雙功能癌癥治療劑的制作方法

專利名稱：雙功能癌癥治療劑的制作方法
技術領域：
本發明大體上涉及制備融合分子和使用該融合分子進行癌癥治療的方法學。
背景技術：
如Miller et al.，(eds)BIOLOGY OF FEMALE CANCERS，31-42(CRC Press，1997)所報道，人類乳腺癌是一種主要的惡性腫瘤，并且是西方女性癌癥死亡的主要原因。根據美國癌癥學會(AmericanCancer Society)最近的估計，每8名美國婦女中就有一名患有乳腺癌并且該病癥在1998將奪去43,500位婦女的生命。
多種類型的證據已經將促乳素(PRL)同乳腺癌發生緊密聯系起來。已經報道促乳素受體(PRLR)在人類乳腺癌細胞中的表達與正常乳腺上皮細胞相比較高(Reynolds et al.，1997)，在手術中除去的乳腺癌組織亦是如此(Touraine，Martini P.et al.，IncreasedExpression of Prolactin Receptor Gene In Human Breast TumorsVersus Continguous Normal Breast Tissues，(Abstract)79thAnnual Meeting of Endocrine Society，p.113，(1997))。惡性乳腺組織中的PRLR水平可以比其周邊正常組織高出5倍(見上文提及的Touraine等人(1997)的文獻)，這導致這些細胞對hPRL的刺激高度敏感。另外，據認為雌激素在乳腺中的一種促有絲分裂活性的機制可能影響了人類促乳素(hPRL)的產生和分泌，這是因為在PRLR、雌激素受體(ER)或者孕酮受體水平之間具有某種正相關(Sirbasku，1978；Dixon and Lippman 1986；Lippman and Dickson，1989)。綜合這些發現而產生了一種假說認為，hPRL作為一種自分泌/旁分泌的生長因子而在哺乳動物的癌癥發生中起著重要的作用(Clevenger，et al.，Am.J.Pathology，146695-705(1995)；Ginsburg，E.etal.，Cancer Res.，552591-2595(1995))。
PRL表達和前列腺疾病的聯系已經在Wennbo et al.，Endocrinol.1394410-4415(1997)中被提出。根據Aragona et al.，Endocrinol.97677-684(1975)以及Leake et al.，J.Endocrinol.，99321-328(1983)的報道，在前列腺組織中發現了PRL受體。另外，隨著年齡的增加可觀察到PRL水平的提高(Hammond et al.，Clin.Endocrinol.，7129-135(1977)，Vekemans et al.，Br.Med.J.4738-739(1975))，這與前列腺增生的發生相一致。過表達PRL基因的轉基因小鼠發生了前列腺的明顯增大(見上文提及的Wennbo等人(1997)的文獻)。
從PRL信號傳遞同乳腺和前列腺癌之間的聯系來看，PRL信號傳遞對于治療性發明是一個有吸引力的目標。然而，迄今沒有適當的藥物用于該目的。
免疫方法在癌癥治療中有良好的前景。有充足的證據表明癌細胞表達腫瘤特異性抗原并且患者具有可對這些抗原作出應答的T細胞(Boon，Toward T.，A genetic Analysis of Human Tumor RejectionAntigen，Advances in Cancer Research，58177-210(1992)；Urban，JL et al.，Tumor Antigens，Annu.Rev.Immuno.10617-644(1992))。然而，這些T細胞在許多情況下在同癌癥的對抗中是無反應性或者無效能的。迄今為止，對于腫瘤治療的免疫方法的主要努力在于增強針對腫瘤抗原的微弱的宿主免疫反應，例如通過細胞因子對患者的外源給藥。
在眾多被使用的細胞因子中，白細胞介素2(IL-2)已被證明具備有希望的效果。IL-Z為負責T淋巴細胞從細胞周期的G1期向S期進展的主要細胞因子(見，Morgan et al.，Science 1931007-1008(1979))。IL-2對淋巴細胞的主要作用如下(1)IL-2作為T淋巴細胞的主要自分泌生長因子決定了T細胞依賴性免疫反應的強度。(2)IL-2刺激了自然殺傷細胞(NK)細胞的生長并且增強其溶細胞效能，如在Hendrzak et al.，EXPERIMENAL AND CLINICAL AGENTS，263-282 Humana Press Inc.(1997)中的報道。
