專利名稱：對炎癥因子表達具有抑制作用的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，尤其是中藥有效部位及其應用領域，尤其是涉及一種對炎癥因子表達具有抑制作用的中藥有效部位的組合物。
背景技術：
炎癥損傷是臟器，如心臟、腦等在發生損傷時，由免疫系統廣泛參與的復雜反應，炎癥過程中會釋放出大量炎癥因子，包括細胞因子、粘附分子等，促使損傷的進一步發生。炎癥反應的發生會導致臟器局部二次損傷的發生，例如腦 缺血、心肌缺血，均是與炎癥反應具有密切聯系的臨床常見病。例如，急性冠脈綜合征(ACS)是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征，凝血功能激活和易損斑塊炎癥反應在ACS的發生中起著重要作用，是兩個核心病理環節。又如在中風過程中，腦缺血和再灌注之后，腦組織中均出現明顯的炎癥反應，造成腦缺血后的二次損傷。中醫藥治療心腦缺血性病變上，顯示了巨大潛力，但是，理想的藥物還沒有開發出來。“四妙勇安湯”由“金銀花、玄參、當歸、生甘草”組成，具有顯著解毒活血定痛的作用，傳統用于下肢動脈閉塞癥和脈管炎的治療。近年來，醫家基于對臟器，例如心、腦，缺血性炎癥反應病理機制的認識，將該方開始用于冠心病、腦缺血等治療，取得了滿意臨床療效。“四妙勇安湯”配伍精當，藥專力宏，是最具中醫配伍和用量特色的傳統名方之一，具有很好的成藥開發前景，其配伍規律和量效關系也值得深入研究，但因為原方用藥量過大，給新藥開發帶來難度。因此，需要發現傳統名方的藥效學物質基礎，發現其活性部位所在，研制出藥效物質清楚、作用環節明確、安全高效、質量可控、配伍精當的對炎癥因子具有抑制作用的現代藥物組合物。
發明內容
為了達到上述至少一個發明目的，本發明提供了一種對炎癥因子表達具有抑制作用的藥物組合物，該組合物的組成部分均為中醫傳統名方“四妙勇安湯”的有效部位。本發明所提供的對炎癥因子表達具有抑制作用的藥物組合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物組成，所述提取物的制備方法如下a)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比2. 5 4 2. 5 4 I. 5 2. 5 O. 5 I. 5的比例混勻；b)將所述原料藥中加入水或40 60%的乙醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為
I 5 10，提取2次以上，每次I. 5 4. 5小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣；c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上大孔樹脂，采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進行連續淋洗，分別得到30%乙醇淋洗物即為所述第I提取物，60%乙醇淋洗物即為所述第2提取物、95%乙醇淋洗物即為所述第3提取物；d)將所述第1、2、3提取物混合，得到所述藥物組合物。
根據本發明的實施方式之一，原料藥中金銀花、玄參、當歸、甘草的優選重量比為3 : 3 : 2 : I。這既是臨床經驗的總結，同時又是經過實驗驗證的有效配比。根據本發明的另一實施方式，提取的步驟b)中乙醇的濃度為55%。根據本發明的實施方式之一，步驟b)中固液比為優選為I : 6 8。根據本發明的實施方式之一，步驟b)中的提取次數為4次，每次提取時間為2 4小時。根據本發明的實施方式之一，本制備方法中所采用的大孔樹脂為AB-8大孔樹脂。優選地，本發明所提供的一種對炎癥因子表達具有抑制作用的藥物組合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物組成，所述提取物的制備方法如下a)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比3 3 2 I的比例混勻；b)將所述原料藥中加入55%的乙 醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，提取4次，每次2小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣；c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進行連續淋洗，得到30%乙醇淋洗物即為所述第I提取物，60%乙醇淋洗物即為所述第2提取物、95%乙醇淋洗物即為所述第3提取物；d)將所述第I 3提取物混合，得到所述藥物組合物。以上所述本發明所提供的藥物組合物及其優選方案，是發明人在多年醫療實踐的基礎上摸索而成，并經過實驗驗證的、針對傳統名方四妙勇安湯的改進劑型。本發明所提供的提取物I 3，經實驗驗證對炎癥因子表達均具有抑制作用。