一種蠟梅提取物、其制備方法及應用
【專利摘要】一種蠟梅提取物，其含有山柰酚5～20％，槲皮素10～30％，鯊肌醇50～60％，及不可避免的雜質，通過將蠟梅材料用液氮凍干、磨粉，加入提取劑，在35～60℃超聲浸提0.5～2h，浸提結束后離心、過濾、收集濾液并經色譜柱進行層析純化后得到所述的蠟梅提取物，本發明的蠟梅提取物能夠保護皮膚減少微生物侵害，具有減少紫外線輻射、抗氧化、抵抗皮膚炎癥的作用，從而保護皮膚細胞，該蠟梅提取物應用于化妝品或保健品，還能減少色素沉積，抑制色斑生成，使肌膚白皙鮮亮。
【專利說明】
-種蠟梅提取物、其制備方法及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于植物組分提取領域，具體設及一種蠟梅提取物、其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 蠟梅，又名黃梅花、香梅，原產自我國，為蠟梅科蠟梅屬落葉叢生灌木。蠟梅起源古 老，為第Ξ紀不遺植物，亦是我國傳統名花之一。蠟梅作為中國的傳統花弁，也是標志性花 弁之一，自古深受人們喜愛，在中華文化中凜冬而立的蠟梅象征著氣節，"不經一番寒徹骨， 怎得梅花撲鼻香"等經典詩句更是廣為流傳。
[0003] 蠟梅花開于寒月早春，先花后葉，花黃如臘，清香四溢，為冬季觀賞佳品，是我國特 有的珍貴觀賞花木。蠟梅性喜陽光，亦耐半陰，怕風，較耐寒，在不低于-15°C時能安全越冬， 北京W南地區可露地栽培。蠟梅不僅是理想的觀賞花弁，也可做切花，粧景，花可泡茶、釀 酒、入藥、提取香精，其根莖葉也有止咳等效用。
[0004] 長期W來，人們將目光集中在蠟梅作為茶飲、香精、中藥的用途，對蠟梅進行提取 時，利用超聲輔助提取多采取低頻(10-20KHZ)及中頻(40k化），在分離時洗脫劑中添加了醇 類溶劑(如下二醇-丙酬體系），洗脫劑體系極性較大，提取物的組分類別繁雜而且多為揮發 性物質，提取物組成不穩定，影響應用效果，應用受到限制。
[0005] 而研究表明，人們長期暴露于陽光、大氣污染物中，機體會產生過多的活性氧與自 由基，致使人體自身的抗氧化物質含量下降，導致細胞活力降低，人體代謝失調，甚至受到 有害的微生物的感染，最終使得皮膚加速老化，膚色暗沉，出現瘦瘡紅腫，基于目前蠟梅提 取物的應用限制，將蠟梅提取后應用于皮膚保護的用途尚未見報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種蠟梅提取物、其制備方法及應用，該提取物能夠保護 皮膚細胞，具有降低皮膚所遭受的微生物侵害、紫外線福射，抗氧化等作用，也可W起到抵 抗皮膚炎癥的作用，還能減少色素沉積，抑制色斑生成，使肌膚白暫鮮亮。
[0007] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案如下：
[000引一種蠟梅提取物，其各組分重量百分比為：山奈酪5~20%，搬皮素10~30%，整肌 醇50~60%，及不可避免的雜質。
[0009] 本發明所述蠟梅提取物的制備方法，包括W下步驟：
[0010] 1)將蠟梅材料清洗、切碎、消毒；
[0011] 2)將消毒后的蠟梅材料用液氮凍干、磨粉，加入提取劑，在密閉條件下，超聲浸提 0.5~化，浸提溫度為35~60°C，超聲頻率60-100kHz;其中，蠟梅和提取劑的質量體積比為 1:30~60;
[0012] 3)浸提結束后離屯、，過濾，收集濾液，得到蠟梅提取物的溶液；
[0013] 4)將步驟3)得到的蠟梅提取物的溶液，濃縮，利用色譜柱進行層析純化，梯度洗 脫，洗脫劑為石油酸-丙酬；
[0014] 5)收集洗脫液，烘干，得到所述蠟梅枝條提取物。
[0015] 進一步，步驟2)中，步驟2)中所述的提取劑選自70~90%乙醇的水溶液、醋酸乙醋 和飽和正下醇的水溶液中的至少一種。
