具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物，該提取物來自西瓜藤醇沉水提的乙酸乙酯部位。研究發現，該提取物具有良好的降血糖活性，可應用在臨床治療糖尿病中，包括Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。本發明充分利用了農作物廢棄物——西瓜藤的豐富資源，為今后深入研究開發其藥用價值和臨床意義提供了有力理論基礎，以期為臨床提供一種新的具有良好治療糖尿病作用的現代中藥制劑。
【專利說明】具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于中藥提取物【技術領域】，尤其涉及一種具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]據世界衛生組織調查，目前世界糖尿病患者人數高達約1.6億，而我國就有糖尿病人約4000多萬，約占全球糖尿病人數的1/4。每年死于糖尿病并發癥的患者高達10萬人，且逐年成上升趨勢，糖尿病已成為當前威脅人類健康的一大殺手。因此，對糖尿病的治療以及預防顯得尤為重要。糖尿病屬于內分泌疾病，分為I型和II兩種。其病因復雜，目前發病和發病機制尚不完全清楚，也沒有特殊治療方法，不能根治。治療方法一般有控制飲食和遵醫囑服用降糖藥或者注射胰島素，養成良好的飲食生活習慣，適當體力活動，適當限制飲食，使體重減至正常范圍，不要暴食，避免各種誘發因素等。因此，越來越多的學者把目光投向中草藥研究方面，以期發現一種新型治療糖尿病的藥物。
[0003]西瓜藤，為葫蘆科植物西瓜(Citrullus Ianatus)的藤莖，其作為一種農作物廢棄物，資源非常豐富，世界各地均有產出。目前已經證明西瓜具有清熱利濕之功效，主治水瀉，痢疾，燙傷，萎縮性鼻炎等癥。國內學者對西瓜瓤、西瓜皮臨床療效方面也做了大量的報道，表明其具有殺菌抗炎作用，可治療尿毒癥、腎盂腎炎、小兒鵝口瘡、慢性腹瀉等病癥。迄今為止，尚未見有關西瓜藤治療糖尿病有效部位的組合物研究報道和專利。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物及其制備方法和應用，以充分利用農作物廢棄物——西瓜藤的豐富資源，便于今后深入研究開發其藥用價值和臨床意義。
[0005]為解決上述技術問`題，本發明采用以下技術方案:
[0006]具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物，該提取物來自西瓜藤醇沉水提的乙酸乙酯部位。
[0007]該提取物主要包括以下十種化合物:十五燒酸(pentadecanoic acid)、十五燒酸單甘油酯(monopentadecanoin)、十九燒酸-1-甘油酯(2，3-dihydroxypropylnonadecoate)、二十四燒酸-α -單甘油酯(lignoceric acid-2, 3-dihydroxy-propanenylester)、2_[2’_ 羥基(2’R, 13Z)十六酸胺]-3_ 羥基-(2S, 3R, 4Z)-十八碳稀-1-0- β -D-批喃葡萄糖昔(lancerebroside5)、2_羥基苯甲酸(salicylic acid)、對羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)、對羥基苯酌.(hydroquinone)、玻拍酸(succinic acid)、香草酸(vanillic acid)。
[0008]上述具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物的制備方法，包括以下步驟:取西瓜藤曬干粉碎，按重量體積比5:1用體積濃度80%的乙醇溶液超聲2h，然后浸泡10d，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得墨綠色浸膏，冷凍干燥得綠色粉末；按重量體積比3:50將綠色粉末分散于去離子水中，靜置過夜，離心分出不溶于水的綠色黏稠固體懸浮物和水溶液；取水溶液依次用3倍體積的石油醚、乙酸乙酯萃取樣品，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，回收溶劑，蒸干，得到乙酸乙酯部位。
[0009]上述具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物在制備治療糖尿病的藥物方面的應用。