然而，已經有報道接受全身IL-2的癌癥患者通常可能會經受威脅生命的副作用，這限制了可用于給藥的總量從而直接影響了療效(見Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.3191676-1680(1988)；Maas，Immunobiolgy 188281-292(1993))。因此，針對IL-2在腫瘤治療中的主要努力已經集中于對副作用和有效劑量進行平衡之上，即，增強被用于給藥的IL-2的特異性(將IL-2精確地靶向于腫瘤位點)從而明顯地降低由高全身劑量而引起的副作用。
Forni G.，et al.，Immunol.1384033-4041(1987)證實了生理劑量的IL-2向腫瘤的直接注射導致了該腫瘤生長的抑制。這一原位應用的主要優點在于其降低了細胞因子的全身使用所帶來的毒性，但是該應用具有需要了解所有腫瘤的確切位置的缺點，該缺點在患有廣泛轉移的患者身上特別成問題。
降低毒性的進一步努力已經證明，以被轉染的可分泌IL-2的腫瘤細胞進行的注射可誘導針對未修飾的腫瘤細胞的特異的T細胞依賴性免疫，如Gansbacher et al.，J.Exp.Med.1721217-1224(1990)；Fearon et al.，Cell 60397-403(1990)；以及Pardoll，D.M.，Immun Today 14310-316(1993)。然而，Reisfeld etal.，Curr，Top.Microbiol Immunol.21327-53(1996)中指出，該方法的臨床應用既耗時又昂貴，這是因為該方法涉及到對患者的腫瘤細胞的分離、轉染和重新給藥。
最近引入了一種利用抗腫瘤單克隆抗體(mAb)的結合特異性以將細胞因子靶向于腫瘤位點的替代方法。見上文提及的Reisfeld etal(1996)的文獻。該方法綜合了mAb的獨特的靶向能力以及細胞因子的多功能活性并因此而在腫瘤微環境中獲得了IL-2的一種有效濃度。靶向的IL-2療法可在具免疫力的同基因小鼠中完全消除播散性肺部和肝臟鼠黑色素瘤轉移，如Gillies et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891428-1432(1992)；以及Sabzevari et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919626-9630(1994)。
這一靶向IL-2療法具有一些優點。例如，由于該療法并非直接細胞毒反應，因此該療法并不像其它mAb靶向方法那樣需要mAb-IL-2融合蛋白接觸所有的靶細胞從而獲得最大效果。見上文提及的Reisfeldet al(1996)的文獻。最重要的是，靶向IL-2療法的療效相關于一種長期的并且可轉移的保護性腫瘤免疫的誘導。由于該療法在腫瘤環境中對IL-2進行濃縮，這一mAb靶向的IL-2療法還有別于細胞因子基因來自體內的轉移，并且比其具有優勢，這使得該方法更具有臨床可行性。
盡管該靶向免疫療法在癌癥治療中顯示出前景，對抗PRL的效果和靶向IL-2進行組合的治療優點在癌癥治療中尚屬未知。因此，對開發藥劑和療法來用于對PRL在癌癥維持或者增殖中的作用進行對抗的同時增強該患者對癌癥的免疫反應的需要是存在的并且尚未滿足。
發明概要因此，本發明的一個目的在于提供一種藥物，該藥物能夠干擾癌細胞中的促乳素信號傳遞機制。
本發明的另一個目的在于提供一種藥物以在癌細胞中誘導細胞凋亡。
本發明的一個進一步的目的在于提供一種藥物，該藥物含有一種受體拮抗結構域以及一種正免疫調節結構域。
本發明的另一個目的在于提供一種方法以治療患有癌癥的患者，該治療通過在拮抗存在于一種靶癌細胞的上的受體的同時增強該患者對癌癥的免疫反應而進行。
本發明的另一目的是提供一種通過使用此處描述的藥物來治療癌癥的方法。
這些和其他通過閱讀以下的披露而更加明晰的目的已經可以通過本發明而達到。
在組合物方面，本發明基本涉及到一種蛋白質，該蛋白質含有一種受體拮抗結構域以及一種正免疫調節劑結構域。本發明進一步提供，該受體拮抗結構域可以為一種促進細胞凋亡的結構域，而該正免疫調節劑結構域可為一種白細胞介素。該受體拮抗區域還可以為SEQID NO1的氨基酸序列或者其保守變體。
在方法學方面，本發明涉及到一種用于治療癌癥的方法，該方法包括以一種有效量的蛋白質進行給藥，該蛋白質具有一種受體拮抗結構域以及一種正免疫調節劑結構域。本發明進一步提供了一種方法學，該方法學用于以本文所描述的任何蛋白質來對患者給藥附圖簡述

