一種基于乳鐵蛋白活性的新型生物材料的制備方法與流程

本發明涉及一種生物材料，具體是一種基于乳鐵蛋白活性的新型生物材料的制備方法。

背景技術：

隨著現代社會人口老齡化問題的加劇，骨創傷、骨腫瘤以及其它骨骼疾病的發病率居高不下，直接導致了大量的骨折和骨缺損患者。據統計，我國每年骨缺損患者超過500萬人，其中因骨質疏松引起的脊柱和四肢骨骼等的骨折患者人數在200萬人以上，因骨腫瘤切除、人工關節周圍骨溶解、脊柱融合等需進行骨移植手術的患者約40萬例，而這些患者大多面臨著植骨治療。

目前，傳統植骨治療手段主要包括自體骨移植和異體骨移植。自體骨移植一直稱為行業的“金標準”，但其來源有限，供體骨形狀和結構不合適，又會對患者造成二次創傷，使用受到一定限制。而異體骨移植也存在免疫排斥反應以及攜帶疾病的可能，直接影響植骨治療的效果。因此研究開發生物相容性好生物性能接近自體骨組織，無免疫排斥反應的人造骨組織一直是再生醫學領域研究和探索的熱點。而隨著醫學工程的發展，骨組織工程的出現逐漸引起了廣泛的關注。其主要原理是將種子細胞種植于復合了細胞因子的支架材料上，形成三維復合體，植入骨缺損部位，在生物材料逐步降解的同時，種植的骨細胞不斷增殖，并分泌細胞外基質，逐漸完成自體骨替代植入骨的過程，最后達到修復骨缺損的目的。因此，支架材料、種子細胞和生長因子是骨組織工程的重要組成部分。

2、國內外在該領域的研究現狀

羥基磷灰石（hap）作為骨組織的重要組成成分，是目前公認的最具潛力的骨組織替代材料，但單一的羥基磷灰石機械性差，作為骨替代材料的可靠性差。納米技術的應用使羥基磷灰石在生物、化學、力學等方面都有了顯著變化。人體骨組織中的羥基磷灰石主要是納米針狀單晶體結構，沿一定的方位分布在膠原組織中。因此，根據天然骨組織的形成機制，采用仿生的方法制備的成分、結構與天然骨相似的hap/col類骨修復材料既具有良好的力學性能，也可以作為骨生長因子的良好載體。

骨組織是一種受損后仍能恢復的組織，新骨的形成主要包括破骨細胞的再吸收和成骨細胞分泌類骨質基質及礦化等過程。關于hap/col的成骨機理，hayashik等提出植入體內的hap材料在缺損處為修復早期的微血管形成及宿主內骨系細胞的附著提供支撐，hap晶體的刺激使骨細胞活躍而圍繞hap顆粒并以其為中心形成成骨區，即多中心成骨，在骨鹽沉積過程中由hap提供晶核以加速鈣化成骨。weinleanderm等提出了hap與骨質可進行離子交換，hap表面的負電荷可選擇性地使鈣、磷離子在其表面沉積，從而刺激新骨的生長。hap降解產生的鈣及磷酸根離子可被周圍新生骨組織利用，刺激和促進更多新骨生成。而col不僅可以誘導礦物沉積，還可誘導組織產生趨化因子，促進細胞生長和骨修復。膠原纖維中的纖維蛋白在凝血酶的作用下可聚合成可塑性良好的纖維蛋白凝膠，以彌補hap在可塑性上的缺陷。

張興棟等在實驗研究的基礎上提出了鈣磷陶瓷誘導骨發生的機制假說，羥基磷灰石骨誘導的步驟如下：鈣磷陶瓷植入機體非骨部位，吸附bmps等內源性骨生長因子，誘使間充質細胞向材料內趨化和遷移。骨生長因子作用于間充質細胞相應受體，經細胞信號轉導系統，引起級聯放大效應和相關基因表達，并使間充質干細胞分化為骨母細胞，分泌骨粘連素等骨細胞間特異性的粘連分子。骨母細胞將具有類似自然骨特定化學組成和三維多孔結構的陶瓷錯位識別為自然骨，停泊、黏附于其內表面，進而骨母細胞自分泌bmp等生長因子引起自身及相應細胞分化、增殖、成熟為骨。

