一種角膜基質、制備方法與應用與流程
本發明涉及醫用生物材料技術領域，具體涉及一種角膜基質、制備方法與應用。
背景技術：
角膜位于眼球的最前端，直接與外界環境接觸，易受損傷和感染，如果用眼不衛生，很容易引起角膜發炎甚至混濁，導致視力減退甚至失明。據世界衛生組織報告，角膜病是引起視力喪失的第二位主要病因，僅次于白內障。目前，治療角膜盲的唯一有效手段就是角膜移植，角膜移植所用的角膜主要有三個來源：同源異體角膜捐獻、人工角膜和組織工程角膜。捐獻的角膜來源有限，角膜供體嚴重短缺，無法滿足現有眾多角膜病盲患者治療的需要，極大地限制了角膜盲患者脫盲，這也是世界各國亟待解決的問題。人工角膜的材料有硬性人工角膜材料、硅膠材料、phema、pmma材料等，這些材料雖然對緩解角膜病有一定的效果，但是都不能與患者組織形成良好的結合，有些材料甚至會導致患者眼部組織壞死，產生并發癥。
基于對人工角膜合成材料與細胞間相互作用的深入了解，科學家們開始對活體細胞外基質構建人角膜等效物進行研究，希望獲得與天然角膜結構相似、具備相似理化性能的組織工程器官，可用于臨床治療角膜盲病。人類對組織工程角膜的研究，進行了各種嘗試，如在膠原上培養牛角膜細胞、利用羊膜培養自體角膜緣上皮細胞成功修復眼表損傷、利用溫度敏感培養基體外培養自體口腔粘膜細胞修復眼表、利用自體角膜緣干細胞體外培養角膜上皮細胞膜片等，這些研究為組織工程角膜的研究奠定了理論基礎，但是仍不能滿足臨床使用要求，比如膠原韌性差，無法抵抗眼內壓作用及縫線的機械牽拉作用，人們對角膜創傷愈合機制仍需深入研究。經過多年的研究，發現了一種理想的組織工程角膜材料，免疫原去除豬角膜基質材料，其與人角膜基質具有極為相似的結構，并且具有免疫原性低、來源豐富的特點。免疫原去除的異種組織主要成分為膠原、彈力纖維等，形態與韌性變化較小。免疫原去除可以降低異種組織的炎癥反應和免疫排斥反應，與人體的生物相容性好，于此同時基質中的生長因子可以誘導人角膜邊緣細胞分化成相應的角膜細胞，免疫原去除豬角膜基質材料已成為治療角膜盲病的不二選擇。
對于組織工程角膜的研究，中國走在世界的前沿。深圳艾尼爾角膜工程有限公司于2015年4月22日推出了全球首個上市的生物工程角膜，該角膜產品取材于豬眼角膜，經病毒滅活與免疫原去除等工藝制備而成，是豬角膜的細胞外基質，細胞外基質的主要成分為膠原蛋白。本產品具有天然角膜的膠原纖維結構，保留了天然角膜的前彈力層和部分基質層。廣東冠昊生物科技股份有限公司控股的廣州優得清生物科技有限公司的專利，專利號cn201310527550.4，公開了一種角膜材料的制備方法，以動物角膜為原料，制備出透明性高、低免疫原性、生物活性和生物相容性好的異種角膜材料，且保持膠原三維結構與新鮮角膜相近，并通過膠原交聯進一步降低膠原的抗降解性和免疫原性。
技術實現要素：
本發明提供一種以動物的眼角膜為原料，利用反復凍融法和酶溶液免疫原去除的方法，制備出抗拉強度大、無免疫原性、生物相容性好的角膜基質。
為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為：一種角膜基質，采用動物的眼角膜為原料，去除角膜上皮層、角膜基質中的細胞成分和dna成分，保留前彈力層和部分厚度角膜基質，保留完整的細胞外基質成分(檢測其力學性能、其化學性能、生物性能和降解性能)。
所述動物為哺乳動物，優選豬或牛。
所述部分厚度角膜基質為與前彈力層相連的具有一定厚度的角膜基質。
所述細胞外基質成分為膠原蛋白、糖胺聚糖。
所述膠原蛋白為i型膠原蛋白和iv型膠原蛋白，i型膠原蛋白和iv型膠原蛋白的含量為85-90％。
所述糖胺聚糖為硫酸軟骨素和硫酸角質素。
本發明上述的角膜基質，其為直徑7-10cm、厚度0.1-0.2mm的圓片。