圖1為本發明的雙功能分子的一個圖示。(A)上文提及的Reisfeld等人(1996)的文獻中提出的mAb-IL-2融合蛋白模型，以及(B)本發明的hPRLA-IL-2融合蛋白。
圖2為本發明的雙功能融合蛋白的一個被提出的作用機制的圖示。由乳腺癌細胞所產生的PRL由于融合蛋白(PRLA)的占據而受阻不能接觸PRLR。同時，該融合蛋白的IL-2部分刺激了抗腫瘤T細胞反應。
圖3所示為在T-47D人類乳腺癌細胞中的hPR1-G129R的反應于劑量的抑制效果以及hPRL的刺激效果，該實驗使用共培養方法。x軸為共培養的L細胞(對照、L-PRL或者L-hPRL-G129R細胞)數。各數據點為至少3份孔中的3組獨立實驗的平均。
圖4所示為hPRL-G129R在T-47D人類乳腺癌細胞增殖分析中的反應于劑量的抑制效果及其對4-羥基-他莫昔芬的添加效果。x軸為在不存在(空白條)和存在4-羥基-他莫昔芬下的hPRL-G129R濃度。各數據點為至少3個孔中的3組獨立實驗的平均。
圖5為pUCIG-MT-hPRL-IL-2融合蛋白cDNA的表達質粒的克隆和構建的圖示。
優選實施方案的詳述本發明的發明者已經發現，基于內分泌的療法和靶向性細胞因子的療法的組合效果極大地加強了對癌癥的治療。例如，本文所披露的治療產品和方法作用于通過阻斷PRLR來抑制內源PRL的自分泌/旁分泌效應，這在典型的情況下導致細胞凋亡。另外，該方法正調節了一種免疫反應，由此而在惡性組織中特異地誘導了腫瘤特異的T淋巴細胞的細胞毒作用。
本文所使用的“細胞凋亡”指的是一種過程，通過該過程，發育或者環境的刺激激活了一種遺傳程序從而實現一系列特異性的事件，這些事件最后結束于細胞的死亡以及有效地清除。該細胞中的形態學變化包括細胞體積的顯著皺縮，伴隨有內質網的膨脹以及質膜的卷疊。隨后，這導致該細胞破碎成為一系列的膜包圍的小體，該小體含有結構上正常然而卻是緊密的細胞器。該細胞核經過了不連續的染色質濃縮并且進行了核酸酶介導的DNA片段化，這樣將染色體DNA降解成為小的寡核小體片段。細胞核和細胞質進行濃縮并且瀕死的細胞最終碎片化成為膜結合的細胞凋亡小體，該小體被巨噬細胞或者鄰近的細胞迅速地吞噬并且消化。
本發明通過利用一種多結構域的分子對阻斷PRLR的優點和免疫反應正調節的優點進行了綜合，該分子的各結構域都具有實施這些功能的其中一種的能力。典型的分子具有一種“受體拮抗結構域”或者一種“細胞凋亡促進結構域”，該結構域同一種“正免疫調節劑結構域”相結合。
本文所使用的“受體拮抗結構域”為一種配體，該配體同一種受體特異地結合，該受體相關于一種疾病，如癌癥，通過結合于該受體，該受體拮抗的結構域作用于抑制一種或者多種細胞進程，由此干擾了該疾病的發生或者維持。這樣的一個誘導細胞凋亡的結構域在本文稱為“細胞凋亡促進結構域”，而“正免疫調節劑結構域”為一種增強免疫反應的結構域，在優選的情況下增強針對諸如癌細胞這樣的異常細胞的免疫反應。這樣的一種免疫反應在典型的情況下涉及到募集T細胞并且加強其功能，例如細胞毒功能。
具有這些特征的一種融合蛋白的優點眾多。例如，致癌組織通常的特征在于一種或者多種蛋白受體水平的提高。含有對這些受體之一具有特異性的結構域的融合蛋白將能夠被特異地定向于該癌組織。當該受體拮抗結構域如同一種細胞凋亡促進結構域一樣破壞該癌癥的發生或者破壞癌癥的維持情況下，該分子的受體拮抗部分具有直接治療效果。另外，由于該正免疫調節劑結構域的存在，該分子通過誘導該患者特異針對該疾病組織進行應答的自體免疫系統而具有了第二種療效。
因此，接受本發明的療法的候選對象包括患有惡性腫瘤的個體，這些惡性腫瘤的特征在于至少存在一種與腫瘤的維持或者增殖相關的受體。在一個優選的實施方案中，該融合蛋白的受體拮抗結構域為一種細胞凋亡促進結構域，該結構域同一種被靶定的膜結合受體相結合。這樣的結合誘導了細胞凋亡；同時，該正免疫調節劑結構域誘導了對T淋巴細胞細胞毒作用的腫瘤特異的募集作用以及加強。本發明的雙功能蛋白質本發明考慮了一些雙功能蛋白質，這些雙功能蛋白對于惡性組織具有獨特的雙重治療效果，即(a)受體拮抗的和/或細胞凋亡促進(這些可以是同一種功能)以及(b)正免疫調節。本發明還考慮一些編碼本發明的雙功能蛋白質的核酸(例如DNA或者RNA)。受體拮抗結構域本發明設計了第一種結構域，該結構域在一方面可以將該正免疫調節劑結構域的作用定位于病變組織。例如，致癌組織的特征通常在于一種或者多種蛋白質受體水平的提高。含有對于這些受體之一具有特異性的結構域的融合蛋白將能夠特異地靶向于該癌組織，結果導致一種針對被靶定的組織的定位腫瘤細胞毒反應。
