干擾素調節因子5（IRF5）及其抑制劑在治療心肌肥厚中的應用的制作方法

本發明屬于基因的功能與應用領域，涉及干擾素調節因子5(InterferonRegulatoryFactor-5，IRF5)作為藥物靶標在篩選治療心肌肥厚的藥物中的應用，以及IRF5的抑制劑在制備治療心肌肥厚的藥物中的應用。
背景技術：
：心肌肥厚是心臟對各種刺激產生的代償性增生，以心肌細胞體積增大、心臟質量增加為特征，是獨立的心血管危險因素之一，最終導致心力衰竭，甚至猝死。多種刺激均可導致心肌肥厚，主要包括機械牽張、壓力負荷以及多種神經體液因素(如缺血、缺氧、NO缺乏、炎癥因子等)[1]。其主要病理變化包括心肌細胞肥大、心肌間質增殖以及細胞外基質重建等，即心肌重構。心肌肥厚時，心肌細胞蛋白合成增加、體積增大、直徑增寬或長度增加；心肌肌節數量增多、纖維組織增生、胚胎基因再表達[2]。關于心肌肥厚的分子機制尚未完全闡明，其主要與細胞信號通路激活密切相關。目前研究表明，參與心肌肥厚的信號通路主要有Jak-STAT、低分子量GTPases、G蛋白家族、PKC、MAPK、CaN、Wnt、AMPK及miRNA信號通路等，且各信號通路及信號通路效應子之間相互作用。目前對心肌肥厚的主流治療策略是通過干預心肌重構相關的分子靶點，改善心功能，預防和逆轉心臟重構[3]。當今臨床上，血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素II受體I阻斷劑(ARBs)、鈣拮抗劑(CAs)被作為主要的抗心肌肥厚藥物。此外動物實驗還提示了他汀類藥物在治療心肌肥厚中的潛力[4]。IRF家族是一大類對IFN起調控作用的轉錄因子。IRF家族包含10個成員，其中，IRF1-9普遍表達于哺乳動物中，IRF10則特異性地在鳥類和魚類中表達。在結構上，IRF家族成員的N末端含有相對保守的DNA結合結構域(DNAbindingdomain，DBD)，C末端包含有IRF相關結構域(IRFassociateddomain，IAD)、自我抑制結構域、磷酸化位點等[5]。IRF5基因定位于染色體7p32，其全長序列與IRF家族其他成員高度同源。在無應激狀態下，IRF5主要位于細胞漿，當受到外界刺激后，能夠被磷酸化形成二聚體，并入核誘導IFN的表達。IRF5是巨噬細胞M1極化的標志物，它在M1巨噬細胞中高表達，并且它能夠通過直接激活IL-12p40、IL-12p35和IL-23p19的表達以及抑制IL-10的表達來調節巨噬細胞M1的極性分化[6]。IRF5能通過促進Blimp1的表達來促進B細胞的成熟，對于成熟B細胞上的抗體產生和分泌是必須的[7]。在T細胞中，IRF5缺失導致Th1細胞反應障礙，IL-12p35和iNOS的表達顯著下調，IRF5缺失的小鼠無法抵抗杜氏利什曼原蟲的感染[8]。在單核細胞向單核源性的樹突細胞分化的過程中，IRF5表達上調并促進了樹突細胞TNF-α的持續性分泌[9]。在所有的IRF家族成員中，IRF5與自身免疫性疾病發生發展的關系最為密切，包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、炎性腸病、系統性硬化等[10]。參考文獻：1.ManningJ，VehaskariVM.PostnatalmodulationofprenatallyprogrammedhypertensionbydietaryNaandACEinhibition.AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol.2005，288(1)：R80-84.2.DevereuxRB.Therapeuticoptionsinminimizingleftventricularhypertrophy.AmHeartJ.2000，139(1Pt2)：S9-14.3.AvanzaACJr，ElAouarLM，MillJG.Reductioninleftventricularhypertrophyinhypertensivepatientstreatedwithenalapril，losartanorthecombinationofenalaprilandlosartan.ArqBrasCardiol.2000，74(2)：103-117.4.GavaAL，BalariniCM，PeottaVA，etal.Baroreflexcontrolofrenalsympatheticnerveactivityinmicewithcardiachypertrophy.AutonNeurosci.2012，170(1/2)：62-65.5.IkushimaH，NegishiH，TaniguchiT.TheIRFfamilytranscriptionfactorsattheinterfaceofinnateandadaptiveimmuneresponses.ColdSpringHarborsymposiaonquantitativebiology.2013；78：105-16.6.BarnesBJ，MoorePA，PithaPM.Virus-specificactivationofanovelinterferonregulatoryfactor，IRF-5，resultsintheinductionofdistinctinterferonalphagenes.TheJournalofbiologicalchemistry.2001Jun29；276(26)：23382-90.7.LienC，FangCM，HusoD，LivakF，LuR，PithaPM.CriticalroleofIRF-5inregulationofB-celldifferentiation.