所述去除角膜上皮層、角膜基質中的細胞成分和dna成分是以細胞殘留量、dna殘留量、半乳糖苷酶清除率評價的，即生物性能為細胞殘留量、dna殘留量、半乳糖甘酶(α-gal)清除率。
本發明上述的角膜基質，所述細胞殘留量為0個，所述dna殘留量小于10ng/mg，所述半乳糖甘酶(α-gal)清除率為99％以上。
本發明還提供一種上述角膜基質的制備方法，其特征在于：通過凍融溶脹和免疫原去除的方法制備所述角膜基質。
具體的，本發明上述的角膜基質的制備方法，步驟包括：
(1)原料處理：取動物的眼球，取角膜(例如使用環鉆鉆取)，清洗后浸泡于純化水中；
(2)凍融溶脹：角膜用水浸泡，然后冷凍；取出、待完全解凍后用純化水沖洗，然后浸泡；重復該冷凍解凍過程多次，得到吸水膨脹的角膜；
(3)病毒滅活：采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡角膜進行病毒滅活；
(4)清洗過程：分別用pbs溶液和純化水在超聲裝置中處理角膜；
(5)免疫原去除：免疫原去除液為含有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，免疫原去除過程在多頻超聲裝置中進行，其中多頻超聲裝置能夠提供至少兩個超聲頻率；
(6)清洗過程：分別用pbs溶液和純化水在超聲裝置中處理角膜；
(7)重復步驟(5)和(6)多次，然后將角膜浸泡在純化水中；
(8)切削取材：在解剖鏡下使用角膜板層刀，切取角膜前彈力層和部分基質，然后將其浸泡于純化水中；
(9)烘干干燥：將角膜平展在支撐件表面，放置在烘箱中進行干燥。
步驟(3)所述的過氧乙酸-乙醇溶液中過氧乙酸的濃度(體積百分比)為0.1-5％、乙醇的濃度(體積百分比)為5-40％，過氧乙酸-乙醇溶液與角膜的比例(體積比)為(30-60)︰1，滅活時間2-4小時，溫度范圍為10-40℃。
所述步驟(4)中清洗液為ph6-8的pbs溶液，pbs溶液溫度為10-40℃，pbs溶液與角膜的比例(體積比)為(30-60)︰1，清洗2-4次，每次10-30min，然后采用10-40℃的注射用水即純化水清洗，純化水與角膜比例(體積比)為(30-60)︰1，至檢測電導率為10μs/cm以下終止；清洗過程在超聲波清洗機中進行。
所述步驟(5)中的免疫源去除液包括：溶解有胰蛋白酶和edta的ph值為6-8的pbs溶液；所述免疫源去除液中胰蛋白酶質量百分比濃度為0.01-0.2％，edta的濃度0.1-1mmol/l；進一步的：免疫源去除液中胰蛋白酶的質量百分比濃度為0.02-0.05％，edta的濃度為0.4-0.8mmol/l，免疫源去除液ph值為7.0-8.0，優選為7.2-7.5；所述免疫源去除液與角膜體積比為(30-60)︰1；多頻超聲至少包括兩個超聲頻率，低頻頻率范圍為20-40khz，高頻頻率為60-90khz，其中低頻處理5-40min，高頻處理5-40min，溫度范圍為20-35℃。
所述步驟(6)中清洗液為ph6-8的pbs溶液，pbs溶液溫度為10-40℃，pbs溶液與角膜的比例(體積比)為(30-60)︰1，清洗2-4次，每次10-30min，然后采用10-40℃的注射用水清洗，注射用水與角膜比例(體積比)為(30-60)︰1，檢測清洗注射用水與未清洗注射用水電導率之差小于1μs/cm終止。
所述步驟(9)烘干干燥在熱循環烘箱中進行：先將烘箱預熱至25-40℃后，然后將步驟(8)所得的材料放于烘箱中干燥，通過熱循環風將水分風干，時間12-24小時。
