一種梅花葉提取物、其制備方法及應用
【專利摘要】一種梅花葉提取物、其制備方法及應用，該梅花葉提取物各組分重量百分比為：槲皮素0.5～10.0％，異鼠李素0.5～5.0％，植物糖苷50.0～70.0％，槲皮素衍生物和異鼠李素衍生物5～10％，及不可避免的雜質，通過采用乙醇浸提和超聲提取結合的方法，對梅花葉進行提取，利用40～65℃的乙醇浸提，能增加槲皮素和異鼠李素的溶解度，超聲浸提加快其溶出速度，使其溶出更加徹底。本發明的梅花葉提取物為純天然成分，具有減少紫外線輻射，抗氧化等作用，從而保護皮膚細胞，該提取物還能起到預防皮膚粉刺生成的作用，減少色素沉積，抑制色斑生成，使肌膚白皙鮮亮。
【專利說明】
_種梅花葉提取物、其制備方法及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于植物組分提取領域，具體涉及一種梅花葉提取物、其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 梅花，系薔薇科李屬的落葉喬木，稀灌木；小枝綠色，光滑無毛；葉片卵形或橢圓 形，梅花耐寒耐熱，無論是在-1 〇 °C的低溫環境還是在40 °C的高溫中都可以很好地存活。
[0003] 梅花原產自我國南方，是我國傳統名花之一，在1929年曾被定為中國國花。梅花作 為中國的傳統花卉，也是標志性花卉之一，多取清白卓然之意，宋代詞人周邦彥有詞云："一 剪梅花萬樣嬌，斜插疏枝，略點眉梢"引出了中華千年的"一剪梅"的文化理念。
[0004] 梅花不僅是理想的觀賞花卉，也可做切花，粧景，花可泡茶、釀酒、入藥、提取香精， 其根莖葉也有止咳等效用。《本草綱目》記載梅花有"清頭目、利肺氣、祛痰壅滯上熱"，梅花 葉可入藥，有預防霍亂的功效。
[0005] 梅花葉發于每年的二三月之交，一般晚于花期，梅花葉中存在豐富的槲皮素異鼠 李素以及植物糖苷，現有技術中對梅花進行提取時，利用超聲輔助提取時多采取低頻（10-20KHz)及中頻(40kHz)，在分離時洗脫劑中添加了醇類溶劑（如丁二醇-丙酮體系），洗脫劑 體系極性較大，提取物的組分類別繁雜而且多為揮發性物質，提取物組成不穩定，影響應用 效果，應用受到限制。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種梅花葉提取物、其制備方法和應用，該提取物含多種 天然活性成分，活性高、對皮膚親和性強、安全性高，易于通過皮膚表層進入皮膚深層，有助 于肌膚鎖水，具有減少紫外線輻射，抗氧化等作用，同時減少色素沉積，抑制了色斑生成，使 肌膚白皙鮮亮，可應用于肌膚護理產品的開發。
[0007] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案如下：
[0008] -種梅花葉提取物，其組分及重量百分比為:槲皮素0.5~10.0 %、異鼠李素0.5~ 5.0%、植物糖苷50.0~70.0%，槲皮素衍生物和異鼠李素衍生物5~10%，及不可避免的雜 質。
[0009] 進一步，所述的異鼠李素和槲皮素的質量比為1:1~3。
[0010] -種梅花葉提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0011] 1)將梅花葉清洗、切碎、研磨；
[0012] 2)加入溫度為40~65 °C的乙醇，梅花葉和乙醇的質量體積比為1:10~50，在密封 避光條件下，攪拌〇. 5~2h，得到混合物；
[0013] 3)將混合物過濾，收集濾液，保留濾渣，減壓蒸發至濾液體積減少50~70%，得到 梅花葉提取物的乙醇溶液；
[0014] 4)向梅花葉提取物的乙醇溶液中加入1，2-丁二醇和步驟3)中保留的濾渣，在室溫 條件下超聲提取1~2h，再減壓蒸發，過濾，將濾液濃縮，利用色譜柱進行層析純化，梯度洗 脫，洗脫劑為石油醚-丙酮，濃縮收集的洗脫液，并進行真空干燥，得到所述的梅花葉提取 物。