[0010]糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
[0011]藥物為膠囊、顆粒劑、片劑、溶液劑、丸劑或者注射劑。
[0012]膠囊為軟膠囊，顆粒劑為干混懸劑，片劑為分散片、泡騰片、咀嚼片、口崩片，溶液劑為糖漿，丸劑為濃縮丸、滴丸、微丸。
[0013]上述具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物在制備輔助治療糖尿病的保健食品方面的應用。
[0014]糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
[0015]發明人將農作物廢棄物西瓜藤中進行醇沉水提，再依次由石油醚和乙酸乙酯萃取獲得乙酸乙酯部位的提取物。研究發現，該提取物具有良好的降血糖活性，可應用在臨床治療糖尿病中，包括I型糖尿病和II型糖尿病。發明人利用各種柱色譜等分離技術及重結晶等純化手段對該提取物的化學成分進行分離，從中得到10個化合物，并綜合利用現代波譜技術(11?，^，1^，10、20-匪10對 分離所得化合物的化學結構進行鑒定，首次獲得西瓜藤醇沉水提的乙酸乙酯部位提取物的主要化學組成的信息。本發明充分利用了農作物廢棄物一西瓜藤的豐富資源，為今后深入研究開發其藥用價值和臨床意義提供了有力理論基礎，以期為臨床提供一種新的具有良好治療糖尿病作用的現代中藥制劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1是西瓜藤提取物的制備工藝流程圖。
[0017]圖2是西瓜藤乙酸乙酯部位的化合物分離工藝流程圖。
[0018]圖3是對糖尿病小鼠胰腺病理形態學的影響(DBAX400)。
[0019]圖4是各組動物腎臟病變情況(HE X 400)。
【具體實施方式】
[0020]一、西瓜藤提取物的制備
[0021]如圖1所示，取曬干粉碎的西瓜藤10kg，按重量體積比5:1用體積濃度80%的乙醇溶液超聲2h，然后浸泡10d，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得墨綠色浸膏，冷凍干燥得300g綠色粉末；按重量體積比3:50將綠色粉末分散于5000mL去離子水中，靜置過夜，離心(3000rpm.min—1)分出不溶于水的綠色黏稠固體懸浮物和水溶液；取水溶液依次用3倍體積的石油醚萃、乙酸乙酯、正丁醇萃取樣品，萃取液分別減壓濃縮，回收溶劑，蒸干，得到石油醚部位(30g)、乙酸乙酯部位(33g)、正丁醇部位(100g)。
[0022]二、西瓜藤乙酸乙酯部位的化合物分離
[0023]如圖2所示，取乙酸乙酯部分通過MCI，除去色素得到樣品10g，剩下23g經硅膠(100-200 目)345g 柱層析，用氯仿-甲醇(98: 5-0: 100) (98: 5，19:1, 16: 5,3:1,2: 1,1: 1,2: 3,1: 3，甲醇)為梯度洗脫溶劑系統洗脫。氯仿-甲醇(98: 5)洗脫部分，濃縮蒸干得樣品3g，反復硅膠洗脫，氯仿重結晶，得化合物1(0.04g)和化合物2(0.5g)；氯仿-甲醇(19: I)洗脫部分，濃縮回流蒸干得樣品4g，經硅膠(200-300)目100g，取第29-40份，濃縮蒸干得1.5g，經洗脫劑(氯仿-甲醇(I: I))溶解過凝膠，得流份，第5~10份，氯仿重結晶，得到化合物3 (0.3g),第23-34份，氯仿重結晶，得化合物4 (0.08g),再取硅膠洗脫部位的第45-67份，經洗脫劑(氯仿-甲醇(I: I))溶解過凝膠，得流份，取第20-50份，氯仿重結晶，得化合物5 (Ig);氯仿-甲醇(16:5)洗脫部位，濃縮蒸干得樣品
2.5g，經硅膠(200-300)目30g，取流分第18-25份，濃縮蒸干，經凝膠，取流份30-45，甲醇重結晶，得化合物6 (0.06g);氯仿-甲醇(3: I)洗脫部位，濃縮蒸干得樣品4g，經洗脫劑(氯仿-甲醇(1:1))溶解過凝膠，取流份15-25和40-50，分別濃縮蒸干得Ig和1.5g，流分15-25經洗脫劑(氯仿-甲醇(I: I))溶解，過凝膠，取流分31-43，甲醇重結晶得化合物7 (0.05g);流分40-50經洗脫劑甲醇溶解，再過凝膠，得流分28-40，甲醇重結晶得化合物8(0.4g);氯仿-甲醇(2: 3)洗脫部分，濃縮蒸干得樣品得4g，洗脫液甲醇溶解，經ODS柱洗脫，取流分37-57，濃縮蒸干得2.5g，洗脫液甲醇溶解，經凝膠柱洗脫，取流分26-46，甲醇從結晶得化合物9 (0.2g);取流分50-78，再經凝膠柱洗脫，甲醇重結晶得化合物10 (0.09g)。