上述制備方法還包括步驟(10)包裝和步驟(11)滅菌解析，包裝步驟具體為：烘干材料采用特衛強包裝紙與吸塑盒封裝；滅菌解析步驟具體為：先溫度20-40℃保溫時間2-4小時，濕度30-70％，然后通入濃度300-1000mg/l環氧乙烷，滅菌4-8小時；然后解析，解析過程在通風的解析室中進行，溫度控制在10-30℃之間，時間14-28d。
本發明進一步提供上述角膜基質在眼科植入物中的應用，該眼科植入物適用于病變角膜的覆蓋，尤其適用于用藥無效的尚未穿孔角膜潰瘍、需要板層移植治療的感染性角膜炎患者，以及角膜穿孔的臨時性覆蓋。首先使用角膜環鉆和角膜板層刀將患者病變角膜部位切除干凈，剖切深度符合病變深度，保留患者部分角膜基質和后彈力層，徹底清除創面異物，避免燒灼止血，生理鹽水沖洗干凈。然后打開本發明的外包裝，取出內包裝袋并剪開，無菌條件下取出內包裝盒，向內包裝盒中注入無菌生理鹽水，使本發明產品復水10-15min，再將本發明產品的凸面(前彈力層面)向上，平整置于創面上縫合固定。手術方法、用藥和術后護理與常規板層角膜移植手術相同，術后可使用角膜上皮保護藥物。
與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和有益效果：
(1)通過低溫冷凍，角膜中的細胞會在冰晶的作用下裂解破碎，于此同時，由于水轉化成冰，體積膨脹，會增加角膜基質板層間距，解凍角膜時，冰轉化成水，體積減小，會從外部吸收水分，從而實現角膜溶脹，厚度增加；
(2通過凍融溶脹增加角膜基質層間距，更有利于免疫原去除，有利于遺傳物質的清洗；
(3)采用胰蛋白酶和edta，使細胞與細胞外基質之間的連接被破壞；采用低頻超聲對細胞進行破碎，同時使用高頻超聲作用于破碎的細胞及細胞外基質，進一步使細胞脫離細胞外基質，達到脫細胞目的。采用上述方式，對整個細胞脫離基質過程中的各個步驟進行強化，使細胞被從基質上完全脫離。到達最佳的免疫原去除效果；酶法細胞洗脫工藝：采用胰蛋白酶和edta復合溶液，脫除細胞的過程溫和，減少對基質結構的破壞，保留基質中的活性生長因子；
(4)高濃度免疫原去除溶液與純水交替，利用溶液高低濃度的擴散作用，在角膜基質板層間形成沖刷效應，提高遺傳物質清洗效率；通過風干的角膜，可以縮小角膜基質板層間距，可以消除角膜在凍融過程中對角膜板層的微觀結構的影響，減小角膜厚度，使基質組織更密實，提高了角膜的抗拉強度；
(5)風干后的角膜是平面透明片狀薄膜，避免了角膜在自由條件下風干所產生的褶皺和收縮，此種方法制得的角膜，具有一定的內應力，在復水的過程中可以快速的吸收水分，迅速恢復彈性；
(6)本發明角膜基質可用于板層角膜移植。
附圖說明
圖1所示的是本發明實施例角膜基質前彈力層的正面sem照片；
圖2所示的是本發明實施例角膜基質除去前彈力層的正面sem照片；
圖3所示的是本發明實施例角膜基質的側面sem照片；
圖4所示的是本發明實施例角膜基質的前彈力層與側面sem照片；
圖5所示的是本發明實施例角膜基質橫截面的結構示意圖。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步具體描述，但不局限于此。
本發明所述豬眼角膜或牛眼角膜均適用于本發明的實施例。
實施例1：
本實施例一種角膜基質的制備方法，包括以下操作步驟：
(1)原料處理：
取死亡4小時以內豬或牛的眼球，用生理鹽水將血水沖洗干凈，使用直徑8.5mm環鉆鉆取角膜，純化水沖洗干凈后純化水浸泡。
(2)凍融溶脹：
角膜用少量水浸泡，置于-40℃冰柜中冷凍1小時，取出待完全解凍以后用純化水沖洗15min，然后充足的純化水浸泡30min，重復該冷凍解凍過程3次，得到吸水膨脹的角膜。
(3)病毒滅活：
