/g干重；每克干重約含微載體數量為3. OX 106，膨脹因子為15ml/g干重。(5)高密度培養容器選用CORNING公司生產的附帶取樣側臂的磁力攪拌懸浮培 養瓶。3.臍帶間充質干細胞的種子細胞的復蘇與擴增
(I) 查詢需復蘇細胞凍存位置后，從液氮罐中相應位置迅速取出凍存的細胞。(2)核查冷凍盒上的條碼，確認后立即于37 °C水浴中迅速融化。(3)用75%酒精棉球擦拭凍存管蓋周圍,旋開管蓋。(4)在潔凈工作臺內將凍存管內的細胞移入到無菌離心管內。(5)緩慢逐滴加入10 ml DMEM/F-12培養液，輕輕混勻，盡量不要產生氣泡。(6)離心，1000 rpmX 5min,棄上清。(7)加入適量DMEM/F-12完全培養液，重懸，接種，置5% CO2,飽和濕度，37 °C培養
箱培養。(8)第二天換液，以后每3-4天換液。(9)當細胞80-90%融合時，即可接種高密度培養。4.培養容器內壁的硅化處理
為了防止微載體粘附在玻璃容器內壁，高密度培養細胞所使用的玻璃容器需要進行硅化處理。向干凈的培養容器內加入硅化劑sigmacote ，潤濕所有可能接觸到微載體的表面，將多余的硅化劑從容器中倒出，然后把容器晾干。晾干后，使用蒸餾水徹底沖洗容器3次，備用。硅化處理過的容器經過3次培養后需要再次硅化。5.培養液使用前的處理
所有高密度培養所用到的DMEM/F-12完全培養液，在使用前，都需要在5% CO2，飽和濕度，37 °C培養箱內平衡至少8h，以使pH、溫度能夠在其使用時即可達到培養細胞的最佳條件。6.微載體使用前的處理
(I) 微載體的稱量根據培養體系稱取相應質量的微載體，微載體的使用量為3g/L培養液。(2)微載體的水化干燥的微載體在D-Hank’ s緩沖液(每克Cytodex3微載體加50ml-100ml)中在室溫下浸泡膨脹至少3小時。棄去上清液，用新配制的D-Hank’s緩沖液(每克CytodeX3微載體加30ml-50ml)洗滌微載體10分鐘。棄去上清液，換上新的D-Hanks緩沖液(每克Cytodex3微載體加30ml_50ml)。(3)微載體的滅菌將微載體溶液轉移至已處理好的高密度培養容器中，對整個培養容器進行高壓蒸汽滅菌121°C，30min, 15psi。(4)微載體的再次包被高壓蒸汽滅菌后，在無菌條件下倒出培養容器內的液體，留下微載體，向容器內加入適量DMEM/F-12完全培養液，使其完全浸泡微載體，置5% CO2,飽和濕度，37 °C培養箱靜置8h，這樣可以使有利于細胞貼壁的各種蛋白結合到微載體表面。7.接種細胞
(I)從培養箱中取出高密度培養容器，將容器在無菌條件下吸出培養液，留下經過再次包被的微載體。(2)加入經過培養箱平衡的DMEM/F-12完全培養液，加入量為培養最終體積的一半。(3)打開磁力攪拌系統,將轉速調至35rpm,使微載體可以均勻的懸浮于培養液中。(4)按照臍帶間充質干細胞培養與傳代的操作，將組織培養瓶內達到80-90%融合·的細胞進行D-Hank’s緩沖液清洗、胰酶-EDTA消化、離心、重懸、計數等操作處理，準備相應數量的細胞進行接種。(5)接種細胞的重懸要均勻，成為均一單個的細胞懸液，否則會影響接下來的高密
度培養。(6)在微載體攪拌的狀態下，向培養容器內加入種子細胞，接種量為I. 2X IO5細胞/ml終體積，保持攪拌狀態3min，使接種的細胞與微載體充分混合均勻。8.間歇式培養
將高密度培養容器靜置于5% CO2，飽和濕度，37 1培養箱內，稍微旋松側臂蓋，每隔30min以35rpm攪拌微載體2min (該2min從所有微載體均已懸浮開始計算),如此重復間歇式的攪拌培養持續8h。9.連續攪拌培養
(I)經過8h的間歇式培養后，將轉速保持為35rpm進行連續攪拌。(2)接種24h后，用經過平衡的DMEM/F-12完全培養液將培養容器內培養液補至最終體積。(3)隨著培養時間的增加，攪拌速度隨之改變，連續攪拌培養時間為8天。(4)相應攪拌轉速為第I 5天40rpm,第6 8天60rpm。10.培養過程中的換液