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.2010Mar9；107(10)∶4664-8.8.KrausgruberT，BlazekK，SmallieT，AlzabinS，LockstoneH，SahgalN，HussellT，FeldmannM，UdalovaIA.IRF5promotesinflammatorymacrophagepolarizationandTH1-TH17responses.Natureimmunology.2011Mar；12(3)：231-8.9.PaunA，BankotiR，JoshiT，PithaPM，StagerS.CriticalroleofIRF-5inthedevelopmentofThelper1responsestoLeishmaniadonovaniinfection.PLoSpathogens.2011；7(1)：e1001246.10.EamesHL，CorbinAL，UdalovaIA.Interferonregulatoryfactor5inhumanautoimmunityandmurinemodelsofautoimmunedisease.Translationalresearch：thejournaloflaboratoryandclinicalmedicine.2016Jan；167(1)：167-82.技術實現要素：為改進臨床防治心肌肥厚疾病現有技術的缺陷和不足，本發明的目的在于確定IRF5基因的表達與心肌肥厚疾病間的相互關系，提供IRF5作為藥物靶標在篩選、防治心肌肥厚疾病藥物中的應用，進而提供IRF5的抑制劑在制備防治心肌肥厚疾病的藥物中的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現：1、IRF5基因敲除顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，改善心功能本發明選用心臟特異性α-MHC-MCM小鼠、IRF5心臟特異性基因敲除小鼠(IRF5-CKO)、用于構建IRF5-CKO的條件性敲除小鼠(IRF5-flox，IRF5正常表達)進行試驗，并將每種小鼠分成假手術組和手術組，每組10只小鼠。手術組給予主動脈弓縮窄手術，假手術組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術組和手術組的各組小鼠進行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究IRF5基因敲除對主動脈弓縮窄誘導的心肌肥厚的影響。結果表明敲除基因所致的IRF5缺陷顯著地抑制心肌肥厚、纖維化及改善心功能。2、IRF5基因過表達顯著促進了心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能本發明選用心臟特異性IRF5轉基因小鼠和非轉基因小鼠進行試驗，并將每種小鼠分成假手術組和手術組，每組10只小鼠。手術組給予主動脈弓縮窄手術，假手術組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術組和手術組的各組小鼠進行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究IRF5基因過表達對主動脈弓縮窄誘導的心肌肥厚的影響。結果表明過表達IRF5基因顯著地促進心肌肥厚、纖維化，并惡化心功能。3、IRF5干擾(AdshIRF5)及過表達(AdIRF5)腺病毒對經AngII誘導的心肌細胞肥大模型的影響本發明通過構建重組腺病毒AdshIRF5及AdIRF5感染SD乳鼠原代心肌細胞，予以AngII刺激構建心肌細胞肥大模型，對照組則予以PBS，經免疫熒光監測及心肌細胞表面積統計表明，在AngII刺激下IRF5干擾病毒明顯抑制心肌細胞肥大，心肌細胞表面積減小；IRF5過表達病毒顯著促進心肌細胞肥大，心肌細胞表面積增大。由上述結果可知IRF5基因缺陷抑制促進了心肌肥厚、纖維化，改善心功能，促進IRF5表達則促進心肌肥厚、纖維化，惡化心功能。本發明的研究證明了：在主動脈縮窄術造成心肌肥厚模型中，IRF5具有促進心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能的作用。因此，針對上述功能，IRF5基因可作為藥物靶點，構建IRF5基因過表達的體外細胞模型或動物模型，從而用于篩選預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物；IRF5基因也可作為基因治療中的靶基因，在其基礎上設計并制備預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物和/或生物學試劑，通過基因工程技術達到預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的目的。例如，以IRF5為靶基因設計干擾IRF5表達的雙鏈siRNA，通過化學方法合成后注射入人體，通過RNA干擾的方法使IRF5基因沉默以治療心肌肥厚疾病；此外還可以設計并構建IRF5的突變體，注射后進入細胞，競爭IRF5原型的作用底物，從而抑制IRF5的功能，達到治療目的；另還可以IRF5為靶點設計小分子化合物抑制劑，利用IRF5基因過表達的體外細胞模型或動物模型，通過篩選發現其中能夠特異性抑制IRF5的分子，從而為心肌肥厚疾病提供新的治療性分子。本發明針對IRF5的上述功能，提供IRF5作為藥物靶標在篩選保護心臟功能、預防、緩解和/或治療心肌肥厚及抗心肌纖維化的藥物中的應用。所述的應用是非診斷和非治療的目的；所述的篩選是指篩選IRF5的抑制劑。