采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡角膜進行病毒滅活，該過程可在不銹鋼桶中進行。過氧乙酸-乙醇溶液中過氧乙酸的濃度(體積百分比)為1％、乙醇的濃度(體積百分比)為24％，過氧乙酸-乙醇溶液與角膜的比例(體積比)為40︰1，滅活時間2小時，溫度為20℃。
(4)清洗過程：
采用清洗液清洗角膜，清洗液為ph7的pbs溶液，pbs溶液溫度為20℃，pbs溶液與角膜的比例(體積比)為40︰1，清洗3次，每次20min，然后采用純化水清洗，純化水與角膜比例(體積比)為40︰1，至檢測電導率為10μs/cm以下終止；清洗過程在超聲波清洗機中進行。
(5)免疫原去除：
免疫原去除液為包含質量百分比濃度為2％胰蛋白酶和質量百分比濃度為0.3％的edta的ph值為7的pbs溶液，免疫原去除液與角膜混合比例(體積比)為40︰1，免疫原去除過程在超聲波清洗機中進行，多頻超聲包括至少兩個超聲頻率，低頻頻率為30khz，高頻頻率為70khz，其中低頻處理8min，高頻處理12min，溫度為20℃。
(6)清洗過程：
采用清洗液進行清洗，清洗過程在超聲波清洗機中進行，超聲波的功率為3000w以下。清洗液為ph＝7的pbs溶液，pbs溶液溫度為20℃，pbs溶液與角膜的比例(體積比)為40︰1，清洗3次，每次20min，然后采用20℃的注射用水清洗，注射用水與角膜體積比為40︰1，檢測清洗注射用水與未清洗注射用水電導率之差小于1μs/cm終止。
(7)重復步驟(5)、(6)6次，使角膜外溶液濃度反復變化，溶液滲透方向變化，形成沖刷效應，反復清洗角膜中的遺傳物質，直至將角膜上遺傳物質清除干凈，然后將角膜浸泡在注射水中。
(8)切削取材：
在解剖鏡下使用角膜板層刀，切取角膜前彈力層和部分基質，厚度為2mm，然后將其浸泡于注射水中。
(9)烘干干燥：
在熱循環百級烘箱中進行，將烘箱預熱至37℃后，將步驟(8)所得材料放于烘箱干燥，通過熱循環風將水分風干，風干時間為24小時。風干過程中，需將角膜平展在不銹鋼托盤表面，使其風干后可保持平展狀態，否則會在風干過程中收縮成不規則狀態，甚至出現褶皺變形，影響產品品質。
本實施方式的制備方法可還包括：
(10)包裝：
烘干材料采用特衛強包裝紙與吸塑盒封裝。
(11)滅菌解析：
采用環氧乙烷進行滅菌，滅菌條件為：先溫度40℃保溫4小時，濕度70％，然后通入濃度500mg/l環氧乙烷，滅菌6小時；解析過程在通風的解析室中進行，溫度控制在20℃之間，時間14天。
最終獲得的樣品角膜，橫截面的結構示意圖如附圖5所示，包括下層的基質層和位于上部的前彈力層；本發明的角膜可以通過將浸泡后的角膜放置于不銹鋼篩網等濾水裝置上，濾水5分鐘以上之后，用稱量器具量取。
實施例2：
通過掃描電子顯微鏡對實施例1中樣品進行觀察，如附圖1和4所示，可以觀察到經過免疫原去除處理后，免疫原去除角膜的前彈力層完好，沒有受到酶溶液的影響及破壞，有利于角膜上皮細胞的移行、黏附和增殖，有利于角膜快速、完整的上皮化，避免感染。上皮能正常生長覆蓋在角膜基質表面，就可以有效隔絕各種水解酶對其膠原成分的降解，延長降解時間，利于角膜基質的改建。
除去前彈力層后如附圖2和3所示，可以看到角膜內部呈現三維網絡結構，三維網絡結構形成生物支架，有利于病人角膜細胞的長入，增加了細胞的附著數量，有利于營養物質的交換，利于免疫原去除角膜基質的改建。
從附圖3和4的側面sem電鏡照片可以看到，前彈力層的層狀膜結構完整，角膜基質內部呈層狀結構，可見膠原板層間空隙，空隙大小為20-150μm。
實施例3：
對本發明制備方法所得樣品進行物理性能檢測，具體如下：
a.縫合抗拉強度：按照實施例1制備5個樣品，用3-0非吸收縫合線在修補片一端邊緣2毫米處，將縫合線與修補片的另一端固定在拉力儀上，以20mm/min的速度進行拉伸，直到縫合點被撕裂，記錄最大力值，結果顯示，最大值平均值可達3.2n。