[0024]利用現代波譜技術(IR，UV, MS, 1D.2D-NMR)對分離所得化合物的化學結構進行鑒定，證實西瓜藤乙酸乙酯部位的十種化合物分別為:十五烷酸(化合物I)、十五烷酸單甘油酯(化合物2)、十九烷酸-1-甘油酯(化合物3)、二十四烷酸-α -單甘油酯(化合物4)、2_[2’ -羥基(2’ R, 13Ζ)十六酸胺]-3_羥基-(2S, 3R, 4Ζ)-十八碳烯-1_0_β -D-吡喃葡萄糖苷(化合物5)、2_羥基苯甲酸(化合物6)、對羥基苯甲酸(化合物7)、對羥基苯酹(化合物8)、琥珀酸(化合物9)、香草酸(化合物10)。
[0025]三、藥效學實驗
[0026]實驗一:西瓜藤不同提取物對四氧嘧啶致糖尿病小鼠的降血糖作用
[0027]I材料與儀器
[0028]1.1 動物
[0029]清潔級健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重18~22g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，許可證號:SCXK桂2009-0058。動物分籠飼養，每籠10只，高脂飼料喂養，自由飲水，動物飼養環境溫度為23~26°C。
[0030]1.2藥品與試劑
[0031]西瓜藤采自廣西崇左，并經廣西藥用植物園馬小軍教授鑒定為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物西瓜(Citrullus Lanatus)的藤莖。
[0032]西瓜藤不同溶劑提取物自制；格列苯脲片(廣州市醫藥有限公司，批號:120902)；四氧嘧啶(ALX)(sigma公司產品，批號:122K2514)，臨用前用生理鹽水配置；水合氯醛(上海白鶴化工廠，批號:20110216) ;TG測試盒、TC測試盒:溫州津瑪生物科技有限公司；考馬斯亮蘭試劑盒、NO及iNOS試劑盒:南京建成生物工程研究所提供。
[0033]檸檬酸緩沖液的配制:將檸檬酸(FW:210.14)2.1g加入雙蒸水IOOmL中配成A液。將檸檬酸鈉(FW:294.10) 2.94g加入雙蒸水IOOmL中配成B液。用時將A、B液按一定比例混合(1:1.32)，PH計測定ph值，調節ph=4.2，即是所需配置的檸檬酸緩沖液。
[0034]1.3 儀器
[0035]Dounce組織勻衆器(美國Wheaton公司);AE1001/10000電子分析天平(日本島津公司);Agilent8453紫外-可見分光光度計(安捷倫公司);臺式低溫高速離心機(美國貝克曼庫爾特公司)；Bio-tek ELX800型酶標儀(美國寶特公司);血糖測定儀(德國羅氏公司)。
[0036]2實驗方法
[0037]2.1待試樣品的制備
[0038]西瓜藤采自廣西崇左，并經廣西藥用植物園馬小軍教授鑒定為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物西瓜(Citrullus Lanatus)的藤莖。
[0039]取曬干粉碎的西瓜藤5kg，分別用10倍、8倍量水煮沸提取2h、1.5h，合并提取液，濃縮干燥，即得水提取浸膏(1.2kg)(每克浸膏相當于4.2g生藥)。
[0040]參照一、西瓜藤提取物的制備獲得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位用于下述實驗。
[0041]2.2實驗模型的建立
[0042]取體質量22~24g昆明種小鼠一批，雌雄各半，分籠飼養。禁食不禁水12h后，稱重，編號。適應性飼養Iw后，空腹16h，腹腔內注射200mg/kg四氧嘧啶溶液(ALX)檸檬酸緩沖液(間隔48h，分兩次完成)。5d后，取尾部全血，用血糖測定儀(德國羅氏)測定空腹血糖濃度。空腹血糖濃度大于llmmoL/L小鼠被認為造模成功，入選下一步實驗。正常小鼠10只和糖尿病小鼠100只，分為11組，每組10只，連續灌胃15d。具體分組和灌胃劑量如下:第一組空白組(生理鹽水);第二組為糖尿病模型組(生理鹽水);第三組為陽性藥物組(格列苯脲0.015g/kg);第四-五組為乙酸乙酯提取物高、低劑量組(20g/kg，10g/kg);第六-七組為石油醚提取物高、低劑量組(20g/kg，10g/kg);第八-九組為正丁醇提取物高、低劑量組(20g/kg, 10g/kg);第十^一組為水提取物高、低劑量組(20g/kg, 10g/kg)，灌胃體積均為 2.0mL/kgo