在一個實施方案中，靶向于一種特定的受體位點的結構域為一種受體拮抗結構域，該結構域顧名思義結合并且拮抗其相關受體。在一個優選的實施方案中，該受體拮抗結構域為一種細胞凋亡促進結構域。這一利用了一種受體拮抗結構域的靶向治療方法經設計用于提供正免疫調節劑結構域(如LL-2)的顯著降低的全身濃度，由此而降低了其在體內的毒性。
這一雙功能分子的額外的治療優點在于該受體拮抗結構域在典型的情況下具有內分泌阻斷能力。由此，當該受體拮抗結構域為一種促乳素拮抗劑時，促乳素的正常內分泌功能將被破壞。對于促乳素及其類似分子，該內分泌阻斷的結果為，例如，導致其所靶定細胞的細胞凋亡。在該情況下，該受體拮抗結構域也是一種細胞凋亡促進結構域。
對于細胞凋亡促進結構域，這樣的一種結構域通常通過產生一種細胞組分的正常功能的拮抗劑來進行設計，該細胞組分參與細胞凋亡的阻止。例如，在乳腺和前列腺組織中，癌發生和惡性細胞的增殖至少在部分上受到PRLP水平的提高的刺激。經過PRLR的信號傳遞已知由促乳素受體的二聚化所介導，該受體的二聚化本身受到結合受體的促乳素分子的二聚化所介導。內源PRL同兩個PRLR的結合誘導了PRLR的二聚化，由此而引發了信號向癌細胞內的轉導。因此，本發明的一個實施方案需要使用一種促乳素拮抗劑(PRLA)(即，一種促乳素拮抗劑結構域)來拮抗促乳素的正常的細胞凋亡抑制功能。
PRLR信號傳遞途徑中的信號轉導涉及到轉錄的信號轉導物及激活劑(STAT)的磷酸化，這是PRLR激動的正常結果。因此，G129R拮抗劑通過抑制STAT5磷酸化而在人類乳腺癌細胞中促進凋亡。因此，對PRLR的阻斷抑制了內源PRL的涉及到STAT5的自分泌/旁分泌效應并且導致了細胞凋亡。由此，本發明所設計的一種類型的細胞凋亡促進化合物為一種可抑制STAT5磷酸化的化合物。
本發明所設計的一種適當的PRLR通常應保持對PRLR的特異結合特性，還應具備一些結構上的缺陷，該缺陷破壞了正常的PRL細胞凋亡阻斷機制。這樣的一種結構缺陷包括了破壞PRL二聚化(從而破壞PRLR二聚化)的缺陷。
在一個優選的實施方案中，如SEQ ID NO1所示，這一結構缺陷為對應于hPRL的129位上的Arg對Gly的取代(稱之為hPRL-G129R)。圖3和4以及實施例4、5和6中的基于細胞的分析顯示，這一突變hPRL作為一種真正的hPRLR拮抗劑發揮作用。因此，諸如hPRL-G129R這樣的一種受體拮抗結構域可作為一種治療特定類型的癌癥的治療藥物來發揮作用。
本實施方案為Chen et al.，Clin.Can.Res.53583-93(1999)所支持，他們披露了在PRL的第三個α-螺旋區域中的氨基酸序列的種間比較，見表1。
表1物種 結構域 肽序列 129肽序列人類 PRL IEEQTKRLLR G MELIVS-QVHP大鼠 PRL IEEQNKRLLE G IEKIIG-QAYP小鼠 PRL IEEQNKQLLE G VEKIIS-QAYP倉鼠 PRL IGEQNKRLLE G IEKILG-QAYP長須鯨 PRL EEEENKRLLE G MEKIVG-QVHP貂 PRL IEEENRRLLE G MEKIVG-QVHP牛 PRL IEEQNKRLIE G MEMIFG-QVIP羊 PRL EEEENKRLLE G MENIFG-QVIP豬 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-QVHP駱駝 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-QVHP馬 PRL EIEQNRRLLE G MEKIVG-QVQP象 PRL VKEENQRLLE G IEKIVD-QVHP原始哺乳類 PRL IEEENKRLLE G MEKIVG-QVHP雞 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-RVHS火雞 PRL IEEQDKRLLE G MEKIVG-RIHS海龜 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-QVHP鱷魚 PRL IEEQNKRLLE G MEKIIG-RVQP短吻鱷 PRL IEEQNKRLLE G MEKVIG-RVQP原始羊膜動物 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-QVHP爪蟾 PRL VEEQNKRLLE G MEKIVG-RIHP牛蛙 PRL VEEQTKRLLE G MERIIG-RIQP肺魚 PRL VEDQTKQLIE