因而，生長因子是骨組織的發育、維持、再生等過程中的重要調節物質。目前在骨組織工程中應用較多的骨生長因子有骨形態發生蛋白（bmp）、胰島素樣生長因子（igf）、表皮細胞生長因子（egf）、成纖維細胞生長因子（fgf）、轉化生長因子-β（tgf-β）、血管內皮生長因子（vegf）等。但這幾種骨生長因子現階段主要還是通過基因工程學和分子生物學等技術手段獲得，不但其生產設備繁復，而且其制備工藝也相當復雜，因此造成其制作成本高，價格昂貴，難以大規模生產，限制了其在實驗及臨床中的廣泛應用。

而lf是一種80kda左右的鐵結合糖蛋白，廣泛分布于哺乳動物乳汁和其他多種組織及其分泌液中，人乳中lf濃度約為1.0～3.2mg/ml，其含量僅次于酪蛋白，占普通母乳總蛋白的20%，易于獲取。并且有研究表明，lf對成骨細胞的增值有良好的促進作用，且該作用呈劑量依賴關系。另外已有報道lf對體外骨細胞的影響和作用機制以及局部注射lf對骨細胞的影響和作用機制，這些研究確定了lf是一種新型的骨生長因子，它對成骨細胞和破骨細胞的總作用效果是增加了骨含量，即促進了骨形成又抑制了骨吸收。

grey等人也研究報道了lf對于鼠前體成骨細胞dna的合成具有促進作用，說明lf對于成骨樣細胞的有絲分裂具有促進作用。使用mapk抑制劑對鼠成骨樣前體細胞進行預處理后，發現對lf誘導的成骨細胞有絲分裂受到了抑制作用，說明lf是通過調控mapk信號轉導通路，從而促進成骨細胞增殖與分化的，并且能夠顯著地抑制成骨細胞的凋亡。lf可以減少由于依托皂苷所導致的成骨細胞凋亡率達60%。對鼠骨髓的培養發現lf可呈劑量依賴地抑制破骨細胞的生成，而且當lf濃度為100μg/ml時作用最大，可以完全地抑制破骨細胞的生成。因此大量實驗研究表明，lf不僅具有抗菌、抗炎、調控骨再生預防骨質流失等多種生物活性，還可促進成骨細胞增殖抑制成骨細胞凋亡，從而可作為一種新型的骨生長因子應用于骨組織工程。

在生物材料領域，蛋白質的吸附是植入材料與組織相互作用的第一步，所以蛋白質與生物材料的相互作用是骨組織工程的設計關鍵。羥基磷灰石作為骨修復材料植入體內時，其表面吸附的生長因子對骨重建具有至關重要的作用。本發明從hap/col與lf的相互作用機制入手，將來源較廣的lf負載于hap/col植入材料上，實現骨生長因子的緩慢釋放，從而提高hap/col復合材料的成骨活性，獲得一種具有較高生物活性的新型骨組織工程復合材料。

目前已知的骨生長因子主要有：包括bmp在內的轉化生長因子家族（tgfs）、成纖維細胞生長因子（fgf）、血小板衍生生長因子（pdgf）、血管內皮生長因子（vegf）、胰島素樣生長因子（igf）等。但這些內源性的骨生長因子主要通過兩種方法獲得，一種是從體液或血液等組織分離提取，但生長因子在體內的屬于微量多肽或蛋白，提取困難。另一種是通過基因工程學和分子生物學等技術手段獲得，不但其生產設備繁復，而且其制備工藝也相當復雜，因此造成其制作成本高，價格昂貴，難以大規模生產，限制了其在實驗及臨床中的廣泛應用。并且骨生長因子的半衰期較短，容易在體內降解和被體液稀釋，達不到理想的效應濃度，但如果采用首次大劑量給藥，容易導致局部毒性和血管瘤樣病變，也限制了其應用范圍。

