一種華絨苞藤提取物的制備方法及應用

一種華絨苞藤提取物的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥領域，具體涉及一種云南特色植物華絨荀藤（(?/??? cAifleftsis) 提取物的制備方法及其在制備選擇性抗腫瘤治療藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是一類嚴重威脅人類健康的致死性疾病，其發病機制尚未完全闡明，治療效 果亦不盡人意。目前常規用于腫瘤治療的大部分藥物，均是針對細胞增殖過程中DNA復制 或細胞骨架的調控來設計的。這些藥物在對快速增殖的腫瘤細胞進行殺傷的同時，對人體 功能維持所需的正常增殖細胞(如骨髓干細胞等等）也有很大的毒性，導致接受治療的病人 機體正常功能嚴重受損，對于腫瘤的抵抗能力反而下降，難以取到很好的治療效果。因此， 利用分子靶向篩選技術，針對腫瘤細胞特異性基因突變產物，篩選可以抑制這些腫瘤特異 突變分子活性或表達水平的小分子化合物，從而開發形成低毒、高效的靶向個性化治療藥 物，已經成為腫瘤治療藥物研發的最新趨勢。已證實突變P53為抗腫瘤藥物的靶點，目前， 針對突變P53為靶點設計的抗腫瘤藥物研究已經進入臨床試驗。因此，開發具有自主知識 產權的低毒、高效的靶向個性化治療藥物，也成為國內腫瘤轉化醫學研究者的重要方向。
[0003] 正常情況下細胞內p53蛋白的含量很低，而突變p53在腫瘤細胞中通常有較高水 平的表達，從而成為區別于正常細胞的一個特異性抗腫瘤靶點。目前，針對突變P53的治療 方法主要是依靠在腫瘤細胞中重新激活野生型P53的表達或將突變p53恢復成野生型p53 的辦法，還有就是靶向突變p53使其降解的策略來靶向突變p53的治療，主要是多肽，小分 子化合物等，這些化合物都是國外根據P53的結構設計發現的，本發明主要是從云南省特 有的植物資源分離提取發現具有能激活野生型P53的化合物。將p53啟動子連接GFP報 告基因的檢測方法可通過檢測熒光的變化直觀的篩選出能作用于P53啟動子的化合物，特 別是將此系統運用到植物化合物的篩選報道很少。
[0004] 云南省是世界生物多樣性的熱點地區之一，各種生物種類占全國的50%以上，為 天然藥物的研究和開發提供了重要的物質基礎。同時云南26個民族在與疾病的長期斗爭 中積累了豐富的民族民間用藥經驗，為云南天然藥物研究提供了寶貴的傳統知識、藥物背 景信息和資料，也為我們開發和研究靶向治療腫瘤的天然藥用植物提供了豐富的來源。
[0005] 華絨荀藤（(???? 產自云南屏邊和西雙版納，常生長在海拔 700-1450米的溝谷林邊，主要作為觀賞植物。迄今為止，未見關于華絨苞藤提取物活性組分 有抗腫瘤活性的報道。