[0016] 優選地，步驟2)中，蠟梅材料和提取劑的質量比為1:35~45。
[0017] 又優選地，所述的步驟2)在無氧條件下進行。
[0018] 進一步，步驟4)中，利用色譜柱層析純化時，用硅膠柱純化2~5次，用徑丙基葡聚 糖凝膠柱色譜純化2~5次，收集洗脫劑中石油酸和丙酬體積比在100:6~12時的洗脫液。
[0019] 進一步，所述的蠟梅材料為蠟梅植株的枝條、莖干、葉或花。
[0020] 本發明提供一種包含所述蠟梅提取物的組合物，包括:甘油2~7wt. %、下二醇3~ 5wt. %、1,2-戊二醇1~5wt. %、EDTA二鋼0.1~0.4wt. %、甘油硬脂酸醋1~3wt. %、透明質 酸鋼0~0.1 wt. %、黃原膠1~lOwt. %、蠟梅提取物2~8wt. %，余量為水。
[0021] 本發明的蠟梅提取物可應用于化妝品或保健品的制備中，所述的化妝品優選美白 類、桂痘和/或抑菌類化妝品。
[0022] 本發明對蠟梅材料進行提取時，超聲頻率為60-100kHz，較高的超聲頻率可W加快 成分的溶出，并能夠提高溶質的溶解度，對蠟梅提取物進行柱層析純化時，采用石油酸-丙 酬洗脫劑體系，梯度洗脫，獲取石油酸和丙酬的體積比在100:6~12時的洗脫液，得到的蠟 梅提取物含有豐富的山奈酪、搬皮素和整肌醇。
[0023] 本發明的蠟梅提取物含有豐富的山奈酪，搬皮素和整肌醇，能夠保護皮膚減少微 生物侵害，具有減少紫外線福射，抗氧化等作用，從而保護皮膚細胞，其中山奈酪和搬皮素 也可W起到抵抗皮膚炎癥的作用，與此同時，還能清除氧自由基，抑制酪氨酸酶活性，進而 抑制了色斑生成，使肌膚白暫鮮亮。
[0024] 本發明的蠟梅提取物中含有山奈酪，質量百分比為5%~20%，山奈酪具有抗氧化 性，山奈酪顯示出具有在體外和體內的抗氧化作用的陣列，在低濃度時，可W充當超氧化物 清除劑，特別是對高反應性的徑基自由基和過氧化亞硝酸鹽物種，在高濃度它增加抗氧化 酶例如超氧化物歧化酶，過氧化氨酶，和血紅素加氧酶1的活性或表達，并且可W抑制細菌 等微生物的生長，為皮膚提供多重保護。
[0025] 本發明的蠟梅提取物中含有搬皮素，質量百分比為：10%~30%，其在蠟梅枝條中 的含量尤為豐富，搬皮素具有促進皮膚毛細血管的抗性，緩解敏感性皮膚，也有助于皮膚細 胞的生長和活力保持。
[00%]本發明的蠟梅提取物中含有整肌醇，質量百分比為50%~60%，整肌醇可W斷開 醋鍵，分解膽固醇和脂肪成更小的顆粒，減少皮膚表面脂肪堆積，減少皮膚脂肪粒的產生， 使皮膚細滑，提升皮膚活力，改善皮膚生理狀態。
[0027] 本發明的有益效果：
[0028] 本發明通過提取分離得到了蠟梅枝條提取物，有機地結合了蠟梅所富含的Ξ種成 分山奈酪，搬皮素和整肌醇，運Ξ種成分相互協作，搬皮素與山奈酪都有抑菌的效果，而整 肌醇對醋質的清理可W破壞病菌的生長環境，加強了抑菌作用；山奈酪可W清除氧自由基， 保護了血管內皮生長的微環境，更有利于搬皮素保護皮膚的毛細血管，因此，Ξ種物質呈現 協同關系，可W獲得更理想的效果。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明實施例2中透明質酸的標準曲線。
[0030] 圖2為本發明實施例2中透明質酸的增長百分比。
[0031] 圖3為本發明實施例3中皮膚成纖維細胞的存活率變化。
【具體實施方式】
[0032] W下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明。
[0033] 實施例1
[0034] 利用蠟梅枝條制備蠟梅提取物，包括W下步驟：
[0035] 1)將50g蠟梅枝條清洗、切碎、消毒；
[0036] 2)將消毒后的蠟梅枝條用液氮凍干、磨粉，加入化乙醇，在密閉條件下，溫度為50 °C，超聲浸提化，超聲頻率80曲Z;
[0037] 3)浸提結束后離屯、，過濾，收集得到500mL濾液；