從接種后的第4天開始，每天吸出40%培養容器中的上清，用經過平衡的新鮮DMEM/F-12完全培養液補足系統中培養液的體積。經過無菌操作所取出的上清收集于無菌容器中，置于-20 °C低溫保存。11.臍帶間充質干細胞高密度培養的終止
培養至第8天后，將培養容器從培養箱中取出，靜置，待微載體全部沉降后，取出上清，并與培養過程中所有取出的上清收集在一起。加入200mL D-Hank’ s緩沖液對細胞進行清洗,在60rpm的轉速下,攪拌微載體3min,后靜置,吸去緩沖液，如此重復3遍。待吸去全部緩沖液后，加入1%膠原酶溶液40mL，輕輕晃動培養容器，使微載體與膠原酶溶液混勻，靜置于5% CO2，飽和濕度，37 °〇培養箱內15min。消化結束后，取出培養瓶，加入IOOmL D-Hank’s緩沖液，并用移液管反復輕輕吹打微載體，使細胞全部脫落，靜置5min，待微載體全部沉降后，用移液管吸出上層細胞溶液至離心管中，如此重復3遍。將離心管于IOOOrpm離心5min，棄去上清。
經過上述過程的培養,收獲的細胞數可以達到接種細胞數的約20倍，增殖倍數為傳統二維細胞培養方法增值倍數的7倍。培養過程中，含有高濃度蛋白因子KGF分泌物的培養上清可連續地獲得(如圖I所示)，連續補加新鮮的培養液使得獲取細胞分泌物的過程具有連續性、穩定性、可控性。實施例2臍帶間充質干細胞促進裸鼠胸腺發育
I.實驗方案
將200只正常3周齡裸鼠隨機分為治療組和未治療組，各100只，SPF級飼養，治療組腹腔注射0. 5ml實施例I得到的臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)懸液，2 X IO6細胞/只，未治療組腹腔注射0. 5ml D-Hank’ s液，均為2次/周。注射后每兩周處死裸鼠6只/組，取胸腺組織，稱重，追蹤裸鼠胸腺增大的起始時間，記錄隨著時間變化裸鼠體重和胸腺重量的變 化。所取胸腺標本，其中3只裸鼠的胸腺做冰凍切片，用免疫組化/免疫熒光檢測胸腺內由胸腺上皮細胞組成的網狀結構的變化和胸腺中的胸腺細胞分布；另外3只用流式細胞儀檢測隨著時間變化裸鼠胸腺中總T細胞、成熟T細胞相對量的變化。將每組3只裸鼠的整個胸腺標本用4%的多聚甲醛固定，做冰凍切片，做免疫組化/免疫熒光，檢測胸腺上皮細胞構成的胸腺網狀結構的變化(UEA-1和anti-K5、anti-K8)、(⑶4+T細胞、⑶8+T細胞)的量及在胸腺實質中的分布有無差別。將每組另外3只裸鼠的胸腺用流式細胞儀檢測隨著時間變化裸鼠胸腺中總T細胞(⑶3+)、成熟T細胞(⑶4+T細胞、⑶8+T細胞)的量變化。2.實驗結果
(I)裸鼠狀態
治療組裸鼠腹腔注射UC-MSCs后，較未治療組強壯，未治療組裸鼠從第10周開始共死亡15只，而治療組裸鼠從第15周開始出現死亡。(2)胸腺重建情況
如圖2所示，正常小鼠胸腺位于胸骨柄后方，緊貼氣管，心臟腹面，呈乳白色脂肪狀，分左右兩葉(對照組);腹腔注射D-Hank’ s液的未治療組裸鼠無胸腺，在原胸腺部位處見一團暗黃色組織，不分葉，內有脂肪樣組織(未治療組)；腹腔注射UC-MSCs的治療組裸鼠的原胸腺部位見乳白色脂肪狀組織，分為兩葉(治療組)，質地軟，但組織的體積顯著小于正常小鼠胸腺。治療組和未治療組胸腺部位組織的重量無顯著性差異。正常小鼠胸腺是有結締組織包被的實體性器官細微結構。如圖3所示，胸腺實質由外層皮質及內層髓質組成，表面的被膜結締組織伸入胸腺實質成為胸腺隔，把胸腺分成許多不完全分隔的小葉(6 wk對照組)。未治療組裸鼠胸腺實質沒有明顯的皮髓質之分，細胞排列紊亂無規律(6wk未治療組);而治療組裸鼠出現典型的胸腺小葉結構，內層髓質結構外圍包繞外層皮質(6wk治療組)。由圖4可以看出，治療組胸腺組織實質的面積較未治療組顯著增大。UEA-I是髓質上皮細胞表面標志物，UEA-I+的髓質上皮細胞與髓質組織結構有關，是Foxnl基因維持出生后胸腺組織微環境的靶分子。裸鼠由于Foxnl基因缺失，因此無UEA-I+的髓質上皮細胞。