經發明人在實驗中，采用NF-κ B反應原件結合抑制劑篩選模型和過氧化物酶增殖劑受體(PPAR Y )激動劑篩選模型，對這些提取物的抑制炎癥反應的作用進行驗證，證實它們均有不同程度的抑制動脈粥樣斑塊炎癥反應的作用。NF-κ B過度活化可引起多種病理反應，特別是和多種炎癥反應相關，其中激活動脈粥樣斑塊炎癥反應也是其中之一。NF- K B多以p50或p52結合p65亞基的形式存在，活化后P65亞基與I K B解離，由胞漿轉位進入胞核，與靶基因上的反應原件(RE)結合，調節目的基因的表達。因此，NF-K B轉位后早期基因表達的阻斷策略為抑制其病理信號通路的關鍵靶點。發明人利用分子克隆技術，以人臍靜脈內皮細胞cDNA為模板，擴增NF-K B-RE基因，克隆至pGL4. 32真核表達載體中，經轉染，導入293A細胞內，經Hygromycin篩選、傳代，建立了穩定表達NF- K B-RE的細胞系(pGL4. 32 [luc2P/NF_kappaB-RE] 293A)。該模型可直接通過熒光素酶檢測試劑檢測熒光素酶光化學值的變化，用于進行NF-κ B抑制劑的高通量篩選。經驗證，確定第1、2提取物對NF-kB通路具有阻斷作用，能夠通過抑制早期基因表達而抑制該病理信號通路，IC50分別為31. 61 μ g/ml和32. 49 μ g/ml。過氧化物酶增殖劑受體(PPAR)是配體激活的轉錄因子核受體超家族成員之一。目前已知其三個亞型PPAR α，-β/δ和-γ。過氧化物酶增殖劑受體Y (PPAR Y )能影響NF-κ B、信號轉錄子、激活蛋白-I介導的信號通路，通過抑制這些途徑的激活達到抑制靶基因啟動子激活和轉錄的目的。PPARy的N端功能區含有一個能被有絲分裂原激活的蛋白激酶磷酸化位點，若該區域突變或在磷蛋白磷酸酶共同作用下則不能產生磷酸化而使其活化。配體與PPAR Y結合并使之激活后，與視黃醒X受體a (retinoid Xreceptor α，RXR α )形成異二聚體，再結合于特異性DNA序列而使靶基因活化，此序列稱為PPAR特異性反應兀件(peroxisome proliferator responsiveelement,PPRE)。含有PPRE結構的基因包括已酰輔酶A合成酶、脂蛋白脂肪酶(LPL)、胰島素受體底物-2 (IRS-2)、瘦素以及腫瘤壞死因子-α (TNF-α)等。PPARy通過調節相關基因的表達，在脂肪形成、糖脂代謝，以及在免疫系統中發揮重要作用，并與多種疾病如糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等的發生、發展有關。尤其是PPARy是脂肪細胞分化過程中的關鍵因子，近年來備受關注。PPARy成為了肥胖，高血壓，動脈粥樣硬化的治療靶點。發明人以PPAR Y為靶位篩選其激動劑，發現第1-3提取物均有不同程度的PPARy激動劑效果。以第3提取物作用最明顯的，其在O. Olmg/ml時的有效率為 90%，EC5tlO. 004mg/ml ;第 2 提取物在 O. lmg/ml 時的有效率為 100%，EC5tlO. Olmg/ml ;第I提取物的有效率不足60%。根據實驗結果，可見本發明所提供藥物組合物中所含有的第I 3提取物，均有不同程度的促進活化的過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-γ)表達和/或抑制核轉錄因子kB(NF-kB)表達。其中，以促進PPAR-Y表達的作用最為顯著。因而，根據臨床實際的用藥需要，將這些提取物進行有選擇地、任意比例的組合，即可以得到藥效物質清楚、作用 環節明確、安全高效、質量可控、配伍精當的對炎癥因子具有抑制作用的現代藥物組合物。為了進一步提高本藥物組合物的抑制炎癥因子的作用，發明人對三種有效部位的配伍規律進行了進一步地研究，發現了一些更佳的配伍比例。根據本發明的實施方式之一，上述藥物組合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比O. 3 5. 4 O. 2 4. 2 I的比例進行混合。根據本發明的另一實施方式，上述藥物組合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比O. 6 3 O. 5 2. I I的比例進行混合。根據本發明的再一實施方式，上述藥物組合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比1.34 1.05 I的比例進行混合。發明人經過3種提取物不同用藥濃度的正交試驗驗證，按照上述比例范圍配合而成的藥物組合物，在抑制炎癥因子方面表現穩定，效果更加突出。本發明附加的方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能解釋為對本發明的限制。實驗例一單一提取物對NF- K B反應原件的結合抑制作用I、實驗步驟(I)實驗材料NF-k B-RE 細胞(pGL4. 