技術實現要素：

本發明是一種基于乳鐵蛋白活性的新型復合生物材料的制備方法，該產品具有良好的生物相容性，與常規材料相比具有更高的成骨活性。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種基于乳鐵蛋白活性的新型生物材料的制備方法，其特征在于，步驟如下：

將hap/col粉末加入乳鐵蛋白溶液中，hap/col粉末的加入量為乳鐵蛋白質量的的0.2%～1%，30～40℃反應5～30h，過濾離心，取上清液，并用超純水對復合物粉末沖洗去除雜質，采用冷凍干燥的方式對得到的hap-lf復合材料進行干燥處理。

進一步地，羥基磷灰石/膠原粉末的制備方法：取80～120ml膠原蛋白溶液，逐滴加入1～2mol/l的ca(no3)2攪拌10～30min后滴加0.5～1mol/l的(nh4)2hpo4溶液，控制反應溫度10℃以下，繼續攪拌30～90min，以0.5～1mol/l氫氧化鈉滴定溶液ph至6～8，同時收集白色沉淀，蒸餾水反復洗滌沉淀，凍干后制得羥基磷灰石/膠原粉末，其中，滴加的ca(no3)2和(nh4)2hpo4的體積比為=1:1。

進一步地，所述的膠原蛋白溶液為：將膠原溶于0.04～0.06mol/l的醋酸溶液中，制備0.5～1%酸性膠原溶液，低溫下添加na2hpo4·12h2o使終濃度為0.01～0.03mol/l，用2～3mol/l的naoh溶液調ph至中性備用。

進一步地，所述乳鐵蛋白溶液的制備方法為：將乳鐵蛋白粉末溶于ph為4～8的磷酸鹽緩沖溶液中，使終濃度為0.2～5mg/ml，經過充分攪拌溶解之后，將溶液通過0.1～0.45μm孔徑的膜，收集透過液備用。

本發明的有益效果為：（1）將具有成骨活性的乳鐵蛋白作為一種新型的骨生長因子應用于骨組織工程領域，解決了目前各種骨生長因子獲取較難，價格昂貴的問題。（2）利用乳鐵蛋白與羥基磷灰石/膠原蛋白復合材料之間的相互作用，實現了乳鐵蛋白的緩慢釋放，解決了負載生長因子半衰期短的問題。（3）一定程度得提高了羥基磷灰石/膠原蛋白植入材料的促成骨活性，解決了單一生物材料生物活性較低的問題。

說明書附圖

圖1本發明的工藝流程圖。

圖2水熱法合成hap掃描電鏡圖。

圖3羥基磷灰石氮氣吸附脫附曲線（a）圖。

圖4bjh孔徑分布(b)圖。

圖5hap/col對lf的吸附曲線。

圖6兩種hap/col結合lf后的tg-dtg曲線；（a）hap/col,(b)hap/col-lf,(c)lf。

圖7hap,hap-lf以及lf的紅外表征圖。

圖85hap/col-lf復合物在pbs中的釋放率。

圖9hap-lf不同時間點對成骨細胞活力的影響對比圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步解釋說明。

（1）羥基磷灰石的合成：采用caco3和cahpo4·2h2o的混合物為前驅物，通過水熱合成得到晶粒完整、分散性好、端面粒度在100nm以下的ha粉體。

（2）hap/col復合材料的制備：取80～120ml膠原蛋白溶液，逐滴加入1～2ml磷酸，攪拌10～30min后滴加0.02～0.04mol/l氯化鈣溶液，繼續攪拌30～90min，以0.5～1mol/l氫氧化鈉滴定溶液ph至6～8，同時收集白色沉淀，凍干后制得羥基磷灰石/膠原粉末。

（3）乳鐵蛋白溶液的配置：將乳鐵蛋白粉末溶于ph為4～8的磷酸鹽緩沖溶液(pbs)中，使終濃度為0.2～5mg/ml，經過充分攪拌溶解之后，將溶液通過0.1～0.45μm孔徑的膜，收集透過液備用。

（4）hap/col-lf復合物的制備：將hap/col粉末加入乳鐵蛋白溶液中，羥基磷灰石與乳鐵蛋白量的比為0.2%～1%，30～40℃，800～1200r/min反應5～30h。