[0038] 4)將步驟3)的濾液濃縮后，利用色譜柱進行純化，過200~300目硅膠色譜柱2~5 次、徑丙基葡聚糖凝膠柱色譜2~5次，洗脫劑為石油酸-丙酬，梯度洗脫，石油酸和丙酬的體 積比從100:0到100:14(收集石油酸和丙酬體積比為100:6、100:8、100:10和100:12的產 物)。
[0039] 5)收集洗脫液，濃縮，烘干，得到0.8g提取物。
[0040] 本實施例中，通過調整用色譜柱純化濃縮濾液的次數，得到不同的含量組合，例 如：
[0041] 蠟梅提取物1，過硅膠色譜柱3次、徑丙基葡聚糖凝膠柱色譜3次：山奈酪(84mg/g)、 搬皮素（120mg/g)、整肌醇(537mg/g);
[0042] 蠟梅提取物2,過硅膠色譜柱4次、徑丙基葡聚糖凝膠柱色譜4次：山奈酪(61mg/g)、 搬皮素(280mg/g)、整肌醇(508mg/g);
[0043] 蠟梅提取物3,過硅膠色譜柱2次、徑丙基葡聚糖凝膠柱色譜2次：山奈酪（150mg/ g)、搬皮素（192mg/g)、整肌醇(588mg/g)。
[0044] 實施例2使用蠟梅提取物對微生物侵染的抑菌能力驗證
[0045] 透明質酸是由成纖維細胞分泌的，透明質酸的分泌量能夠體現皮膚成纖維細胞對 受到微生物侵染時的抑菌能力。
[0046] 1.準備人的皮膚細胞
[0047] 取正常人的真皮成纖維細胞作為原代細胞，于75cm2培養瓶中（含有生長因子的培 養基2ml)，37°C、(X)2濃度為5 %的條件下培養細胞至80 %濃度，進行傳代，傳代細胞在 175cm2方瓶中繼續培養細胞至80%濃度，得到人真皮成纖維細胞。
[0048] 用含有體積分數10 %胎牛血清的DMEM培養液培養上述得到的人真皮成纖維細胞， 于37 °C，5 % C〇2培養24小時，待細胞接近融合，用含0.25 %膜蛋白酶和0.02 %邸TA的消化液 消化后按1:2傳代，選取第四代細胞。
[0049] 用含有10%胎牛血清的DMEM培養液將第四代細胞稀釋至密度為105個細胞/ml，再 接種到12孔板中，接種量為2 X 103個細胞/孔，培養至細胞接近80 %融合后，用生理鹽水洗 板3遍，得到接種了人真皮成纖維細胞的孔板。
[(X)加]2.準備待試樣品
[0化1 ]配制蠟梅提取物精華液，精華液成分:甘油5 . Owt. %、下二醇4. Owt. %、1，2-戊二 醇3.0wt. %、EDTA二鋼0.1 wt. %、甘油硬脂酸醋1.5wt. %、透明質酸鋼0.05wt. %、黃原膠 4.0wt. %、實施例1的蠟梅提取物3 5.0wt. %，余量為去離子水。
[0052] 將瘦瘡丙酸桿菌涂布在LB培養基上，在37Γ培養箱中培養48h，計算得到的細菌 數，并按每個培養孔500細菌數接種于上述步驟1)中得到的接種了人真皮成纖維細胞的12 孔板中，選取兩個12孔板中的15個細菌接種的孔，其中5個孔為一組，設3組平行對照，每組 的5個孔內分別加入A樣品(精華液0.01mL+生理鹽水0.29mL)、B樣品(精華液0.05mL+生理鹽 水0.25mL)、C樣品（精華液0 . lmL+生理鹽水0.2mL)、D樣品（精華液0.3mL)和對照組樣品 (0.3mL生理鹽水），在37 °C，5 % 0)2條件下培養12h，之后分別收集A樣品、B樣品、C樣品、D樣 品和對照組樣品的培養上清液備用，該培養上清液中含有受到瘦瘡丙酸桿菌侵染的人真皮 成纖維細胞。
[0053] 3.繪制透明質酸標準曲線
[0054] 配制6個透明質酸標準品溶液，濃度依次為：Oyg/mL，lOyg/mL，20yg/mL，40yg/mL， 80yg/mL，160yg/mL，利用酶標儀在450nm下測試其OD值，測試結果參見表1。
[0化5] 表1
[0化6]