本發明針對IRF5的上述功能，提供IRF5的抑制劑在制備保護心臟功能、預防、緩解和/或治療心肌肥厚及抗心肌纖維化的藥物中的應用。一種保護心臟功能的藥物，包含IRF5的抑制劑。一種預防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，包含IRF5的抑制劑。一種抗心肌纖維化的藥物，包含IRF5的抑制劑。所述的IRF5的抑制劑具有本領域公知的含義，其可以是能夠特異抑制IRF5對靶基因的調控作用的任何物質，可以是在細胞中特異抑制IRF5表達的物質，也可以是與IRF5具有特異性相互作用并能減弱IRF5作用的物質。優選為IRF5基因的siRNA、IRF5基因的RNA干擾載體，IRF5的抗體及其他能夠抑制IRF5表達的抑制劑中的一種。一種篩選用于保護心臟功能和預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物的方法，為篩選IRF5的抑制劑的方法，包括：根據IRF5的序列設計其反義RNA，或者將IRF5與候選物質接觸，檢測IRF5的表達或作用，并選擇特異抑制IRF5表達或減弱IRF5作用的候選物質。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：(1)本發明發現IRF5的新功能，即IRF5具有促進心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能的作用。(2)基于IRF5的功能，其為研制保護心臟功能、預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物提供靶標。(3)IRF5的抑制劑可用于制備保護心臟功能、預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物。附圖說明圖1是心臟特異性IRF5基因敲除小鼠的打靶策略圖。圖2是心臟特異性IRF5轉基因小鼠的構建策略及IRF5蛋白表達量統計圖。其中，A為構建策略；B為蛋白表達量統計，圖中TG1-TG4是不同個體的IRF5轉基因小鼠。圖3是正常人和擴張性心肌病患者心臟中IRF5蛋白的表達圖，GAPDH作為內參，結果顯示擴張性心肌病患者心臟中IRF5的表達上調(*：p＜0.05vs正常人組)。圖4是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB術4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統計柱狀圖，結果顯示IRF5敲除顯著降低HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05vsα-MHC-MCMSham組，§：p＜0.05vsIRF5-floxsham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCMAB組)。圖5是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB術4周后心臟表型、心臟組織HE染色及心肌細胞橫截面積統計柱狀圖，結果顯示IRF5敲除顯著減輕心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsα-MHC-MCMSham組，§：p＜0.05vsIRF5-floxsham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCMAB組)。圖6是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB術4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結果顯示IRF5敲除顯著減輕心臟的纖維化(*：p＜0.05vsα-MHC-MCMSham組，§：p＜0.05vsIRF5-floxsham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCMAB組)。圖7是NTG和IRF5-TG小鼠AB術4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統計柱狀圖，結果顯示IRF5過表達組HW/BW、LW/BW及HW/TL明顯升高(*：p＜0.05vsNTGSham組，#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖8是NTG和IRF5-TG小鼠AB術4周后心臟表型、心臟組織HE染色及心肌細胞橫截面積統計柱狀圖，結果顯示IRF5過表達會促進心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsNTGSham組，#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖9是NTG和IRF5-TG小鼠AB術4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結果顯示IRF5過表達會加重心臟纖維化(*：p＜0.05vsNTGSham組，#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖10是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB術4周后超聲檢測心功能結果統計柱狀圖，結果顯示敲除IRF5顯著改善心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內徑、LVESD為左室收縮末期內徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vsα-MHC-MCMSham組，§：p＜0.05vsIRF5-floxsham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCMAB組)。