專利名稱：藤黃中的兩個新化合物、其制備方法和藥物用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及從藤黃中得到的兩個新的化合物、其制備方法和它們在預防和治療腫瘤、艾滋病等疾病中的藥物用途。
背景技術：
藤黃(Gamboge)為藤黃科(Guttiferae)植物藤黃樹(Garcinia hanbaryi)所分泌的膠狀樹脂，主要產于柬埔寨、泰國、越南、中國。同科屬植物在我國南方廣東省和海南省也有分布。其生物學活性在中國古代醫書上早有記載，具有消腫、化毒、止血、殺蟲的功效。我國藥理和臨床工作者最早發現藤黃具有抗癌作用，并經多次實驗證明其主要的有效成分為以藤黃酸(gambogic acid)為代表的橋環化合物，對藤黃酸抗腫瘤作用的研究表明，藤黃酸能選擇性地殺死癌細胞，而對正常的外周血中白細胞無明顯影響。臨床上用于治療乳腺癌、淋巴肉瘤、皮膚癌均取得一定的療效. 目前已分離出的主要活性成分有藤黃酸、表藤黃酸、新藤黃酸、新藤黃酸、和別藤黃酸等20余個類似的化合物。本發明從藤黃中分離得到新的藤黃酸類衍生物和白樺酯酸類衍生物，它們均具有較強的抗腫瘤活性，另外，白樺酯酸類衍生物含還具有抗艾滋病的活性。
現有技術沒有提供任何與本發明提供的新的藤黃酸類衍生物和白樺酯酸類衍生物有關的信息。既沒有化合物結構確證的公開報道，也沒有企圖從動、植物中提取分離或化學合成制備該化合物的方法的報道，更沒有與該化合物有關的生物活性的公開報道。
發明內容
本發明的目的在于提供兩種從藤黃中分離得到的新化合物。
本發明的另一目的在于提供從藤黃中提取分離本發明的新化合物的方法。
本發明的另一目的是上述新化合物在預防和治療腫瘤、艾滋病等疾病方面的藥物用途。
本發明的目的通過下列技術措施實現。
發明人從藤黃中分離得到兩種新的化合物I和II，其立體結構如下圖所示
新化合物I和II從藤黃中分離得到，其方法包括以下步驟 a.取藤黃干燥樹脂，用溶劑提取，回收提取液，得到稠浸膏。
b.將稠浸膏經過正相或反相色譜層析分離，得到目標化合物。
提取溶劑可以是水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇丙酮、氯仿、乙酸乙酯、或任意比例的醇、水混合溶劑，優選含水5％---100％的乙醇或甲醇。提取方法可以是煎煮、回流、冷浸、滲漉、微波提取或超聲提取，優選冷浸和超聲提取。
提取液濃縮后可通過極性或非極性大孔吸附樹脂柱，用水洗去雜質，用含水低于80％的乙醇或甲醇洗脫，將含有目標物的洗脫液濃縮，得到精制液。也可以用各類正向或方向硅膠，其中優選正向硅膠，用洗脫液洗脫，收集分別含有目標化合物I和II的洗脫液濃縮，分別得到精制液。
濃縮后的精制液分別可在硅膠或氧化鋁等正相吸附材料中進行色譜分離，也可在硅烷鍵合硅膠、含有氨基或氨基的硅烷鍵合硅膠等反相材料中進行色譜分離，收集含有目標物的洗脫液。洗脫液重結晶或蒸干溶劑后分別得到新化合物I和II。
發明人發現化合物I和II具有良好的抗腫瘤生物活性，化合物I還具有預防和治療艾滋病的活性，并且毒性很低。
圖1.新化合物I的高分辨質譜圖 圖2.新化合物I的1HNMR圖 圖3.新化合物I的13CNMR圖 圖4.新化合物II的高分辨質譜數據 圖5.新化合物II的1HNMR圖 圖6.新化合物II的13CNMR圖 具體實施例 下列實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1.新化合物I(2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸)的制備。
藤黃干燥樹脂1000g，粉碎后用無水乙醇冷浸提取3次，每次4.5升，合并提取液、過濾，濾液減壓回收溶劑，得稠浸膏(475g)。稠浸膏用正相硅膠進行柱層析分離，梯度洗脫、溶劑系統為石油醚-丙酮、丙酮、甲醇，根據餾分薄層層析情況粗分成八個部分(GhA-GhH)。GhD(25g)經反復硅膠柱層析和制備柱層析分離得到化合物2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸，經高效液相檢測，純度為99.3％。