[0057]依照人透明質酸酶聯免疫分析試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司）說明書，根據 透明質酸標準品測試結果，W0D值為縱軸，W透明質酸濃度為橫軸繪制透明質酸的標準曲 線，參見圖1 ;00 = 0.0171 Xc+0.2857,相關系數R2 = 0.977，p = 0.004,其中，C為透明質酸的 濃度，單位yg/mL，經過換算得，透明質酸濃度C = (0D-0.2857) /0.0171。
[005引4.進行透明質酸含量測定
[0059] 依照人透明質酸酶聯免疫分析試劑盒說明書，用人透明質酸酶聯免疫分析試劑盒 中的溶劑將步驟2中備好的A樣品、B樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液分別稀 釋5倍，現憶稀釋5倍后的A樣品、B樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液的0D值，再 根據透明質酸的標準曲線計算透明質酸含量，結果參見表2和圖2。
[0060] 表 2
[0061]
[0062]由表2和圖2可W看出，加入本發明的蠟梅枝條提取物配制的精華液后，人真皮成 纖維細胞在瘦瘡丙酸桿菌的侵染下分泌透明質酸的含量有顯著提高，透明質酸是由成纖維 細胞分泌的，透明質酸分泌量的增加反映了該蠟梅枝條提取物有助于皮膚成纖維細胞抵抗 微生物的侵染。
[0063] 實施例3驗證蠟梅提取物的對病原微生物的抵抗力
[0064] 1.收集細胞
[0065] 收集實施例2中步驟2中的A樣品、B樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液 中的人真皮成纖維細胞，在轉速500~lOOOr/min條件下離屯、5min，取下層沉淀，即人真皮成 纖維細胞，用ImlPBS緩沖液洗涂1次，再離屯、，棄去PBS緩沖液，加入冰預冷的70 %的乙醇，進 行固定，4°C，1~2小時，離屯、棄去固定液，加入3mLPBS緩沖液重懸5分鐘。
[0066] 2.細胞過濾
[0067] 用400目篩網將得到的人真皮成纖維細胞過濾1次，500~100化/min離屯、5min，棄 去緩沖液。
[006引 3.染色
[0069] 用1ml PI染液染色，放置于4°C冰箱中，避光30分鐘。
[0070] 4.流式細胞儀檢測
[0071] 通過流式細胞儀檢測得到的人真皮成纖維細胞的生存狀態，分別測定人真皮成纖 維細胞的存活數、調亡數，計算存活率，結果參見表3。
[0072] 表 3
[0073]
[0074] 瘦瘡丙酸桿菌會影響人真皮成纖維細胞的生長，由表3可W看出，加入本發明的蠟 梅提取物后，皮膚成纖維細胞在瘦瘡丙酸桿菌的競爭下，存活率有顯著提高，說明該精華液 有助于人真皮成纖維細胞對病原微生物的抵抗力。
[0075] 實施例4驗證蠟梅提取物的清除氧自由基的效果
[0076] 在酪氨酸酶的作用下，左旋多己化-D0PA)氧化為棟褐色的多己色素，在抑制劑的 存在條件下，該反應將得到抑制，測試本發明的蠟梅枝條提取物對酪氨酸酶活性的抑制率， 包括如下步驟：
[0077] 將本發明實施例2第2步驟獲得的A樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液 每個樣品各取〇.11111，分別加入預先在30°(：恒溫水浴中保溫的2.81111的心00?4底物溶液的試 管中，混勻，然后加入0.1ml的600單位/ml的酪氨酸酶溶液，充分混勻后于30°C進行水浴10 分鐘，使用分光光度計，于475nm處測定多己色素的吸收峰值。
[0078] 由測定的吸光度，計算原液稀釋液對酪氨酸酶活性的抑制率（％)，參見表4,其中， 抑制率的計算公式如下：
[00 巧]抑制率=[1-(T1-T2)/(C1-C2)]X100%
[0080] 上述計算公式中，
[0081] C1為未加試樣(A樣品、C樣品、D樣品）加酪氨酸酶的混合物所測的吸光度值；