G MEKILS-RMHP羅非魚 PRL MQQYSKSLKD G LD-VLSSKMGS羅非魚 PRL MQEHSKDLKD G LD-ILSSKMGP鯉魚 PRL LQENINSLGA G LEHVF-NKMDSbighead carp PRL LQDNINSLGA G LERVV-HKMGS銀鯉 PRL LQDNINSLVP G LEHVV-HKMGS馬蘇大麻哈魚 PRL LQDYSKSLGD G LD-IMVNKMGP大鱗大麻哈魚 PRL LQDYSKSLGD G LD-IMVNKMGP鱒魚 PRL LQDYSKSLGD G LD-IMVNKMGP物種 結構域 肽序列 120肽序列人類 GH VYDLLKDLEE G IQTLMRELEDG牛 GH VYEKLKDLEE G ILALMRELEDG根據表1，很清楚hPRL的Gly129在PRL中是不可變的，這暗示了該氨基酸在其功能中的一種重要作用。因此，將Gly129取代為任何氨基酸將在這些物種中產生PRLA(Chen et al.，Molec.Endocrinol.(1995))。在一個實施方案中，通過以相對較大側鏈的氨基酸進行取代而產生了一種拮抗劑，例如以Arg取代Gly129。因此，本發明的一個方面設計了PRL的保守變體，該PRL的特征為在特定位置上存在一種相對較小的側鏈氨基酸(例如Gly)，這樣使以一種較大側鏈的氨基酸對該小側鏈氨基酸進行的取代將導致該蛋白質的一種拮抗形式。
本發明的受體拮抗結構域還包括本文所討論的受體拮抗結構域的保守變體。在這一方面，本發明結構域的總體結構和組成僅僅在于其產生了適當的功能特征才是重要的，即，受體拮抗性、細胞凋亡的誘導、正免疫調節。
本發明的保守變體一般在該蛋白質結構域的整體分子結構上是保守的。如果已知包括被披露的蛋白質產品的個體氨基酸的特征，一些合理的取代將是很明顯的。例如，氨基酸取代，即“保守取代”可根據所涉及的殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或雙親性質上的相似性而產生。
例如(a)非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸；(b)極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)正電(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸(d)負電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在典型的情況下取代在(a)-(d)的組內進行。另外，甘氨酸和脯氨酸由于其破壞α-螺旋的能力而可以互相取代。類似地，特定的氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和賴氨酸常見于α-螺旋內，而纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及蘇氨酸通常見于β-折疊內。甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺以及脯氨酸常見于轉角內。一些優選的取代可在以下組間進行(i)S和T；(ii)P和G；(iii)A、V、L和I。如果已知遺傳密碼以及重組和合成DNA技術，技術人員可容易地構建編碼該保守氨基酸變體的DNA。
這些保守變體在具體情況下設計有對在此描述的受體拮抗結構域進行的截短。截短可在N-或者C-末端進行，但通常不要刪除該天然分子的約30％以上。更優選的情況下該天然分子的低于約20％被刪除，最優選的情況下低于約10％的部分被刪除。
通常情況下，本發明的DNA和蛋白質均可以參照“序列同一性”進行限定。一些分子具有至少約50％、55％或者60％的同一性。優選的分子為那些具有至少約65％的序列同一性的分子，更優選的情況下具有至少約65％或者70％的序列同一性。其它的優選分子具有至少約80％的序列同一性，更優選的情況下具有至少80％或者85％的序列同一性。特別優選的分子具有至少約90％的序列同一性，更優選的情況下具有至少90％的序列同一性。最優選的分子具有至少約95％的序列同一性，更優選的情況下具有至少95％的序列同一性。如本文所使用，兩種核酸分子或者蛋白質在兩者含有具備高于85％的序列(氨基酸或者核酸)同一性的區域的情況下被稱為“具有明顯的序列同一性”。