[0015] 優選地，步驟1)中梅花葉和乙醇的質量比為1:20~30。
[0016] 進一步，步驟2)中用乙醇對梅花葉進行提取時，在無氧條件下進行。
[0017] 優選地，步驟3)中，超聲提取時，溫度為20~40 °C，時間為1~1.5h，所加入的1，2-丁二醇為步驟3)中得到的梅花葉提取物的乙醇溶液的5~20%，體積分數。
[0018] 步驟4)中，利用色譜柱層析純化時，用硅膠柱純化2~5次，用羥丙基葡聚糖凝膠柱 色譜純化2~5次，收集洗脫劑中石油醚和丙酮體積比在100:8~10時的洗脫液。
[0019] -種含有所述梅花葉提取物的組合物，包括:甘油2~7wt. %、丁二醇3~5wt. %、 1,2-戊二醇1~5wt. %、EDTA二鈉0· 1~0.4wt· %、甘油硬脂酸酯1~3wt. %、透明質酸鈉0~ 0. lwt. %、黃原膠1~10wt. %、梅花葉提取物2~8wt. %，余量為水。
[0020] 本發明的梅花葉提取物可用于制備化妝品，尤其是抗衰老類、美白類或/和保濕類 化妝品。
[0021] 本發明采用乙醇浸提和超聲提取結合的方法，提取出梅花葉中的槲皮素、異鼠李 素以及植物糖苷，由于槲皮素和異鼠李素對于乙醇的溶解度并不高，溶解速度慢，而加熱至 40~65°C的乙醇可以提高槲皮素和異鼠李素的溶解度，在超聲條件下可以加快槲皮素和異 鼠李素的溶出速度，
[0022] 本發明對梅花葉進行提取時，超聲頻率為60-lOOkHz，較高的超聲頻率可以加快成 分的溶出，并能夠提高溶質的溶解度，對臘梅提取物進行柱層析純化時，采用石油醚-丙酮 洗脫劑體系，梯度洗脫，獲取石油醚和丙酮的體積比在100:8~10時的洗脫液，得到的梅花 葉提取物含有豐富的槲皮素及其衍生物、異鼠李素及其衍生物及植物糖苷，具有減少紫外 線輻射，抗氧化等作用，從而保護皮膚細胞，該復合物也可以起到預防皮膚粉刺的作用，與 此同時可以減少色素沉積，抑制了色斑生成，使肌膚白皙鮮亮。
[0023]本發明的梅花葉提取物中含有0.5%~10.0%的槲皮素以及0.5~5.0%的異鼠李 素，槲皮素和異鼠李素都具備抗氧化效果，但槲皮素清除DPPH自由基的能力強于異鼠李素， 并且槲皮素可以促進皮膚毛細血管的抗性，緩解敏感性皮膚，異鼠李素在抑制脂質的過氧 化方面效果更好，可以防止皮膚表面的細胞細胞膜中的磷脂降解，保護了細胞膜的功能性， 有助于皮膚細胞的生長和活力保持。經過實驗分析，在本發明的提取物中，保持槲皮素相對 高的含量對于皮膚細胞的保護效果更佳，而僅有槲皮素，則缺少了對于皮膚細胞完整性的 保護，本發明用溫度在40~65°C的乙醇作為溶劑，在熱乙醇中，異鼠李素的溶解度相對有所 提高，但依然低于槲皮素的溶解度，更進一步，在本發明的梅花葉提取物中，異鼠李素和槲 皮素的質量比為1:1~3時，對皮膚細胞以及皮下毛細血管有良好的保護效果。
[0024]本發明的梅花葉提取物中含有50.0~70.0 %的植物糖苷，植物糖苷易溶于水和乙 醇，其完全來自于梅花葉，是純天然產物，將本發明獲得的高質量比重的糖苷，溶于溶劑后， 控制其比例，可以調節提取物溶液的滲透壓，加強皮膚細胞的對提取物的吸收，維持細胞的 滲透壓，改善皮膚生長的微環境。
[0025] 有益效果：
[0026]本發明的梅花葉提取物中的槲皮素和異鼠李素可以防止透明質酸等保水物質的 分解，使皮膚保持彈性，持久保持皮膚的活力，與此同時，還能減少色素沉積，具有美白功 效，抑制了色斑生成并增強皮膚的美白保濕能力，對于促進真皮中成纖維細胞產生膠原蛋 白有一定作用。
[0027] 本發明采用乙醇浸提和超聲提取結合的方法，對梅花葉進行提取，初步提取時利 用加熱至40~65°C的乙醇做提取劑，可以提高槲皮素和異鼠李素的溶解度，而在超聲條件 下，乙醇和1，2_丁二醇配合可以加快槲皮素和異鼠李素的溶出速度，使提取物中槲皮素和 異鼠李素的含量保持在較高水平。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發明實施例2中羥脯氨酸的標準曲線。