[0043]2.2樣品的采集及測定
[0044]分別于給藥前、給藥后、給藥第7d，15d于尾靜脈取血用血糖儀測小鼠的血糖值。小鼠體質量分別于造模前、造模后，給藥7d，15d各測定一次。末次給藥后小鼠禁食12h，尾靜脈取微血測定血糖值，作為Oh的血糖值，灌胃給以葡萄糖每千克體質量為2.0g，測定給葡萄糖0.5，l，2h后的血糖值，觀察各組小鼠給葡萄糖后的血糖變化，比較各組之間是否存在差異，并用梯形面積法計算糖耐量曲線下面積(AUC)。
[0045]血糖指標檢測結束后摘除眼球取血,3000rpm.mirT1，15min離心分離血清。用化學比色法測定小鼠血清TG、TC、NO和iNOS含量；用放免法測血清胰島素。迅速摘取肝臟，制成10%勻漿測定其NO和iNOS水平。取出胰腺組織，在解剖鏡下解剖胰腺組織，用福爾馬林溶液固定，常規石蠟包埋，制成4 μ m石蠟切片，染色，按S-P試劑盒說明進行操作，DBA染色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。
[0046]2.3統計分析
[0047]實驗結果均以(~ 土s)表示，應用SPSS13.0軟件包處理數據，組間顯著性檢驗用
t檢驗及相關分析。
[0048]3 結果
[0049]3.1對糖尿病小鼠體質量的影響
[0050]造模成功后，各組小鼠的體質量顯著下降，與空白組相比有顯著性的差異(P〈0.05)。給藥7d后，各組小鼠體質量變化不明顯。給藥15d后，乙酸乙酯高劑量組、石油醚高劑量組小鼠體質量均明顯增加(p〈0.05)，結果見表1。
[0051]表1西瓜藤不同提取物對糖尿病小鼠體質量的影響
【權利要求】
1.一種具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物，其特征在于該提取物來自西瓜藤醇沉水提的乙酸乙酯部位。
2.根據權利要求1所述的具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物，其特征在于該提取物主要包括以下十種化合物:十五烷酸、十五烷酸單甘油酯、十九烷酸-1-甘油酯、二十四烷酸-α-單甘油酯、2-[2’ -羥基(2’ R，13Z)十六酰胺]-3-羥基-(2S，3R，4Z)-十八碳烯-l-0-β -D-吡喃葡萄糖苷、2-羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯酚、琥珀酸、香草酸。
3.權利要求1所述具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟:取西瓜藤曬干粉碎，按重量體積比5:1用體積濃度80%的乙醇溶液超聲2h，然后浸泡10d，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得墨綠色浸膏，冷凍干燥得綠色粉末；按重量體積比3:50將綠色粉末分散于去離子水中，靜置過夜，離心分出不溶于水的綠色黏稠固體懸浮物和水溶液；取水溶液依次用3倍體積的石油醚、乙酸乙酯萃取樣品，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，回收溶劑，蒸干，得到乙酸乙酯部位。
4.權利要求1所述具有治療糖尿病作用的西瓜藤提取物在制備治療糖尿病的藥物方面的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述藥物為膠囊、顆粒劑、片劑、溶液劑、丸劑或者注射劑。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于:所述膠囊為軟膠囊，所述顆粒劑為干混懸劑，所述片劑為分散片、泡騰片、咀嚼片、口崩片，所述溶液劑為糖漿，所述丸劑為濃縮丸、滴丸、微丸。
8.權利要求1所述具有治`療糖尿病作用的西瓜藤提取物在制備輔助治療糖尿病的保健食品方面的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
【文檔編號】A23L1/29GK103550280SQ201310546205
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】鄧家剛, 王碩, 龔小妹, 周小雷, 周丹丹, 戴航 申請人:廣西中醫藥大學, 廣西壯族自治區藥用植物園