圖11是NTG和IRF5-TG小鼠AB術4周后超聲檢測心功能結果統計柱狀圖，結果顯示過表達IRF5心功能顯著惡化；其中，LVEDD為左室舒張末期內徑、LVESD為左室收縮末期內徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vsNTGSham組，#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖12是SD乳鼠原代心肌細胞用腺病毒AdshRNA、AdshIRF5、AdGFP、AdIRF5感染，經AngII刺激后的免疫熒光及細胞表面積統計柱狀圖，IRF5的過表達病毒促進心肌細胞肥大，IRF5的干擾病毒抑制心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFPPBS組，#：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFPAngII組)。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進行一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實驗用動物及飼養實驗動物：選用8-10周齡、體重23.5-27.5g、雄性的心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre(α-MHC-MCM)，背景為C57BL/6，購自JacksonLaboratory，貨號005650)、IRF5-flox條件性敲除小鼠(IRF5-flox)、心臟特異性IRF5基因敲除小鼠(IRF5-CKO)、心臟特異性IRF5轉基因小鼠(IRF5-TG)及非轉基因小鼠(NTG，同齡同窩對照非轉基因小鼠)為實驗對象。飼養環境：所有實驗小鼠均飼養在武漢大學SPF級實驗動物中心。SRF級小鼠飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。實施例1心臟特異性IRF5基因敲除小鼠以及IRF5轉基因小鼠的構建1.心臟特異性IRF5基因敲除小鼠的構建(構建策略見圖1)利用CRISPR-Cas9技術構建心臟特異性IRF5基因敲除小鼠。首先，通過在線CRISPR設計工具(http：//crispr.mit.edu)分別在小鼠IRF5基因內含子2和3中各設計一個CRISPR的打靶位點，靶序列分別為：IRF5-sgRNA1：GGCAAGCAGGTACAATCTCAAAGG，IRF5-sgRNA2：GGCAGTGGTAATGAAGAAGCACCTGG。此外還設計了一個用于同源修復的供體載體(DonorVector)，它包括兩側同源臂、中間的外顯子3以及兩個同向的loxp序列。(1)打靶載體的構建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經過限制性內切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續的體外轉錄實驗。(2)條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SDeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。(3)供體載體的構建：根據引物設計原則，設計如下引物(表1)用于擴增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴增得到的產物經表l中所示限制性內切酶酶切后得到3個片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到供體載體。表l構建供體載體所需引物序列及對應酶切位點引物名稱引物序列酶切位點IRF5LA-FCCGCTCGAGAGTGCCTTTCTGTGGAGAGCXhoIIRF5LA-RATGGACGTCTTGAGGCCAAGCAGACCAAAAatIIIRF5M-FTCTACCGGTATTGTACCTGCTTGCCCTCCAgeIIRF5M-RGGCGATATCCCTCACCCCACTCCCAGATAEcoRVIRF5RA-FGGACTAGTCCTTTGCCTGCTGCTTCTTGSpeIIRF5RA-RATAAGAATGCGGCCGCCTCCCCAGTTCAGCCTTGACNotI(4)打靶載體的轉錄：對CRIPR/Cas9系統包含的兩個部分(負責切割作用的Cas9蛋白和引導Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體pST1374-Cas9(Addgene44758)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質粒為轉錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉錄，獲得加帽的mRNA產物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產物加尾，獲得成熟的mRNA產物；對于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉錄。將轉錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)進行純化。