[0029] 圖2為本發明實施例2中羥脯氨酸的增長百分比。
[0030] 圖3為本發明實施例3中透明質酸的標準曲線。
[0031] 圖4為本發明實施例3中透明質酸的增長百分比。
【具體實施方式】
[0032]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0033]實施例1 一種梅花葉提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0034] 1)將50g梅花葉清洗、切碎、研磨；
[0035] 2)加入1L溫度為50°C的乙醇，梅花葉和乙醇的質量比保持在1:10~50,在密封避 光條件下，攪拌30min;
[0036] 3)過濾，收集濾液，保留濾渣，減壓蒸發濃縮，得到500毫升梅花葉提取物的乙醇溶 液；
[0037] 4)加入100mL 1，2_ 丁二醇，加入濾渣，室溫，在超聲條件下再次提取1.5h，減壓蒸 發，過濾，利用硅膠柱純化2次，用羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜純化2次，梯度洗脫，石油醚和丙 酮的體積比從1 〇 〇: 〇到1 〇 〇: 14，收集洗脫劑中石油醚和丙酮體積比在10 0:8~10時的洗脫 液，真空干燥，得到梅花葉提取物0.3g，其中槲皮素6mg、異鼠李素4mg、植物糖苷0.2g。
[0038] 實施例2
[0039] 羥脯氨酸是膠原蛋白中一種重要且含量穩定（占13.4%)的氨基酸，在彈力蛋白中 含量甚微，在其他蛋白中均不存在，因此，測定其含量是檢測膠原蛋白合成能力的可靠方 法，羥脯氨酸的檢測包括如下步驟：
[0040] 1.準備人的皮膚細胞
[0041]取正常人的真皮成纖維細胞作為原代細胞，于75cm2培養瓶中（含有生長因子的培 養基2ml )，37 °C、C02濃度為5 %的條件下培養細胞至80 %濃度，進行傳代，傳代細胞175cm2方 瓶中繼續培養細胞至80 %濃度，得到人真皮成纖維細胞。
[0042] 2.制備待測樣品
[0043]配制含有梅花葉提取物的精華液，精華液成分:甘油5.Owt. %、丁二醇4.Owt. %、 1,2-戊二醇3.0wt. %、EDTA二鈉0· lwt. %、甘油硬脂酸酯 1.5wt. %、透明質酸鈉0.05wt. %、 黃原膠4.0wt. %、梅花葉提取物5.0wt. %，余量為去離子水。
[0044]用含有10 %胎牛血清的DMEM培養液培養上述步驟培養得到的人真皮成纖維細胞， 37 °C，5 % C02培養24小時，待細胞接近融合，用含0.25 %胰蛋白酶和0.02 %EDTA的消化液消 化后按1:2傳代，選取第四代細胞，備用。
[0045] 用含有10%胎牛血清的DMEM培養液將第四代細胞稀釋至密度為105個細胞/ml，再 接種到12孔板中，接種量為5X10 4個細胞/孔，選取15個孔，其中5個孔為一組，設3組平行對 照，每組的5個孔內分別加入A樣品（精華液0.0 lmL+生理鹽水0.29mL)、B樣品（精華液0.05mL +生理鹽水0.25mL)、C樣品（精華液0. lmL+生理鹽水0.2mL)、D樣品（精華液0.3mL)和對照組 樣品（0.3mL生理鹽水），在37°C，5%⑶2條件下培養一天，之后分別收集A樣品、B樣品、C樣 品、D樣品和對照組樣品的培養上清液備用。
[0046] 3.繪制羥脯氨酸標準曲線
[0047] 配制6個輕脯氨酸標準品溶液，濃度依次為:Oyg/mL，3yg/mL，6yg/mL，12yg/mL，24μ g/mL，48yg/mL，用酶標儀測試上述標準品溶液在450nm波長下的0D值，測試結果參見表1;
[0048] 表 1
[0050]根據羥脯氨酸標準品的吸光度測試結果，以吸光度為縱軸，以羥脯氨酸濃度為橫 軸繪制羥脯氨酸的標準曲線，參見圖1;
[0051] 0D = 0 · 074 X c+0.2131，R2 = 0.9839，ρ = 0· 00009，