而治療組裸鼠胸腺的髓質區域出現了 UEA-I+的髓質上皮細胞(圖5)，這就說明胸腺的髓質結構發育趨于正常，進而能夠促進胸腺細胞的發育。(3)⑶4+/⑶8+淋巴細胞在胸腺中分布的免疫熒光結果如圖6所示，治療組裸鼠胸腺中的⑶4+、⑶8+T淋巴細胞數量明顯增加，表明MSCs不僅能夠刺激胸腺的發育，還能促進其功能的維持，在胸腺的發育過程中起著至關重要的作用，因此MSCs是中樞免疫器官的發育和結構功能維持必不可少的調節者，并在體內免疫系統平衡狀態的維持中起著至關 重要的作用。實施例3臍帶間充質干細胞對感染SIVmac239病毒恒河猴的治療作用
I.實驗方案
選擇16只健康成年中國恒河猴作為模型動物，其中12只雄性、4只雌性。用分子克隆標準毒株SIVmac239作為感染毒株，按照每只動物接種100TCID5(l/ml經靜脈途徑接種感染。動物在感染病毒10天和56天時，按照動物的病毒載量、體重和性別隨機分為4組，每組動物3只雄性、I只雌性。分別為模型組(CP)、PMPA治療組(TA)、干細胞治療組(TB)、干細胞+PMPA聯合治療組(TC)。按照分組的情況進行對照品和供試品的給藥，其中模型對照組靜脈注射給予等體積的PBS，給藥體積2mL/kg體重；PMPA治療組皮下注射給予劑量30mg/kg,給藥體積0. 33mL/kg體重；干細胞治療組靜脈注射給予I X IO6細胞/kg體重，給藥體積2mL/kg體重；干細胞+PMPA聯合治療組靜脈注射給予I X IO6細胞/kg體重干細胞懸液，同時皮下注射給予30mg/kg的PMPA,給藥體積2mL/kg體重。給藥頻率和期限模型對照組給予PBS為I次/周，給藥4周；干細胞治療組為I次/周，連續4周；PMPA治療組為I次/天，給藥8周；干細胞+PMPA組，分別按同時MSCs為I次/周，連續4周，PMPA為I次/天，連續8周。對感染后各治療組的動物觀察其臨床表現，測定血液學、血漿病毒載量、CD4+和CD8 + T淋巴細胞數結果，并對疾病進展情況進行觀察與分析。2.實驗結果
(1)動物體重的測定結果
各組動物在病毒感染0天、10天、56天，90天、120天、150天、180天，以及供試品治療
期間-攻毒后64天、71天、78天、105天和145天(動物在病毒感染后56天開始進行治
療)，對動物進行體重的測定。病毒感染0天，各試驗組動物平均體重在4. OKg左右，其中較高的為對照組4. 61 ±0. 95Kg，較低的為PMPA治療組3. 88±0. 48Kg。攻毒56天開始治療期間到100天左右，動物體重基本維持不變，其中干細胞組動物體重略有下降趨勢；在治療8周后，動物體重開始回升，其中干細胞+PMPA組動物的體重增加較明顯。(圖7)
(2)病毒學指標測定結果
病毒感染后14天，四組動物的血漿病毒載量均達到高峰，均值分別為對照組
5.45X 107拷貝/ mL、PMPA治療6. 65X IO7拷貝/ mL、干細胞治療組5. 80X IO7拷貝/ mL和干細胞+PMPA聯合治療組I. 08 X IO8拷貝/ mL，干細胞+PMPA聯合治療組略高于其他三個試驗組。從感染后14天開始，病毒載量從高峰期快速下降。至感染后56天時，根據動物病毒載量并結合動物體重進行分組，分組后各試驗組病毒載量的均分別為4. 79XlO4,
2.69 X IO6,1. 87 X IO6和2. 28 X IO7拷貝/ mL。除模型對照組外，其余三組開始進行供試品治療。從病毒感染后56天開始治療到180天試驗結束，各實驗組動物血漿RNA病毒載量雖然有所下降，但仍然在維持在一個較高的范圍內平臺期。其中干細胞+PMPA聯合治療組是呈現緩慢降低的趨勢。(圖8)
(3)免疫學指標測定結果
干細胞+PMPA聯合治療感染了 SIVmac239病毒的恒河猴，能夠改善受感染動物的精神、食欲等臨床癥狀，改善動物生存狀況，降低其體內的病毒載量的趨勢；在試驗觀察的后期，即給藥后90天左右時，受病毒感染的動物體內CD4+和CD8+T淋巴細胞均開始回升到一個較高的水平(圖9)。在病毒感染后180天時，各實驗組動物⑶4+/⑶8+比值均值恢復