(5)IRF5-flox條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產物與供體載體一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續的繁殖，最終獲得IRF5-flox純合小鼠，該小鼠體內IRF5蛋白正常表達。(6)心臟特異性IRF5基因敲除小鼠的制作將上述IRF5-flox小鼠與心臟特異性α-MHC-Cre(購自JacksonLaboratory，貨號005650)轉基因小鼠交配，篩選得到IRF5flox/flox/α-MHC-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen(他莫昔芬)，誘導Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到心臟細胞特異性IRF5基因敲除小鼠。2.心臟特異性IRF5轉基因小鼠的構建(構建策略見圖2A)以C57BL/6小鼠IRF5基因的cDNA為模板，用如下引物PCR擴增小鼠IRF5基因(NCBI，GeneID：27056，NM_012057.4)：上游引物：5’-GCTCTAGAGCCACCATGAACCACTCAGCCCCA-3’，下游引物：5’-GCTCTAGATTATTGCATGCCAACTGGGT-3’。把擴增得到的產物和pCAG-CAT-LacZ載體(北京協和醫學院基礎學院楊青林老師實驗室提供，制備過程參見參考文獻：KimT，ZhelyabovskaO，LiuJ，etal.GenerationofanInducible，Cardiomyocyte-SpecificTransgenicMouseModelwithPPARb/dOverexpression[J].PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptors(PPARs)，57.)用限制性內切酶XbaI(NEB，#R0145L)酶切后連接，得到轉基因載體pCAG-CAT-IRF5-polyA，IRF5的表達由CAG啟動子驅動得到。將構建的pCAG-CAT-IRF5-polyA載體通過顯微注射構造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到IRF5-floxed轉基因小鼠。心臟特異性IRF5轉基因小鼠由IRF5-fioxed轉基因小鼠和α-MHC-Cre(購自JacksonLaboratory，貨號005650)小鼠雜交繁殖得到，方法同上述基因敲除小鼠的構建。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取對應組織總蛋白，使用WesternBlot方法篩選IRF5表達量最高的小鼠。將其同窩陽性鼠繼續繁殖，從而獲得穩定遺傳心臟特異性IRF5轉基因小鼠品系。為了反映病理生理狀態下IRF5的改變，本發明選擇了IRF5-TG2小鼠，WesternBlot及定量分析顯示，其心臟組織中IRF5表達量約為正常組織4.38倍(圖2B)。實施例2IRF5在正常人和心肌病患者心臟中的表達選用正常人心臟(非心臟原因的死亡捐獻的個體)、擴張型心肌病患者心臟移植手術病人置換的受體)，對心臟提取蛋白質進行SDS-PAGE-免疫印跡實驗(WesternBlot)，結合特異性識別IRF5的抗體進行檢測，測定其IRF5的表達，GAPDH作為內參。檢測結果如圖3所示，擴張型心肌病患者心臟中IRF5的表達明顯上調。實施例3心肌肥厚模型的獲得1.實驗動物分組：通過主動脈縮窄術(AB)建立心肌肥厚模型。隨機分為10組，分組如下：對照組小鼠假手術組(α-MHC-MCMSham、IRF5-floxSham)及AB術組(α-MHC-MCMAB、IRF5-floxAB)、IRF5基因敲除小鼠假手術組(IRF5-CKOSham)及AB術組(IRF5-CKOAB)、非轉基因小鼠假手術組(NTGSham)及AB術組(NTGAB)、心臟特異性IRF5轉基因小鼠假手術組(TGSham)及AB術組(TGAB)。2.心肌肥厚模型采用主動脈弓縮窄(AB)手術，模型操作流程：2.1術前準備(1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計算所需麻藥(3％戊巴比妥鈉)量，通過腹腔注射，并記錄注射時間點。夾尾、夾趾無明顯反應且小鼠狀態良好為麻醉成功標準(一般注射后約10min無明顯反應，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應，麻醉后30min左右為最佳手術時間)。(2)術區準備：將小鼠左胸部、左側胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗布擦拭術區去除鼠毛，以不影響手術視野為宜。(3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經聲門準確插入氣管內，隨后右側臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預熱)，然后將氣管插管與呼吸機連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機頻率一致，說明氣管插管成功。2.2主動脈弓降支結扎術取右側臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分數為75％的酒精對手術區域皮膚消毒。