b.透光率：按照實施例1制備5個樣品，分別測風干樣品、溶脹樣品、甘油脫水樣品的透光率。風干樣品制備：將溶脹的樣品直接貼比色皿透光一側的內壁，送入鼓風烘箱中風干24小時；溶脹樣品制備：將溶脹的樣品直接貼比色皿透光一側的內壁；甘油脫水樣品：將溶脹的樣品置于甘油中脫水12-48小時，然后取出樣品，清理干凈樣品表面的甘油，將樣品直接貼比色皿透光一側的內壁。測試時，將樣品一側放于右邊，分別測800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm的透光率，記下讀數，計算平均值。風干樣品透光率平均值為86.6％，溶脹樣品透光率平均值為39.05％，甘油脫水樣品透光率平均值為80.0％；
c.膨脹率：按照實施例1制備5個樣品，將角膜平鋪在平板上，上蓋載玻片，置于40℃溫度鼓風干燥箱中風干24-48小時，取出樣品，用手術刀切割成規則長方體，用游標卡尺測量樣品的長寬高，記下讀數，再將樣品浸泡在水中24小時吸水溶脹，用游標卡尺測出溶脹后的長寬高，記下讀數，分別計算溶脹前后的體積v1、v2，計算膨脹率為：
d.含水率：按照實施例1制備樣品，將角膜平鋪在平板上，上蓋載玻片，置于40℃溫度鼓風干燥箱中風干24小時，取出樣品，稱干重w1。再將樣品浸泡在水中24小時吸水溶脹，稱濕重w2，計算含水率：
e.降解性能：每個直徑為8.5mm、厚度為0.15mm的角膜基質樣品，用1ml質量百分比為0.03％的蛋白酶k溶液浸泡，56℃水浴，每隔10min對角膜進行稱重，計算角膜剩余質量。測試結果為表1所示：
表1實施例樣品降解性能
實施例4：
對本發明制備方法所得樣品進行性能檢測，具體如下：
a.酸堿度：按照實施例1制備樣品，依據gb/t14233.1-2008中5.4.1規定的方法進行，樣品檢驗液與空白對照液的ph值之差應不超過1；
b.重金屬含量：按照實施例1制備樣品，鉛、鉻按gb/t14233.1-2008中5.9.1規定的原子吸收分光光度計法試驗，汞、砷按gb/t14233.1-2008中5.9.3規定的原子熒光光譜法試驗，檢測結果顯示，重金屬含量低于0.1μg/g。
c.熾灼殘渣：按照實施例1制備樣品，按照《中華人民共和國藥典》(2015年版四部)0841規定的方法測定，熾灼殘渣為1.0％。
d.細菌內毒素測定：按照實施例1制備樣品，按gb/t14233.2-2005規定的方法進行操作，結果顯示細菌內毒素小于2eu/g。
e.細胞殘留檢查：取3個產品分別進行he染色，每個切片選3個視野，在400倍光學顯微鏡下觀察完整細胞數量除以3，結果顯示，平均每個視野完整細胞數量為0。
f.dna殘留量：按照實施例1制備樣品，依據生物制劑殘留dna檢測方法(《中國藥典》2010，附錄ix-b外源性dna殘留量測定法)，采用熒光染色法檢測實施例1所提供的樣品的dna殘留量。結果顯示，樣品中的dna殘留量小于4.56±0.01ng/mg。
g.半乳糖苷酶(α-gal)清除率：取動物源性生物材料gal陽性參考品，gal抗原陰性參考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的gal標準曲線樣品，測試免疫原去除前后的測試品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液與m86抗體反應后的上清液，加入96孔板，加二抗，加顯色劑，采用elisa方法450nm檢測吸光度值，按標準曲線計算出樣品的gal值，免疫原去除處理前材料的gal值為25.69±2.72×1014/mg，實施例1中樣品的gal值為0.12±0.01×1014/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.52％以上。