32[luc2P/NF_kappaB-RE]293A，中國醫學科學院藥物研究所)，MEM-α培養基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，96孔培養板(Costar,3599), Bright-Glo Luciferase突光素酶檢測試劑(Promaga),水套式CO2細胞培養箱(Sanyo,日本)，Safire2高速多通道連續波長酶標儀(TECAN，奧地利)。(2)檢測樣品采用實施例I所述方法所得提取物I 3，由北京中醫藥大學提供。(3)實驗步驟將培養瓶內對數生長的NF- K B-RE細胞消化并計數，以100 μ I體系、5Χ 103/well的密度接種于96孔白色培養板中，孵育18-24h。對照組換以無血清MEM-α培養基；待篩樣品于 18h后以 100 μ g/ml>50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml 的濃度同時加入,然后與細胞共同孵育12h。樣品作用結束后，于室溫放置30min,吸棄原培養基,每孔加入50 μ IBright-GloLuciferase突光素酶檢測試劑,室溫避光震蕩5min,置于光化學檢測儀中，選擇ONE-Glo程序進行檢測。該模型以熒光素酶光化學值的變化直接指示樣品對NF-K B-RE是否有阻斷作用。因此，通過計算抑制率，可確定樣品在NF-K B信號通路中對早期基因表達阻斷作用的強弱。
權利要求
1.ー種對炎癥因子表達具有抑制作用的藥物組合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物組成，所述提取物的制備方法如下 a)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比2.5 4 2. 5 4 I. 5 2.5 0. 5 I. 5的比例混勻； b)將所述原料藥中加入水或40 60%的こ醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 5 10，提取2次以上，毎次I. 5 4. 5小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣； c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上大孔樹脂，采用水、30%こ醇、60 %こ醇和95%こ醇作為洗脫液進行連續淋洗，分別得到30%こ醇淋洗物即為所述第I提取物，60%こ醇淋洗物即為所述第2提取物、95%こ醇淋洗物即為所述第3提取物； d)將所述第1、2、3提取物混合，得到所述藥物組合物。
2.如權利要求I所述的制備方法，其中所述原料藥中金銀花、玄參、當歸、甘草的重量比為 3 : 3 : 2 : I。
3.如權利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中こ醇的濃度為55%。
4.如權利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中固液比為I: 6 8。
5.如權利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中的提取次數為4次，毎次提取時間為2 4小時。
6.如權利要求I所述的制備方法，其中所述大孔樹脂為AB-8大孔樹脂。
7.如權利要求I所述的藥物組合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比0. 3 5. 4 0. 2 4. 2 I的比例進行混合。
8.如權利要求I所述的藥物組合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比0. 6 3 0. 5 2. I I的比例進行混合。
9.如權利要求I所述的藥物組合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比I. 34 1.05 I的比例進行混合。
全文摘要
本發明提供了一種對炎癥因子表達具有抑制作用的藥物組合物，由第1提取物、第2提取物和第3提取物組成，所述提取物的制備方法如下將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比2.5～4∶2.5～4∶1.5～2.5∶0.5～1.5的比例混勻后乙醇提取，得到提取液；所得提取液濃縮后上大孔樹脂，分別30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇洗脫，分別得到第1～3提取物；混合后得到藥物組合物。本發明的藥物組合物能夠有效地抑制炎癥因子表達。
文檔編號A61P29/00GK102727654SQ20121009653
公開日2012年10月17日 申請日期2012年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者吳圣賢, 聶波, 陳立新 申請人:北京中醫藥大學