左手持眼科鑷將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約1cm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水平打開胸腔，用棉簽稍撥開左肺，游離主動脈弓降支，將7-0手術縫線穿過血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器針頭，將血管及針頭一起結扎好，再抽出針頭即可達到相應程度的血管縮窄。結扎完畢后依次縫合，關閉胸腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出1cc氣體以恢復胸腔內負壓，拔出注射器后迅速縫合皮膚切口。假手術組(Sham)在游離出主動脈降支后只穿線不結扎，其余步驟同心肌肥厚模型組。2.3術后護理主動脈弓降支結扎術后，待小鼠出現自主呼吸、夾趾出現強烈反應，拔出氣管插管，并將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養籠內，于飼養室繼續飼養觀察。IRF5基因敲除小鼠及對照組小鼠術后4周、非轉基因小鼠及心臟特異性IRF5轉基因小鼠術后4周分別進行各項指標的檢測。實施例4心肌肥厚模型小鼠病理學檢測1.取材(1)前期工作：預先準備裝有20mL的體積分數10％甲醛的尿杯，并貼好標簽(小鼠編號、組別、手術類型及取材日期)。將倒滿質量分數10％KCl溶液的培養皿置于取材處。打開分析天平，調零備用。再稱重處死小鼠。(2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質量分數10％KCl溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內液體，蘸干表面液體后，稱重并記錄，將心臟放入相應的尿杯中，固定48h后用于病理學檢測。(3)相關測量及計算：取出小鼠心臟、肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開小鼠后肢脛骨處皮膚，測量并記錄脛骨長度。計算心重與體重的比值(HW/BW)，肺重與體重的比值(LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值(HW/TL)。2.病理學檢測2.1制備石蠟標本切片主要操作程序包括修剪心臟→包埋框處理→流水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→攤片→晾干或烘烤后備用。2.2蘇木精-伊紅(HE)染色主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→雙蒸水1min→蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL70％酒精充分混合均勻)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氫鈉0.35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶于100mL蒸餾水)1min→水洗1min→伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)3-5min→蒸餾水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通風櫥內吹干，顯微鏡拍照。HE染色圖片統計：每張圖片選擇3個以上邊界清楚，核大致位于中央的細胞，用Image-ProPlus6.0軟件統計細胞橫截面積。2.3天狼星紅(PSR)染色主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水沖洗10min→雙蒸水1min→質量分數0.2％磷鉬酸2min→0.1％天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min→去除殘液→0.01N鹽酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB術后的表型結果見圖4、圖5、圖6。Sham(假手術)組中α-MHC-MCM、IRF5-flox小鼠和IRF5-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無統計學意義；α-MHC-MCM、IRF5-flox小鼠AB術后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham組；AB術后4周，IRF5-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均較對照組小鼠降低(圖4)。心臟表型，Sham組心臟無明顯差異，AB組較Sham組的心臟均增大，IRF5-CKO小鼠的心臟明顯小于α-MHC-MCM、IRF5-flox對照組小鼠；HE染色切片可觀察到：Sham組心肌肌原纖維細胞排列整齊、致密，形態完整，胞核及核仁結構清晰；AB組肌絲排列紊亂、松散，心肌細胞體積明顯增大，形態不規整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，IRF5-CKO組則較對照組細胞肥大減輕，差異有統計學意義(圖5)。PSR染色后，發現AB組心室心肌間質膠原含量較Sham組增加，動脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增粗，排列紊亂成網絡狀；AB術后IRF5-CKO小鼠膠原含量及血管周圍膠原含量低于對照組小鼠(圖6)。以上結果說明經AB術后，小鼠發生明顯的心肌肥厚，而IRF5-CKO小鼠的心肌肥厚程度輕于對照組小鼠。