“序列同一性”在本文參照Blast2算法使用缺省參數(Blast2algorithm)進行定義，該算法可見于NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。與該算法相關的參考文獻有可見于http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_references.html的文獻；Altshchul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.&Lipman，D.J.(1990)“Basic local alignment search tool.”J.Mol.Biol.215403-410；Gish，W.& States，D.J.(1993)“Identication of protein coding regions by databasesimilarity search.”Nature Genet.3266-272；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.& Zhang，J.(1996)“Application of network BLASTserver”Meth.Enzymol.266131-141；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation ofprotein database search programs.”Nuleic Acids Res.253389-3402；以及Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)“PowerBLASTa new network application for interactive or automatedsequence analysis and annotation.”Genome Res.7649-656。因此，包括表1所列出的來自不同物種的促乳素肽序列可使用諸如BLAST這樣的標準計算機程序進行比對以獲知在促乳素衍生的受體拮抗結構域中的進一步的變異，這些變異保存了該結構域的基本功能。
除本文所披露的保守變體蛋白之外，本發明還規劃了一些蛋白質的用途，這些蛋白質在誘導腫瘤增殖中起著重要的作用，在其中一個氨基酸的取代將抑制該蛋白質誘導這種增殖的能力。例如，牛生長激素(bGH)和hGH的Gly119和Gly120分別在GH的刺激生長增強的作用中扮演重要的角色。生長激素受體(GHR)的二聚化被認為是HG信號轉導的關鍵一步。因此，在這些位點上的任何氨基酸的取代(除丙氨酸之外)，特別是諸如Arg這樣的具有較大側鏈的氨基酸的取代將阻止受體的二聚化，結果產生了一種生長激素的拮抗物(GHA)。因此，諸如GHA這樣的拮抗物也被本發明所考慮到。
除了拮抗一種參與防止細胞凋亡的細胞組分的正常功能之外，本發明進一步在細胞凋亡促進結構域范圍內設想了一些通過正性方法誘導細胞凋亡的試劑。這些試劑并不是通過對一種抗細胞凋亡的途徑進行拮抗而發揮作用；而是誘導某種細胞凋亡途徑。這樣的作用物的例子包括蛋白激酶C(PKC)抑制劑，包括白屈菜紅堿。
苯菲啶生物堿白屈菜紅堿(1，2-二甲氧基-12-甲基[1，3]benzodioxolo[5，6-c]phenanthridinium；C21H18NO4)，亦稱白屈菜赤堿，可以從白屈菜，野花椒，Sanguinaria candensis(或bloodroot)，博落回，Carydali sevctocozii，Carydali ledebouni，Chelidonium ma jusm以及罌粟科的其它成員中以純凈物的形式或者以同其它苯菲啶生物堿的混合物形式提取。
PKC的抑制劑可同底物結合位點(ATP或者蛋白質)或者發生激活的調節結構域(二酰基甘油或者佛波酯結合位點)進行結合。白屈菜紅堿直接同PKC的催化結構域相作用。它是PKC的已鑒定的最強力的抑制劑之一并且對任何其它蛋白抑制劑均不表現出抑制作用。例如，白屈菜紅堿對L-1210腫瘤細胞通過抑制細胞生長和分化而表現出強的細胞毒效應，其IC50值為0.053μm，如Herbert et al.，Bioechem.Biophys.Res.Commun.172993(1990)中的討論。白屈菜紅堿通過以依賴于濃度的方式特異地抑制PKC并且強烈地抑制由諸如花生四烯酸和膠原蛋白所誘導的血小板聚集。