[0052] 其中，c為羥脯氨酸的濃度(yg/mL);
[0053] 即羥脯氨酸濃度 c = (0D-0.2131 )/0.074
[0054] 4.測定羥脯氨酸含量
[0055] 依照人羥脯氨酸酶聯免疫分析試劑盒說明書(上海酶聯生物科技有限公司），用試 劑盒中的溶劑將步驟2)中獲得的A樣品、B樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液稀 釋5倍后，分別測定其在450nm波長下的吸光度，根據繪制的羥脯氨酸濃度標準曲線計算A樣 品、B樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液中的成纖維細胞產生的羥脯氨酸的含 量，結果參見表2和圖2。
[0056] 表2
[0058] 由表3可以看出，與對照組相比，加入本發明的梅花葉提取物的組合物后，羥脯氨 酸的含量增加，隨著梅花葉提取物含量的增加，羥脯氨酸的濃度也在增大，但C樣品效果較 佳，具體參見圖2,因此，本發明的梅花葉提取物可以使皮膚的成纖維細胞分泌的膠原蛋白 的量提高。
[0059] 實施例3
[0060]對實施例2步驟2獲得的A樣品、B樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液進 行透明質酸含量測定，包括以下步驟：
[0061] 1.繪制透明質酸標準曲線
[0062 ] 配制6個透明質酸標準品溶液，濃度依次為：Oyg/mL，1 Oyg/mL，20yg/mL，40yg/mL， 80yg/mL，160yg/mL，利用酶標儀分別測試其在450nm下的OD值，測試結果參見表3;
[0063]表 3
[0065] 根據透明質酸標準品測試結果，以吸光度為縱軸，以透明質酸濃度橫軸繪制透明 質酸的標準曲線，參見圖3;0D = 0.0156 Xc+0.2083，R2 = 0.9841，p = 0.0001，其中，c為透明 質酸的濃度，單位yg/mL，經過換算，透明質酸濃度c = (0D-0.2083)/0.0156。
[0066] 2.測定透明質酸含量
[0067] 依照人透明質酸酶聯免疫分析試劑盒說明書，用試劑盒中的溶劑將實施例2步驟2 獲得的A樣品、B樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液稀釋5倍，其0D值，再計算透 明質酸含量，結果見表4和圖4。
[0068] 表 4
[0070] 由表4和圖4可以看出，加入本發明的梅花葉提取物的組合物后，皮膚成纖維細胞 分泌的透明質酸的量有顯著提高，提高皮膚的保水能力，可以保持皮膚濕潤。
[0071] 實施例4
[0072]在酪氨酸酶的作用下，左旋多巴（L-D0PA)氧化為棕褐色的多巴色素，在抑制劑的 存在條件下，該反應將得到抑制，測試本發明的梅花葉復合物對酪氨酸酶活性的抑制率，包 括如下步驟：
[0073]將本發明實施例2第2步驟獲得的A樣品、C樣品、D樣品和對照組樣品的培養上清液 各取0. lml，分別與預先在30°C恒溫水浴中保溫的2.8ml的L-D0PA底物溶液分別加入試管， 混勻，然后加入0 . lml的600單位/ml的酪氨酸酶溶液，充分混勻后于30°C進行水浴10分鐘， 使用分光光度計，于475nm處測定多巴色素的吸收峰值。
[0074]由測定的吸光度(0D值），計算原液稀釋液對酪氨酸酶活性的抑制率（％ )，參見表 5,其中，抑制率的計算公式如下：
[0075] 抑制率=[1-(T1-T2)/(C1_C2)]X100%
[0076] 上述計算公式中，
[0077] C1為未加試樣(A樣品、C樣品、D樣品）加酪氨酸酶的混合物所測的吸光度值；
[0078] C2為未加試樣(A樣品、C樣品、D樣品）也未加酪氨酸酶的混合物所測的吸光度值； [0079] T1為加入試樣(A樣品、C樣品、D樣品）和酪氨酸酶的混合物所測的吸光度值；