h.膠原蛋白亞型鑒別：采用免疫組化染色法檢測i型和iv型膠原蛋白，3μm厚連續切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。將切片移入電飯煲水浴中(內含0.01mol/l，ph6.0的枸櫞酸三鈉緩沖液)，溫度保持在95-100℃，煮20min，進行抗原修復，取出后在室溫下自然冷卻。磷酸鹽緩沖液(pbs)洗滌，5min×3次。二步法免疫組化：分別滴加i型和iv型膠原蛋白單克隆抗體一抗，濃度1：100，4℃冰箱過夜室溫下孵育60min，pbs洗滌3次。滴加envision反應液，室溫下孵育30min。pbs洗滌3次。0.05％的3，3一二氨基聯苯胺+0.03％的h2o2顯色5-10min。流水洗，蘇木精襯染。遞增梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規樹脂封固。結果表明，顯微鏡下觀察四種染色標本皆可見棕黃染色，為陽性，表明樣品中可檢測到i和iv型膠原蛋白。
i.糖胺聚糖含量檢測：取10個樣品，取樣，浸提，用biocolor硫酸軟骨素、硫酸角質素檢測試劑盒測試硫酸軟骨素和硫酸角質素含量，樣品中硫酸軟骨素含量平均值為573±83μg/g；硫酸角骨素含量平均值為132±13μg/g。
實施例5：
對本發明制備方法所得樣品進行生物學檢測，檢測項目包括：熱原、細胞毒性、遲發型超敏反應、皮內反應、急性全身毒性、ames試驗、小鼠淋巴瘤細胞突變試驗、染色體畸變、植入、亞慢性毒性。
1)熱原
按6cm2樣品加1ml浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水。按gb/t14233.2-2005規定的方法進行，產品無熱原反應。
2)細胞毒性
按6cm2樣品加1ml浸提介質的比例，37±1℃，24±2hr制備試驗液，浸提介質：含血清的mem培養基。取試驗液按照gb/t16886.5-2003中規定的試驗方法進行試驗，結果產品的細胞毒性反應不大于1級。
3)遲發型超敏反應
按6cm2樣品加1ml浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分：刺激與遲發型超敏反應試驗方法規定進行試驗，結果產品無遲發型超敏反應。
4)皮內反應
按6cm2樣品加1ml浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分：刺激與遲發型超敏反應試驗試驗方法規定進行試驗，結果：試驗樣品與溶劑對照平均記分之差小于1.0。
5)急性全身毒性
按6cm2樣品加1ml浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和棉籽油。取試驗液按照gb/t16886.11-2011規定的試驗方法進行試驗，結果：產品無急性全身毒性反應。
6)ames試驗
按6cm2樣品加1ml浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和dmso。按gb/t16886.3-2008規定的方法進行，結果：產品的ames試驗為陰性。
7)小鼠淋巴瘤細胞突變試驗
按6cm2樣品加1ml浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和dmso。按gb/t16886.3-2008規定的方法進行，結果：產品的小鼠淋巴瘤細胞突變試驗為陰性結果。
8)染色體畸變試驗