到> I. 0.(對照組，I. 26±0. 43 ;PMPA組，2. 08±0. 46 ;細胞組，2. 09±0. 16 ;PMPA+細胞組，I. 69±0. 51)。
權利要求
1.一種分泌表達角質形成細胞生長因子(KGF)的間充質干細胞。
2.根據權利要求I的間充質干細胞，其為臍帶間充質干細胞。
3.一種免疫調節劑，其活性成分包括權利要求I或2的間充質干細胞。
4.根據權利要求3的免疫調節劑，其還含有人血白蛋白和抗聚集劑。
5.根據權利要求4的免疫調節劑，所述抗聚集劑為肝素鈣。
6.權利要求I或2的間充質干細胞的制備方法，其特征在于采用微載體培養系統。
7.根據權利要求6的制備方法，包括以下步驟 (1)以I.2X IO5細胞/ml終體積的接種量將種子細胞接種到培養容器中，其中所述培養容器中包含經DMEM/F-12完全培養液包被的微載體和培養最終體積一半量的經過5%CO2，飽和濕度，37 °C培養箱平衡的DMEM/F-12完全培養液； (2)接種后靜置于5%CO2，飽和濕度，37 1培養箱內，每隔30min以35rpm攪拌微載體2min，其中該2min從所有微載體均已懸浮開始計算，如此重復間歇式的攪拌培養持續8h ； (3)間歇式攪拌培養后進行8天的連續攪拌培養，其中攪拌轉速為第I 5天40rpm，第6 8天60rpm ； (4)接種24小時后，用經過平衡的DMEM/F-12完全培養液將培養容器內培養液補至最終體積； (5)從接種后的第4天開始，每天吸出40%培養容器中的上清，用經過平衡的新鮮DMEM/F-12完全培養液補足系統中培養液的體積，經過無菌操作所取出的上清收集于無菌容器中，置于-20 °C低溫保存； (6 )培養至第8天后，將培養容器從培養箱中取出，靜置，待微載體全部沉降后，取出上清，并與培養過程中所有取出的上清一并收集于無菌容器中，置于_20°C低溫保存； (7)加入200mLD-Hank’ s緩沖液對微載體進行清洗,在60rpm的轉速下,攪拌微載體3min,后靜置，吸去緩沖液，如此重復3遍； (8)待吸去全部緩沖液后，加入1%膠原酶溶液40mL，輕輕晃動培養容器，使微載體與膠原酶溶液混勻，靜置于5% CO2，飽和濕度，37°C培養箱內15min; (9)消化結束后，取出培養瓶，加入IOOmLD-Hank’s緩沖液，并用移液管反復輕輕吹打微載體，使細胞全部脫落，靜置5min，待微載體全部沉降后，用移液管吸出上層細胞溶液至離心管中，如此重復3遍； (10)將離心管于IOOOrpm離心5min，棄去上清，沉淀即為所述間充質干細胞。
8.權利要求I或2的間充質干細胞在制備促進胸腺發育及其功能維持的藥物中的用途。
9.權利要求I或2的間充質干細胞在制備治療HIV-I感染的藥物中的用途。
10.根據權利要求9的用途，其中所述間充質干細胞通過重建被HIV-I感染的胸腺，增加T淋巴細胞向外周血中的輸出達到抗病毒效果。
11.根據權利要求10的用途，其中所述T淋巴細胞為⑶4+T淋巴細胞。
12.根據權利要求9-11任一項的用途，其中所述間充質干細胞與抗HIV病毒藥物(PMPA)聯合使用。
全文摘要
本發明公開了一種間充質干細胞及其在抗HIV-1中的應用，具體涉及一種分泌表達高濃度角質形成細胞生長因子(KGF)的間充質干細胞，其通過微載體培養系統生產。本發明的間充質干細胞可以促進胸腺發育及其功能維持，并通過增加T淋巴細胞向外周血中的輸出，增強特異性T細胞的免疫功能，達到治療HIV-1感染的效果，為艾滋病的臨床治療提供了一種有效的新策略。
文檔編號A61P37/02GK102719397SQ20121024376
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月16日 優先權日2012年7月16日
發明者劉擁軍, 朱德琳, 李福彬, 牟浩, 王立華 申請人:天津和澤干細胞科技有限公司