【發明內容】

[0006] 本發明為了拓展云南特色植物研究的新領域，充分利用我國植物資源，開發其新 用途，提供了一種華絨苞藤提取物的制備方法；通過以下步驟實現： (1)粉碎和浸提 將植物華絨苞藤粉碎后，用藥用級甲醇室溫浸提4-5天，抽濾，濾液濃縮，得甲醇浸提 物粗樣，用乙酸乙酯和水萃取分離，得到水層浸膏； (2)分離和純化 將水層浸膏經過非極性大孔樹脂柱色譜分離，溶劑系統為乙醇-水混合液，收集合并 乙醇：水體積比為8:2的洗脫部分，濃縮，得到華絨苞藤粗提物Fr-3組分，將粗提物Fr-3 組分用水溶解，甲醇沉淀，過濾，并用甲醇洗滌沉淀3次，沉淀經過ODS柱色譜分離，溶劑系 統為甲醇-水混合液，收集合并甲醇：水體積比為8:2的洗脫部分，濃縮，得到華絨苞藤提 取物。
[0007] 該提取物呈白色，無味，易溶于水，溶于二甲基亞砜，微溶于乙醇和甲醇，用TLC分 析時，以氯仿：甲醇=1:1為展開劑，在高為5cm正向Silica板上，其Rf值約為0. 5-0. 6,該 樣品在210nm波長下具有紫外吸收峰，華絨苞藤中的含量是0. 05%。。
[0008] 本發明的另一個目的是將上述提取物應用于制備抗腫瘤個性化治療藥物，制備對 正常細胞無毒性的藥物。
[0009] 本發明所述的提取物對野生型小鼠的胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF)無明顯的細胞毒性。
[0010] 本發明的有益效果在于： (1) 有機溶劑浸提、溶劑分配、開口色譜柱分離得到，制備方法具有簡單快速等優點； (2) 本發明利用轉基因小鼠細胞重組靶向基因構建P53啟動子-GFP分子報告載體靶向 篩選鑒定一種云南特色植物華絨苞藤提取物活性組分對P53基因的激活情況；研究數據表 明，該組分能夠明顯激活GFP熒光，具有潛在的抗腫瘤活性； (3) MEF作為對照細胞，這種正常對照細胞在藥物篩選體系中的應用可以排除因為細胞 毒性作用導致的細胞殺傷效應，篩選對腫瘤細胞有選擇性殺傷，而對正常細胞沒有毒性的 天然活性物質； (4) 細胞藥理學實驗證明，華絨苞藤提取物可以殺死大部分的腫瘤細胞，而對MEF細胞 毒性較小，說明其抗腫瘤作用具有良好的選擇性。
[0011] 本發明開拓了華絨苞藤提取物活性組分新的藥物用途，為腫瘤的個性化治療提供 新的低毒、高效的藥物。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明中陰性對照1% DMSO的微分干涉相差圖DIC (A圖)和GFP熒光圖（B 圖）； 圖2是加入實施例1華絨苞藤提取物活性組分經72小時處理后p53 / -p53-GFP MEF細 胞的微分干涉相差圖DIC (A圖）和GFP熒光圖（B圖）； 圖3是加入實施例1華絨苞藤提取物活性組分，經72小時處理后，A549細胞中p53蛋 白表達明顯增多； 圖4是本發明中陰性對照1% DMSO的微分干涉相差圖DIC (A圖)和GFP熒光圖（B圖)； 圖5是本發明實施例5中華絨苞藤提取物活性組分的微分干涉相差圖DIC (A圖）和 GFP熒光圖（B圖）； 圖6是本發明中實施例5華絨苞藤提取物活性組分能夠明顯增加 A549中p53蛋白的 表達結果。
【具體實施方式】
[0013] 下面通過對該活性組分制備實例的實施方式和附圖、附表再對本發明作進一步 詳細說明，但本發明的保護范圍不局限于所述內容，實施例中方法如無特殊說明均采用常 規方法，使用試劑如無特殊說明，均為常規市售試劑或采用常規方法配置的試劑。
[0014] 實施例1:華絨苞藤提取物活性組分的制備 2014年12月從云南省屏邊苗族自治縣采集云南華絨苞藤地上部分樣品lkg，植物種名 由云南省農業科學院藥用植物研究所研究員鑒定，生藥標本存放于云南省農業科學院藥用 植物研究所。
[0015] 從植物華絨苞藤中獲得具有顯著抗腫瘤活性的活性組分的制備方法，具體步驟 為： (1) 粉碎和浸提 將Ikg云南藥用植物華絨苞藤地上部分曬干粉碎后，用IOL甲醇(藥用級）室溫下浸提 5天(偶爾震蕩)，抽濾濾液濃縮后，再用乙酸乙酯（400ml)和水（400ml)萃取三次，將三次水 層萃取液合并后濃縮，得到水層浸膏備用； (2) 分離和純化 將水層浸膏經非極性大孔樹脂DlOl柱分離（以下溶劑系統均按體積比，乙醇：水 =0:100 ;40:60 ;80:20 ;100:0)，所需活性組分主要在乙醇：水=80 : 20的洗脫部分，合并 濃縮該部位，得到活性組分粗提取Fr-3(3. 2g)。將Fr-3組分用水（20mL)溶解，甲醇（50mL) 沉淀，過濾，并用甲醇洗滌沉淀3次，得沉淀Fr-3c (0. 137g)。Fr-3c經過ODS柱色譜分離， 溶劑系統為甲醇：水（〇:1〇〇,50:50,80:20，100:0)，收集合并甲醇 ：水=80:20的洗脫部分， 濃縮，得到華絨苞藤活性提取物（50mg)。
[0016] 經上述方法制備得的活性組分，呈白色，無味，易溶于水，溶于二甲基亞砜，微溶于 乙醇和甲醇，用TLC分析時，以氯仿：甲醇=1:1為展開劑，在高為5cm正向Silica板上，其 Rf值約為〇. 5-0. 6,該樣品在210nm波長下具有顯著的紫外吸收峰，華絨苞藤中的含量是 0· 05%0〇
[0017] 實施例2:實施例1華絨苞藤提取物活性組分激活p53 / -p53-GFP MEF細胞中GFP 熒光實驗，具體實驗操作如下： (1) P53-GFP-報告載體的構建，具體方法如下： 1) 采用BgLII及NotI雙酶切將綠色熒光蛋白GFP報告基因從pAcGFPl-Nl質粒(購 買于Clontech)上切下，替換掉pGL4. 82 (購買于Promega)中Luciferase報告基因，制得 pGL4 -GFP 載體； 2) 設計 p53 基因啟動子區引物（5'TGGCTCGAGGTCTTTACAGAGAGTG3'， 5' CGAGATCTCGGAGAAGCGTGACA 3'）擴增啟動子序列并連入pGL4 -GFP載體，這樣就得到以 P53基因啟動子與GFP融合的報告載體-----P53-GFP-報告載體； (2) 將p53基因啟動子與GFP融合的報告載體轉入小鼠成纖維細胞（MEF)中，具體方法 如下： 1)通過TIANGEN BIOTECH質粒大提試劑盒提取質粒得到pGL4. 82-p53promoter-GFP質 粒，并測定其濃度； 2)培養p53 /的小鼠 MEF細胞，常規條件下培養即DMEM培養基與10%FBS (胎牛血 清)，轉染前按每皿2 X IO6個（IOcm)-天傳代，第二天在細胞匯合率到達90%時用脂質體轉 染試劑Lipofectamine?2000 (購買于Invitrogen)進行轉染，具體內容如下： A、 將24 μ g pGL4. 82-p53promoter_GFP質粒加入到3mL無胎牛血清的DMEM培養基中， 得到A混合液； B、 將60 μ L Lipofectamine2000加入3mL無血清的DMEM培養基，室溫下放置20分鐘， 得到B混合液； C、 將A液與B液混合，配成24 μ g質粒：60 μ L Lipofectamine2000混合液，輕柔混勾 后，室溫下放置20分鐘，得到C混合液； D、 吸去p53 /的小鼠 MEF細胞培養皿中的培養基并用IXPBS緩沖液清洗兩次，加入 3mL無血清DMEM培養基，并