由此，通過引入于腫瘤細胞，白屈菜紅堿氯化物可降低細胞凋亡的閾值并且在該處引發細胞凋亡。在當白屈菜紅堿療法同其它治療方法聯合使用時這一效果特別屬實。因此，本發明設計了一種融合分子，該融合分子包含有白屈菜紅堿，該白屈菜紅堿融合于另一種用于抗癌的分子，例如一種正免疫調節劑結構域。一種含有白屈菜紅堿的分子可以通過化學方法，例如使用多功能交聯劑同另一種分子(即，本文所描述的結構域)進行融合。基于蛋白質的PKC抑制劑可被制成為融合蛋白質。正免疫調節劑結構域本發明還設計了一種另外的而且是分離的結構域，該結構域作為一種正免疫調節劑而發揮作用。優選的免疫調節劑結構域支持針對腫瘤的陽性免疫反應。一種合適的正免疫調節劑包括一種細胞因子，該因子向該腫瘤進行T淋巴細胞的募集，由此而在該惡性組織中誘導了腫瘤特異的T淋巴細胞的細胞毒作用。在一個優選的實施方案中，該正免疫調節劑為IL-2，該免疫調節劑的特征在于其控制T細胞依賴性的免疫反應的強度的能力。IL-2對于巨噬細胞和單核細胞同樣具有活性。另外，IL-2刺激自然殺傷(NK)細胞的生長并且增強其溶細胞效能。
除IL-2外。本發明還考慮了其它的具有這些或者類似特征的分子，包括其它的細胞因子。例如，IL-12可作為該正免疫調節劑結構域。IL-12對于介導T細胞對Th1類型的反應是一種關鍵性的細胞因子。IL-2由B細胞和單核/巨噬細胞所產生并且同IL-2協同作用以誘導T細胞和NK細胞產生IFNγ。它還增強了T細胞和NK細胞的細胞毒作用。本發明還包括上述正免疫調節劑結構域的保守變體(如上文所詳述)。
用于該正免疫調節劑結構域的其它合適的備選物包括干擾素(IFN)。例如，已知IFN-β可單獨抑制腫瘤細胞增殖。IFN-β對于巨噬細胞抗腫瘤活性是一種通用激活物。因此，一種含有同細胞凋亡促進結構域相結合的IFN-β將對靶定組織提供局部化的正免疫調節治療。示例性的雙功能分子的制備本發明所設想的雙功能蛋白質為一種含有上述的各個結構域的蛋白質，即含有受體拮抗(還可以促進細胞凋亡)結構域和正免疫調節結構域，通過這樣的融合，兩結構域均基本維持了其相關的特征而獨立于對方。根據這些特征，圖2披露了本發明的一種實施方案。盡管在典型的情況下以融合蛋白的形式產生，這些結構域也可通過傳統的化學方法進行融合，例如使用多功能交聯劑。在制備這些融合蛋白時，兩個結構域均可被置于對方的C-末端或者N-末端。
在一個實施方案中，該融合蛋白質為一種hPRLA-IL-2蛋白，如圖1所示。該融合蛋白質可被整合入一種表達載體，如實施例1和圖5所示。所產生的表達載體可隨后被轉染入一種穩定的細胞系以隨后產生一種純化蛋白。實施例2和3為實施該載體的轉化和純化過程的一種非限定的程序。該融合蛋白將PRLA的C-末端融合入IL-2的N-末端，該蛋白質在圖5中顯示。然而，本發明還設想了任何具有本文所描述的結構域的融合蛋白質。
用于產生該融合蛋白質的適當的方法應該是一種基本上不改變這些結構域的生物學活性的方法。例如，已經表明IL-2的N-末端同一種抗體的C-末端的融合并不改變IL-2的生物學活性，見上文提及的Reisfeld等人(1996)的文獻。因此，一種類似的策略可經調整以適合于產生本發明的融合蛋白質。該過程包括設計一種編碼融合蛋白質的cDNA，該蛋白質將該正免疫調節劑結構域的N-末端同該受體拮抗結構域的C-末端相連接。
有證據進一步表明hGH的C-末端(我們刪除了最多達10個氨基酸)對于其在轉基因小鼠中的生長促進活性并不重要(Chen等人，1993)，并且根據結構相似性，一種正調節劑同諸如hPRLA這樣的其它受體拮抗結構域的C-末端的融合不應改變這些結構域的結合親和性。
本發明并不限于在此所考慮的任何用于產生所需融合蛋白質的特定方法。但是，根據所考慮的生產的重組方法，本發明提供了重組DNA構建體，該構建體含有一種或者多種本發明所描述的結構域的核苷酸序列。本發明的重組構建體包括一種載體，例如一種質粒或者病毒載體，在其中以任意方向插入有一種DNA或者DNA片段，在典型的情況下該DNA或DNA片段帶有一種開放讀碼框架。本發明進一步考慮了含有這些載體的細胞。
重組蛋白質的生產在該領域是眾所周知的并且在下文簡述。細菌表達用于細菌的有用的表達載體通過將一種編碼所需蛋白質的結構DNA序列同功能性的啟動子插入而構建，該結構DNA同適當的翻譯起始和終止信號一起處于可操作的讀碼狀態中。該載體應含有一種或者多種表型選擇標記以及一個復制起點以確保該載體的在宿主中的維持并且在需要時提供在其中的擴增。用于轉化的適當的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、傷寒沙門氏菌以及假單胞菌屬、鏈球菌屬以及葡萄球菌屬中的多個菌種，盡管出于選擇的問題其它菌種可能也被使用。在優選的實施方案中，該原核宿主為大腸桿菌。