圖7、圖8、圖9是NTG和IRF5-TG小鼠AB術后的表型結果。同樣NTG小鼠AB術后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明顯大于NTG小鼠(圖7)。心臟表型，AB組較Sham組的心臟均增大，且AB術后TG小鼠心臟增大的程度遠大于NTG小鼠。HE染色切片可觀察到：TG小鼠AB術后心肌細胞橫截面積大于Sham組，AB組TG小鼠顯著大于NTG小鼠(圖8)。PSR染色可見：TG小鼠AB術后心肌間質膠原含量及血管周圍膠原含量均高于NTG小鼠AB組(圖9)。以上結果說明經AB術后，小鼠發生明顯的心肌肥厚，IRF5-TG小鼠的心肌肥厚程度較NTG小鼠更重。實施例5心肌肥厚模型小鼠超聲檢測心功能1.前期準備(1)麻醉機準備：先連接氧氣瓶和麻醉機上的進氣接口，再擰開麻醉機上加藥口密封蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調整流量控制閥的旋鈕，出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。(2)待測小鼠準備：待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區剃毛，將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導管套頭內，以1.5-2.0％異氟烷維持小鼠穩定的麻醉狀態。2.心功能檢測小鼠取左側臥位或仰臥位，并在剃毛區均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司)。采用高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)及短軸縮短率(FS)。本實施例運用M型超聲心動圖檢測評價心肌肥厚和心功能。圖10是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB術后心功能檢測結果。與對照Sham組相比，α-MHC-MCM、IRF5-flox小鼠AB術后4周表現出心功能減弱和心肌肥厚，主要表現為心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指標FS則下降。AB術后4周，IRF5-CKO小鼠心肌肥厚的指標增大的程度及反映心功能的指標下降的程度輕于α-MHC-MCM、IRF5-flox小鼠。這些結果與IRF5-CKO小鼠心肌肥厚減輕的結果一致。圖11是NTG和IRF5-TG小鼠AB術后的超聲檢測結果。與NTGSham組相比，NTG小鼠AB術后4周表現出心功能降低及心肌肥厚。主要表現為心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD升高，而反映心功能的指標FS則下降。AB術后4周，與NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚指標升高的程度及反映心功能的指標下降的程度均明顯高于NTG組。這些結果與TG小鼠心肌肥厚顯著加重的結果一致。實施例6IRF5干擾(AdshIRF5)及過表達(AdIRF5)腺病毒對AngII刺激的原代心肌細胞肥大的影響1.原代新生SD大鼠心肌細胞培養(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，頸部以下75％酒精消毒，用眼科剪和顯微鑷取下心臟，放入盛有10mLDMEM/F12培養基的玻璃平皿中。再取另一只，重復以上過程。(2)用DMEM/F12培養基清洗心臟，并將心臟剪成1-2mm3的碎片。轉入到放有轉子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。轉速為120r/min，消化15min，靜止數秒鐘，棄去上清液。(3)加入胰酶消化液，轉速為120r/min，消化15min。靜止數秒鐘，吸取上清液，用含20％小牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，并置于4℃冰箱保存。重復該步驟，循環若干次。取上清時應盡量取盡，當組織塊變白并明顯變小時，終止消化。(4)將收集好的心肌細胞懸液以1500rpm轉速離心8min，棄去上清液。在離心管中加入適量培養基，輕柔吹打重懸細胞，集中至1個50mL離心管中，細胞懸液用細胞40μm過濾網過濾。(5)將細胞接種在100mm的培養皿中，差時貼壁90min，吸取未貼壁的細胞懸液過濾。根據細胞懸液的總量加入Brdu(終濃度0.1mM)，混勻之后，加入到用0.1％明膠包被的器皿中。(6)輕搖分散細胞，勿漩渦搖晃。37℃、5％CO2孵育48小時用PBS清洗1次，更換培養基。2.IRF5干擾(AdshIRF5)及過表達(AdIRF5)腺病毒對經AngII誘導的心肌細胞肥大模型的影響AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作對照)、AdshIRF5(含shRNA-IRF5(沉默RNA-IRF5融合蛋白)的腺病毒，沉默IRF5表達)、AdGFP(含GFP(綠色熒光蛋白)的腺病毒，用作對照)及AdIRF5(含GFP-IRF5(綠色熒光蛋白-IRF5融合蛋白)的腺病毒，IRF5過表達)。(1)重組腺病毒構建從美國InvivoGen公司購得IRF5的表達載體，應用腺病毒表達系統AdenoVec構建重組AdGFP、AdIRF5；從美國SuperArray公司購得shRNA、shIRF5載體，然后應用腺病毒表達系統AdenoVec構建重組AdshRNA、AdshIRF5。