（5）過濾離心：反應結束后，3000～10000r/min離心5分鐘，去上清，并用2ml超純水對復合物粉末沖洗1～5遍，以去除hap-lf復合物之外的其它雜質。

（6）產品干燥：采用冷凍干燥的方式對得到的hap-lf復合材料進行干燥處理。干燥后粉末中水分含量小于5%。

本發明所得到的hap-lf新型復合生物材料相關的研究方法如下：

（1）合成羥基磷灰石的掃描電鏡觀察

用吸耳球吹走待測的天然hap表面的灰塵，去離子水洗凈樣品后，放于恒溫干燥箱中干燥，待樣品徹底干燥后用導電膠將樣品貼于掃描電境的載物臺表面，再將載物臺放入掃描電鏡的真空腔內，調節鏡頭的位置和焦距，逐一對待測樣品進行檢測。

（2）合成羥基磷灰石的比表面積表征

采用全自動比表面孔徑分析儀asap2020對合成的羥基磷灰石的比表面積進行分析。樣品烘干后，取0.6g裝入樣品管進行預處理，預處理溫度為150℃。其次抽真空，抽氣真空值為500μmhg。而后進行吸附脫附分析，150℃反應6h，升溫速率為10℃/min。

（3）hap/col-lf復合物中lf裝載量的測定

根據反應前后溶液中蛋白含量的差來計算，溶液中蛋白濃度的測定采用bca法。按照說明書的具體方法，將反應前蛋白溶液的濃度記為c1，體積為v，反應后溶液中蛋白的濃度記為c2，沖洗掉蛋白的量為w1，羥基磷灰石的量為w2，則復合物中lf的裝載量w%為：

裝載量還可通過熱重分析的方法進行測定，反應前后hap/col與hap/col-lf質量下降之間的差值即為lf裝載于hap/col上的量。利用熱重分析儀對所制備的hap/col以及hap/col-lf的有機物及無機物的含量百分比及分解溫度進行分析。熱重分析測試是在流動的氮氣氣氛下進行，升溫速率為20℃/min，溫度范圍為20～800℃。

（4）hap/col-lf復合材料的紅外表征

將待測的天然羥基磷灰石試樣和溴化鉀在恒溫干燥箱中加熱100℃干燥數小時，然后將待測試樣和溴化鉀按照1:100的比例放入瑪瑙研缽，充分研磨，使兩者混合均勻。取適量研磨后的混合物倒入紅外專用壓片模具中，加壓28mpa，保持1分鐘后取出，混合物加入量以最終壓制的圓片為半透明狀為宜。將壓制的圓片狀樣品置于傅里葉變換紅外光譜儀上，采用透射法測定其紅外光譜，掃描時設定掃描間隔為4cm^-1，掃描次數為64次，掃描范圍從400cm^-1至4000cm^-1，掃描背景后對樣品進行掃描，并對所得譜圖進行校正，即得到樣品的紅外光譜圖。將待測試樣的紅外光譜圖及其具體數據與羥基磷灰石標準圖譜進行比較，確定待測試樣的成分。

（5）lf體外釋放率的測定

將hap/col-lf復合物置于ph7～8的pbs緩沖溶液中，每24h取500μl于離心管中，采用bca的方法測其中蛋白含量。

（6）hap/col-lf復合材料的成骨活性

采用mtt法分析hap/col-lf復合物對成骨細胞增殖活性的影響，具體實驗步驟如下：將成骨細胞消化計數，將細胞濃度調整為每孔l×10⁵個/ml，然后將細胞接種于96孔培養板。在培養48h后進行檢測。吸除培養液，用pbs反復清洗除去死細胞，每孔加入含有0.5%mtt的α-mem100μl，于37℃，5%co2培養箱中孵育4h；在下觀察出現黑色網狀物后終止孵育，棄去培養液；每孔加入150μldmso，振蕩10min后用酶聯免疫檢測儀在波長490nm處測定其吸光值，用od值表示。