[0082] C2為未加試樣(A樣品、C樣品、D樣品）也未加酪氨酸酶的混合物所測的吸光度值；
[0083] T1為加入試樣(A樣品、C樣品、D樣品）和酪氨酸酶的混合物所測的吸光度值；
[0084] Τ2為加入試樣(A樣品、C樣品、D樣品)未加酪氨酸酶的混合物所測的吸光度值。
[0085] 表 4 Γ00861
[0087] ~由表5可W看出，本發明所得到的蠟梅枝條提取對于酪氨酸酶的活性有明顯的' 抑制作用，隨著濃度升高，抑制作用加強，運可W抑制色斑的形成，起到使皮膚美白的作用。
[0088] 實施例5本發明的蠟梅枝條組合物的應用驗證
[0089] 清潔手臂，將本發明實施例2第2步驟中所述的A樣品、C樣品、D樣品分別涂布在手 臂上2.5cmX2.5cm的皮膚，并W生理鹽水為對照樣涂布在相同面積，分別在1小時、2小時、5 小時后觀察皮膚狀態并進行記錄，結果見表5。
[0090] 表 5
[0091]
[0092] ~由表5可W看出，加入本發明的蠟梅枝條提取物后，皮膚的保水能力有所提高，美~ 白保濕效果明顯。
[0093] 本發明的蠟梅提取物能夠保護皮膚減少微生物侵害，具有減少紫外線福射、抗氧 化等作用，從而保護了皮膚細胞，該蠟梅提取物也可W起到抵抗皮膚炎癥的作用，與此同時 還能減少色素沉積，抑制了色斑生成，使肌膚白暫鮮亮。
【主權項】
1. 一種蠟梅提取物，其各組分重量百分比為：山柰酚5~20%，槲皮素10~30%，鯊肌醇 50~60%，及不可避免的雜質。2. 如權利要求1所述的蠟梅提取物的制備方法，包括以下步驟： 1) 將蠟梅材料清洗、切碎、消毒； 2) 將消毒后的蠟梅材料用液氮凍干、磨粉，加入提取劑，在密閉條件下，超聲浸提0.5~ 2h，浸提溫度為35~60°C，超聲頻率60-lOOkHz;其中，蠟梅和提取劑的質量體積比為1:30~ 60； 3) 浸提結束后離心，過濾，收集濾液，得到蠟梅提取物的溶液； 4) 將步驟3)得到的蠟梅提取物的溶液，濃縮，利用色譜柱進行層析純化，梯度洗脫，洗 脫劑為石油醚-丙酮； 5) 收集洗脫液，烘干，得到所述蠟梅枝條提取物。3. 如權利要求2所述的蠟梅提取物的制備方法，其特征在于，步驟2)中，步驟2)中所述 的提取劑選自70~90 %乙醇的水溶液、醋酸乙酯和飽和正丁醇的水溶液中的至少一種。4. 如權利要求2或3所述的蠟梅提取物的制備方法，其特征在于，步驟2)中，蠟梅材料和 提取劑的質量比為1:35~45。5. 如權利要求3所述的蠟梅提取物的制備方法，其特征在于，所述的步驟2)在無氧條件 下進行。6. 如權利要求2所述的蠟梅提取物的制備方法，其特征在于，步驟4)中，利用色譜柱層 析純化時，用硅膠柱純化2~5次，用羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜純化2~5次，收集洗脫劑中石 油醚和丙酮體積比在100:6~12時的洗脫液。7. 如權利要求3~6任一項所述的蠟梅提取物的制備方法，其特征在于，所述的蠟梅材 料為蠟梅植株的枝條、莖干、葉或花。8. -種含有權利要求1所述蠟梅提取物的組合物，包括：甘油2~7wt. %、丁二醇3~ 5wt. %、1,2-戊二醇1~5wt. %、EDTA二鈉0· 1~0.4wt· %、甘油硬脂酸酯1~3wt. %、透明質 酸鈉0~0.1 wt. %、黃原膠1~IOwt. %、錯梅提取物2~8wt. %，余量為水。9. 如權利要求1所述的蠟梅提取物在化妝品或保健品中的應用。10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的化妝品為美白類、祛痘和/或抑菌類 化妝品。
【文檔編號】A61P17/16GK105920059SQ201610394829
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】朱劍虹, 王智富, 朱侗明
【申請人】上海神因生物科技有限公司