(2)重組腺病毒的鑒定取病毒粗提液加入裂解液，經混勻、離心后取上清液作為模板進行PCR擴增，產物通過凝膠電泳鑒定。(3)重組腺病毒的擴增轉染前接種HEK293細胞，待細胞達到50-70％匯合時換液，加入含有重組腺病毒載體的新鮮培養液，培養90分鐘后再添加新鮮培養液，培養至大約有50％的細胞從培養板上脫落時，收集細胞懸液。反復凍融以制備病毒粗提液，通過CsCl密度梯度超速離心法純化病毒液。(4)重組腺病毒滴度測定在96孔板中接種HEK293細胞，24小時后加入倍比稀釋的病毒液，1-10列加入稀釋的病毒液，每個濃度8個重復孔，11-12列加入無病毒完全培養液，培養10天后在顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)，計算每個濃度的陽性率。病毒滴度采用Spearman-KarberMethod計算：滴度(pfu/mL)＝10(x+0.8)，x＝各濃度陽性率總和。前提條件：陰性對照無CPE和生長抑制現象；最小稀釋濃度組均有CPE；最大稀釋濃度組均無CPE。(5)重組腺病毒作用的鑒定：用2×108pfu/virus濃度的AdIRF5和AdGFP及AdshIRF5和AdshRNA感染6孔培養板中培養的心肌細胞(約80％匯合度)，24小時后收集細胞，加入蛋白裂解液裂解50分鐘后收集上清，取50μg樣品經10％SDS-PAGE電泳分離后，用IRF5特異性抗體做WesternBlot分析。根據IRF5蛋白的表達，確定腺病毒AdIRF5和AdGFP及AdshIRF5和AdshRNA是否能發揮預期作用。由AdGFP和AdshRNA感染的細胞IRF5蛋白表達含量不變。由AdshIRF5感染的細胞IRF5蛋白表達含量顯著減少；相反的，由AdIRF5感染的細胞IRF5蛋白表達含量顯著增加。腺病毒10MOIs分別感染培養3天的原代心肌細胞，12小時后用1μM血管緊張素II(AngII)(購自Sigma，A9525)或對照PBS刺激48小時，然后進行免疫熒光試驗。結果表明，經AdshIRF5腺病毒感染后的心肌細胞表面積較AdshRNA對照組顯著減小，而經AdIRF5腺病毒感染的心肌細胞表面積則與對照組相比AdGFP明顯增大(圖12)。即IRF5的干擾腺病毒抑制心肌細胞肥大，IRF5過表達的腺病毒則促進心肌細胞肥大。由以上結果可知，在主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚疾病模型中，IRF5基因缺陷顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，改善心功能，IRF5基因過表達顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能。因此IRF5基因具有促進心肌肥厚及纖維化并使心功能惡化的作用，IRF5基因可促進主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關疾病的發生發展。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>武漢大學<120>干擾素調節因子5（IRF5）及其抑制劑在治療心肌肥厚中的應用<130>1<160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>Musmusculus<400>1ggcaagcaggtacaatctcaaagg24<210>2<211>26<212>DNA<213>Musmusculus<400>2ggcagtggtaatgaagaagcacctgg26<210>3<211>54<212>DNA<213>Artificial<220><223>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>Artificial<220><223>loxp1-R<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>IRF5LA-F<400>7ccgctcgagagtgcctttctgtggagagc29<210>8<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>IRF5LA-R<400>8atggacgtcttgaggccaagcagaccaaa29<210>9<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>IRF5M-F<400>9tctaccggtattgtacctgcttgccctcc29<210>10<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>IRF5M-R<400>10ggcgatatccctcaccccactcccagata29<210>11<211>28<212>DNA<213>Artificial<220><223>IRF5RA-F<400>11ggactagtcctttgcctgctgcttcttg28<210>12<211>36<212>DNA<213>Artificial<220><223>IRF5RA-R<400>12ataagaatgcggccgcctccccagttcagccttgac36<210>13<211>32<212>DNA<213>Artificial<220><223>上游引物<400>13gctctagagccaccatgaaccactcagcccca32<210>14<211>28<212>DNA<213>Artificial<220><223>下游引物<400>14gctctagattattgcatgccaactgggt28當前第1頁1 2 3