實驗結果：

（1）合成羥基磷灰石的掃描電鏡觀察

對水熱法合成的羥基磷灰石試樣進行掃描電鏡觀察，結果如2所示。水熱合成的羥基磷灰石呈針狀，長在100-150nm之間，寬在20-30nm之間。

（2）合成羥基磷灰石的比表面積表征

水熱合成的羥基磷灰石的比表面積和孔徑分布分析如圖3和圖4所示。a和b為納米級羥基磷灰石的氮氣吸附-脫附曲線圖和孔徑分布圖。氮氣吸附-脫附的曲線不重合，有明顯的滯后環，屬于典型的ⅳ型吸附曲線，表明羥基磷灰石樣品具有介孔結構。由氮氣吸附-脫附曲線，經bet分析可知，合成的羥基磷灰石的比表面積為84.48m²/g。由b材料的孔徑分布圖可知，合成的羥基磷灰石中的孔主要分布在2-4nm和20-30nm之間。但根據合成的羥基磷灰石的形貌可以判斷出2-4nm左右的介孔屬于顆粒內孔而20-40nm左右的介孔可能是顆粒間孔。

（3）hap/col-lf復合物中lf的裝載量

由圖5可知，lf在hap/col上的吸附量逐漸趨向于一個極值，說明hap/col和lf之間存在著吸附平衡。在37℃條件下，hap/col對lf的飽和吸附量約為91.10μg.mg^-1。

hap/col-lf復合物的熱重分析如圖6所示。由圖6的tg曲線可知，hap/col材料失重5.2%，hap/col-lf失重17.844%。單一材料與復合蛋白后的材料最終重量變化之差即為材料上吸附蛋白的量。同時由圖6dtg曲線可知，在升溫過程中hap/col的質量變化在500℃以下都經歷了一個階段即200℃以下所發生的物理水的蒸發。而hap/col-lf的質量變化在500℃以下都經歷了兩個階段，即200℃以下所發生的物理水的蒸發和200-500℃時的材料表面蛋白的灰化。乳鐵蛋白的dtg曲線在200-500℃也有一個明顯的失重峰，且失重的溫度點與hap/col相吻合，可進一步證明經反復沖洗后的hap/col-lf材料表面仍有lf吸附。500℃以上時，hap/col與hap/col-lf的tg曲線趨于平行，且從dtg曲線也可發現，500℃之后hap/col與hap/col-lf失重溫度點相同且兩條線趨于相交證明所吸附蛋白完全從兩種hap/col上脫除。

（4）hap/col-lf復合材料的紅外表征

hap與hap-lf以及lf的紅外表征圖如圖7所示。(1)nano-hap，(2)nano-hap-lf，(3)lf。hap圖譜中出現了hap所有的特征峰，由hap的紅外圖譜可知，565cm^-1、603cm^-1處為po4^3-的彎曲振動峰，952cm^-1、1031cm^-1為po4^3-的伸縮振動峰，3425cm^-1處為-oh的伸縮振動峰。且對于hap-lf來說，在1530cm^-1附近均出現了一個c-h伸縮振動峰，而此峰也同樣出現在了lf中，所以進一步證實在經過充分洗滌后，lf仍穩定地吸附在hap表面。

（5）lf體外釋放率的測定

hap/col-lf復合物在pbs中的釋放規律如圖8所示，結果顯示，在0-7d的時間范圍內，hap/col對lf表現出了良好的緩釋作用，最大釋放量達到75%左右。

（6）hap/col-lf復合材料的成骨活性

采用mtt法考察hap-lf作用于成骨細胞24h、48h和72h后的影響，結果如圖9所示。圖9中：a，b，c，d表示不同水解時間產生的水解產物對成骨細胞作用的差異顯著性，相同字母代表差異不顯著（p＞0.05），不相同字母代表差異顯著（p＜0.05）。

從圖中可以看出，在復合物作用于成骨細胞48h和72h后，hap-lf組與單純的hap組相比能顯著地促進成骨細胞的增殖，并且作用效果最顯著。而hap組與空白對照組相比表現出了較差的生物相容性，但復合了lf后，其對成骨細胞的增殖有了顯著的提高。所以，lf復合于hap的表面，顯著提高了hap的生物活性。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。