[0080] T2為加入試樣(A樣品、C樣品、D樣品）未加酪氨酸酶的混合物所測的吸光度值。
[0081]表 5
[0083] 由表5可以看出，本發明所得到的梅花葉復合物對于酪氨酸酶的活性有明顯的抑 制作用，隨著濃度升高，抑制作用加強，這可以抑制色斑的形成，起到使皮膚美白的作用。
[0084] 實施例5梅花葉提取物組合物的應用驗證
[0085] 清潔手臂，將本發明實施例2第2步驟的A樣品、C樣品、D樣品分別涂布在手臂上 2.5cm X 2.5cm的皮膚，并以生理鹽水為對照樣涂布在相同面積，分別在1小時、2小時、5小時 后觀察皮膚狀態并進行記錄，結果見表6。
[0086] 表 6
[0088] 由表6可以看出，加入本發明的梅花葉提取物組合物后，皮膚的鎖水能力提高，能 發揮較好的提亮作用，保持皮膚濕潤。
[0089] 本發明的梅花葉提取物可以促進皮膚膠原蛋白、透明質酸的產生，其中，對透明質 酸效果尤其明顯，可以在一定程度上抑制皮膚色素的產生，具有顯著的皮膚保水效果，改善 皮膚細胞的生長狀態，可以用于美白保濕類化妝品。
【主權項】
1. 一種梅花葉提取物，其各組分重量百分比為:槲皮素0.5~10.0%，異鼠李素0.5~ 5.0%，植物糖苷50.0~70.0%，槲皮素衍生物和異鼠李素衍生物5~10%，及不可避免的雜 質。2. 根據權利要求1所述的梅花葉提取物，其特征在于，所述的異鼠李素和槲皮素的質量 比為1:1~3。3. 如權利要求1或2所述的梅花葉提取物的制備方法，包括以下步驟： 1) 將梅花葉清洗、切碎、研磨； 2) 加入溫度為40~65 °C的乙醇，梅花葉和乙醇的質量體積比為1: 10~50，在密封避光 條件下，攪拌〇. 5~2h，得到混合物； 3) 將混合物過濾，收集濾液，保留濾渣，減壓蒸發至濾液體積減少50~70%，得到梅花 葉提取物的乙醇溶液； 4) 向梅花葉提取物的乙醇溶液中加入1，2_ 丁二醇和步驟3)中保留的濾渣，在室溫條件 下超聲提取1~2h，再減壓蒸發，過濾，將濾液濃縮，利用色譜柱進行層析純化，梯度洗脫，洗 脫劑為石油醚-丙酮，濃縮收集的洗脫液，并進行真空干燥，得到所述的梅花葉提取物。4. 如權利要求3所述的梅花葉提取物的制備方法，其特征在于，步驟2)中用乙醇對梅花 葉進行提取時，在無氧條件下進行，梅花葉和乙醇的質量體積比為1:20~30。5. 如權利要求3所述的梅花葉提取物的制備方法，其特征在于，步驟3)中，超聲提取時， 溫度為20~40°C，時間為1~1.5h，所加入的1，2-丁二醇為步驟3)中得到的梅花葉提取物的 乙醇溶液的5~20%，體積分數。6. 如權利要求3所述的梅花葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中，利用色 譜柱層析純化時，用硅膠柱純化2~5次，用羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜純化2~5次，收集洗脫 劑中石油醚和丙酮體積比在1 〇 〇: 8~10時的洗脫液。7. -種含有權利要求1或2所述梅花葉提取物的組合物，包括:甘油2~7wt. %、丁二醇3 ~5wt · %、1，2-戊二醇1~5wt · %、EDTA二鈉0 · 1~0 · 4wt · %、甘油硬脂酸酯1~3wt · %、透明 質酸鈉0~0.1 wt. %、黃原膠1~IOwt. %、權利要求1或2所述梅花葉提取物2~8wt. %，余量 為水。8. 如權利要求1或2所述的梅花葉提取物在化妝品中的應用。9. 如權利要求7所述的梅花葉提取物的組合物在化妝品中的應用。10. 如權利要求8或9所述的應用，其特征在于，所述的化妝品為抗衰老類、美白類或/和 保濕類化妝品。
【文檔編號】A61Q9/02GK105902440SQ201610393956
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】朱劍虹, 王智富, 朱侗明
【申請人】上海神因生物科技有限公司