按6cm2樣品加1ml浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和dmso，按gb/t16886.3-2008規定的方法進行，結果：產品的染色體畸變試驗為陰性。
9)植入
按gb/t16886.6-1997規定的方法進行，結果：肌肉植入1周：樣品周圍可見嗜中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，應無囊腔形成；肌肉植入4周：樣品周圍可見少量巨噬細胞和淋巴細胞，膠原纖維和纖維母細胞增生，有纖維囊腔形成；肌肉植入12周：樣品周圍可見少量淋巴細胞、膠原纖維、纖維囊腔較致密規整。
10)亞慢性毒性
按gb/t16886.11規定的方法進行，結果：對材料亞慢毒性進行評價，無亞慢性毒性反應。
實施例6：
對本發明制備方法所得樣品進行動物實驗，具體如下：
將實施例1中樣品用1：4000慶大霉素生理鹽水清洗角膜15min復水，用環鉆制直徑7mm角膜移植片。家兔12只，體重1-2kg，左眼行手術，右眼空白對照。1％異戊巴比妥鈉按30mg/kg體重腹腔注射，0.5％卡因表面麻醉，2％奴佛卡因1ml球后注射，并按摩眼球，降低眼壓，術前30min滴加1％新福林、1％阿托品和托品酰胺滴眼，使瞳孔充分散大。常規消毒鋪布，剪去眼周睫毛，作四條直肌索引縫線，暴露和固定眼球，用6.5環鉆置于角膜中央，向下輕壓旋轉，當有房水流出時停止，用角膜剪完成未鉆穿的角膜，之后將復水后的實施例1中角膜移植于缺損處，用9/0尼龍線作四點間斷固定，再作連續縫合固定。術后每日檢查滴加0.4％慶大霉素、0.5％考地松及1％阿托品液。12只動物植入片，1周內透明3只，2周內透明5只，1只死亡，3周透明3只。11只動物中有3只透明時間43天、56天、58天，其余8只透明時間在90天以上。眼角膜保持透明，角膜無水腫、無感染，角膜無新生血管。取材測量移植角膜厚度為330±20μm，正常角膜厚度為304±11μm，兩者無統計學差異。術眼眼壓為11±1mmhg，正常眼壓為10±1mmhg，兩者無統計學差異。
綜上可見，本發明一種角膜基質及的制備方法，具有如下優勢：
(1)保留角膜細胞外基質中膠原蛋白纖維的三維空間網絡結構；
(2)保留角膜細胞外基質中活性生長因子；
(3)通過低溫冷凍，角膜中的細胞會在冰晶的作用下裂解破碎，于此同時，由于水轉化成冰，體積膨脹，會增加角膜基質板層間距，解凍角膜時，冰轉化成水，體積減小，會從外部吸收水分，從而實現角膜溶脹，厚度增加；
(4)增加角膜基質層間距，更有利于免疫原去除，有利于遺傳物質的清洗；
(5)高濃度免疫原去除溶液與純水交替，利用溶液高低濃度的擴散作用，在角膜基質板層間形成沖刷效應，提高遺傳物質清洗效率；
(6)dna殘留能夠達到10ng/mg以下，半乳糖苷酶去除率較高，能夠達到99％以上；
成型部分：
(1)通過風干的角膜，可以縮小角膜基質板層間距，可以消除角膜在凍融過程中對角膜板層的微觀結構的影響，減小角膜厚度，使基質組織更密實，提高了角膜的抗拉強度；
(2)風干后的角膜是平面透明片狀薄膜，避免了角膜在自由條件下風干所產生的褶皺和收縮，此種方法值得的角膜，具有一定的內應力，在復水的過程中可以快速的吸收水分，迅速恢復彈性；
滅菌工藝：
通過控制滅菌工藝，能夠有效的使環氧乙烷氣體滲透進角膜內部，達到滅菌效果。
本發明的上述實施例是對本發明的說明而不能用于限制本發明，與本發明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。
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