2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸 白色針狀結晶 分子式C32H50O5 電噴霧質譜(ESI-MS)準分子離子峰m/z513.23[M-H]-和m/z537.21[M+Na]+ HR-EI-MS顯示分子離子峰m/z514.3644[M]+(計算值514.7401)，分子式C32H50O5。
紅外光譜(IR)cm-13508，2972，2941，2870，1726，1703，1637，1452，1377，1369，1259，1186，1061，1047，1032，885。
核磁共振氫譜(1H-NMR)(400M DMSO-D6)δ，ppm 1.86(dd，1H，C1-βH)，0.78(t，1H，C1-αH)，3.58(brs，1H，C2-H)，4.34(d，1H，C3-H)，0.83(m，1H，C5-H)，2.24～2.17(m，1H，C13-H)，1.39(m，1H，C15-βH)，1.08～1.06(m，1H，C15-αH)，2.10～2.06(m，1H，C16-βH)，1.36(m，1H，C16-αH)，1.50(t，1H，C18-H)，2.92(m，1H，C19-H)，1.85～1.70，(m，1H，C21-βH)，1.29(m，1H，C21-αH)，1.85～1.70(m，1H，C22-βH)，1.42(m，1H，C22-αH)，0.73(s，3H，C23-H)，0.74(s，3H，C24-H)，0.82(s，3H，C25-H)，0.84(s，3H，C26-H)，0.93(s，3H，C27-H)，4.54(d，1H，C29-H)，4.66(d，1H，C29-H)，1.63(s，3H，C30-H)，4.53(d，1H，C2-OH)，2.00(s，3H，C32-H) 核磁共振碳譜(13C-NMR)(100M DMSO-D6)δ，ppm 48.10(C1，仲碳)，65.53(C2，叔碳)，84.45(C3，叔碳)39.41(C4，季碳)，55.16(C5，叔碳)，18.52(C6，仲碳)，34.35(C7，仲碳)，40.96(C8，季碳)，50.39(C9，叔碳)，38.36(C10，季碳)，21.28(C11，仲碳)，25.66(C12，仲碳)，38.23(C13，叔碳)，42.73(C14，季碳)，29.86(C15，仲碳)，32.37(C16，仲碳)，56.11(C17，季碳)，49.18(C18，叔碳)，47.29(C19，叔碳)，150.98(C20，季碳)，30.80(C21，仲碳)，37.00(C22，仲碳)，28.98(C23，伯碳)，18.15(C24，伯碳)，17.76(C25，伯碳)，16.38(C26，伯碳)，14.99(C27，伯碳)，177.93(C28，季碳)，110.33(C29，仲碳)，19.65(C30，伯碳)，171.00(C31，季碳)，21.77((C32，伯碳)。
新化合物I(2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸)的質譜見圖1，核磁共振1H譜見圖2，核磁共振13C譜見圖3。
實施例2.新化合物II(10-α-羥基表藤黃酸)的制備 藤黃干燥樹脂1000g，粉碎后用無水乙醇冷浸提取3次，每次4.5升，合并提取液、過濾，濾液減壓回收溶劑，得稠浸膏(475g)。稠浸膏用正相硅膠進行柱層析分離，梯度洗脫、溶劑系統為石油醚-丙酮、丙酮、甲醇，根據餾分薄層層析情況粗分成八個部分(GhA-GhH)。GhB(33.7g)經反復硅膠柱層析和制備柱層析分離得到化合物10α-羥基表藤黃酸，經高效液相檢測，純度為98.5％。
10α-羥基表藤黃酸 黃色粉末 分子式C38H46O9 電噴霧質譜(ESI-MS)m/z647.5[M+H]+和m/z669.3034[M+Na]+ HR-ESI-MS顯示分子離子峰m/z669.3034[M+Na]+(計算值669.3040)，分子式C38H46O9。
紅外光譜(IR)cm-12968，2926，1730，1643，1628，1454，1435，1373，1177，1155，1124，1109，1045，739。
紫外光譜(UV)λmaxnm290，358。
核磁共振氫譜(1H-NMR)(400M CDCl3)δ，ppm 5.42(d，1H，C3-H)，6.64(d，1H，C3-H)，3.18(s，1H，C9-H)，4.80(d，1H，C10-H)，2.66(d，1H，C11-H)，1.36(s，3H，C19-H)，1.80～1.76(m，1H，C20-H)，1.62(m，1H，C20-H)，1.90(m，1H，C21-H)，1.40(m，1H，C21-H)，2.43(d，1H，C22-H)，1.12(s，3H，C24-H)，1.34(s，3H，C25-H)，3.2(m，2H，C26-H)，6.63(m，1H，C27-H)，1.94(s，3H，C30-H)，3.2(m，2H，C31-H)，5.01(m，1H，C32-H)，1.72(s，3H，C34-H)，1.62(s，3H，C35-H)，2.08～2.01(m，2H，C36-H)，5.15(m，1H，C37-H)，1.56(s，3H，C39-H)，1.65(s，3H，C40-H) 核磁共振碳譜(13C-NMR)(100M CDCl3)δ，ppm 81.30(C2，季碳)，125.28(C3，叔碳)，116.13(C4，叔碳)，103.01(C5，季碳)，156.66(C6，季碳)，101.99(C7，季碳)，194.27(C8，季碳)，50.32(C9，叔碳)，65.84(C10，叔碳)，46.85(C11，叔碳)，209.79(C12，季碳)，82.53(C13，季碳)，88.60(C14，季碳)，155.97(C16，季碳)，109.00(C17，季碳)，161.64(C18，季碳)，27.42(C19，伯碳)，42.05(C20，叔碳)，20.46(C21，仲碳)，43.08(C22，叔碳)，86.77(C23，季碳)，27.42(C24，伯碳)，29.96(C25，伯碳)，28.19(C26，仲碳)，140.33(C27，叔碳)，127.06(C28，季碳)，20.76(C29，伯碳)，172.92(C30，季碳)，21.71(C31，仲碳)，122.82(C32，叔碳)，131.36(C33，季碳)，18.33(C34，伯碳)，25.98(C35，伯碳)，23.10(C36，仲碳)，124.02(C37，叔碳)，132.12(C38，季碳)，17.84(C39，伯碳)，25.87(C40，伯碳)。
新化合物II(10α-羥基表藤黃酸)的質譜見圖4，核磁共振1H譜見圖5，核磁共振13C譜見圖6。
實施例3.新化合物I(2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸)對HIV病毒的抑制作用 將H9T淋巴細胞株在含有10％小牛血清的培養基中，在5％CO2、37℃的條件下連續培養。取實驗樣品分別溶解于二甲亞砜中，配制成250、50、10和2μg/ml的不同濃度。取部分H9T淋巴細胞用艾滋病毒(HIV-1)進行感染，達到104感染單位/ml。另取等量的H9T淋巴細胞加入等量的培養基，測定細胞毒活性(IC50)。然后置于37℃和5％CO2中培養4小時，取出，分別洗滌3次，分別加入24孔的平板上，加入不同濃度的試驗液，陰性對照組加入等量的培養液，以齊多夫定(AZT)作為陽性對照，然后把平板置于37℃和5％CO2中培養4天。收集去除細胞后的上清夜作P24抗原檢測，通過測定HIV殼蛋白的數量直接測定HIV的存在，計算EC50值。經上述方法測定，2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸的IC50值為173.6μg/ml，EC50值為2.64μg/時，治療指數T100(IC50/EC50)為65.7。
實施例4.新化合物I(2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸)和化合物II(10-α-羥基表藤黃酸)的體外抗腫瘤活性研究 將化合物I和II(純度大于95％)分別用)二甲亞砜溶解，再用完全RPMI-1640培養基將其稀釋成80umol/L的工作液，分別將培養好的人結腸癌細胞HCT-8、人肝癌細胞Bel-7402、人胃癌細胞BGC-823、人非小細胞肺癌細胞A549、人卵巢癌細胞A2780用胰酶消化，并稀釋成1.0×104～2.0×104/mL的活細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔180uL，設6個復孔，培養24h后每孔加入不同濃度的藥物20uL，使其終濃度分別為16、8、4、3、1.5、0.75umol/L，對照孔則加入20uL完全培養基，置于37℃、5％CO2的培養箱中培養4天，每孔加入5mg/mL的MTT溶液(RPMI-1640配置)20uL，繼續培養4h后，小心吸棄全部上清液，每孔加入150uL DMSO，振蕩后，于酶聯儀波長570nm處測定各孔吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。實驗重復3次。將濃度和抑制率經一定變換后用非線性回歸擬合計算，求得藥物的半數抑制濃度(IC50)。
增殖抑制率＝(1-A給藥/A對照)×100％ 表1、表2和表3實驗數據表明本發明化合物I和化合物II對人結腸癌細胞HCT-8、人肝癌細胞Bel-7402、人胃癌細胞BGC-823、人非小細胞肺癌細胞A549、人卵巢癌細胞A2780有較強的細胞毒活性，因為常規抗腫瘤化合物的體外活性篩選是以化合物的細胞毒活性來體現的，所以本發明化合物具有抗腫瘤活性，可以與藥用載體混合，制備抗腫瘤藥物。
表1化合物I對不同癌細胞的增值抑制率
表2化合物II對不同癌細胞的增值抑制率
表3化合物I和化合物II對不同癌細胞增值的半數抑制濃度(IC50，umol/L)
權利要求
1.由結構通式I表示的化合物2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸2α-hydroxy-3β-acetoxy-lup-20(29)-en-28-oic acid；
2.由結構通式II表示的化合物10α-羥基表藤黃酸10α-hydroxyepigambogic acid；
3.權利要求1和2中的化合物I和II的制備方法，其制備方法包括以下步驟
a.取藤黃干燥樹脂，用溶劑提取，回收提取液，得到稠浸膏。
b.將稠浸膏經過正相或反相色譜層析分離，得到目標化合物。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于提取溶劑可以是水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等溶劑或任意比例的醇、水混合溶劑。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于用于色譜層析分離的材料可以是硅膠、氧化鋁、硅烷鍵合硅膠、含有氰基或氨基的硅烷鍵合硅膠。
6.權利要求1中化合物I在預防和治療腫瘤、艾滋病等疾病方面的藥物用途。
7.權利要求2中化合物II在預防和治療腫瘤等疾病方面的藥物用途。
全文摘要
本發明涉及從藤黃中提取分離得到的兩個新化合物2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸和10α-羥基表藤黃酸，其制備方法和藥物用途。本發明所述的兩個新化合物結構由式I和II表示，化合物I2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸可用于制備預防和治療腫瘤、艾滋病等疾病的藥物；化合物II10α-羥基表藤黃酸可用于制備預防和治療腫瘤等疾病的藥物。本發明還提供了兩個新化合物2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺酯酸和10α-羥基表藤黃酸的制備方法。
文檔編號C07D493/22GK101607978SQ20081003929
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月20日 優先權日2008年6月20日
發明者秦繼紅 申請人:秦繼紅