細菌載體可以是，例如，基于細菌噬菌體、質粒或者粘粒的載體。這些載體可含有一種選擇標記以及細菌復制起點，它們來自于商業化的質粒，這些商業化的質粒在典型情況下包括著名的載體pBR322(ATCC37017)。這樣的商業載體包括，例如，GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)、pBs、phagescfipt、PsiX174、pBluescriptSK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Statagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pKK232-8、pDR540以及pRIT5(Parmacia)。本發明的一種優選的載體為THE Pt71表達載體(Paris et al.，Biotechol.Appl.Biochem.12436-449(1990))。
這些“骨架”部分同一種適當的啟動子以及待表達的結構序列進行結合。細菌啟動子包括lac、T3、T7、lambda PR或者PL、trp以及ara。T7為優選的細菌啟動子。
在對某種適當的宿主菌株進行轉化并且該宿主菌株生長至適宜的細胞密度后之后通過適當的手段對該被選中的啟動子進行去抑制/誘導(例如，溫度改變或者化學誘導)，并且將這些細胞進行額外的培養。一般通過離心來收集這些細胞，以物理或者化學方法進行破碎并且保留所產生的粗抽提物以用于進一步的純化。真核表達多種哺乳動物細胞培養系統也可被用于表達重組蛋白質。哺乳動物表達系統的例子包括經選擇的小鼠L細胞，例如胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(TK)以及腺苷磷酸核糖轉移酶缺陷(APRT)細胞。其它的例子包括猴腎成纖維細胞COS-7細胞系，該細胞系由Gluzman，Cell 23175(1981)所描述，還包括其它能夠表達可相容載體的細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa以及BHK細胞系。哺乳動物表達載體應包括一個復制起點、一個適當的啟動子以及增強子，并且還應包括任何必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列以及5’側翼非轉錄序列。來源于SV40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點、早期啟動子，增強子，剪接體以及聚腺苷酸化位點可被用于提供所需的非轉錄遺傳元件。
哺乳動物啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、來自于逆轉錄病毒的LTR以及小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。示例性的哺乳動物載體包括pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG以及pSVL(Pharmacia)。在一個優選的實施方案中，該哺乳動物表達載體為pUCIG-MET。選擇標記包括CAT(氯霉素轉移酶)。
在哺乳動物宿主細胞中可以使用一些基于病毒的表達系統。在使用腺病毒作為一種表達載體的情況下，該目的編碼序列可被連接于一種腺病毒轉錄/翻譯控制復合體，例如晚期啟動子和三聯前導序列。這一嵌合基因可隨后通過體外或者體內重組而被插入腺病毒基因組。在該病毒基因組的非關鍵區域(例如，區域E1或者E3)中的插入將產生一種重組病毒，該重組病毒可以存活并且在被感染的宿主中表達一種靶蛋白。(例見Logan et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA813655-3659)。治療組合物本發明的蛋白質可根據已知的方法進行制劑化以制備成可用于醫藥的組合物，由此本發明的分子或其功能衍生物同一種藥學可接受的載體介質組合成混合物。包括諸如人類血清白蛋白這樣的其它人類蛋白在內的適當的介質及其制劑，在諸如Remington’s PharmaceuticalSciences(16thed.，Osol，A.，Ed.，Mack，Easton PA(1980))這樣的書籍中有所描述。為形成一種適于有效給藥的藥學可接受的組合物，這樣的組合物中應含有一種或者多種有效量的本發明的蛋白質，以及一種適量的載體介質。
用于本發明的藥物組合物可以通過傳統方式使用一種或者多種生理可接受的載體或者賦形劑進行制劑化。由此，該雙功能分子及其生理可接受的鹽和溶劑化物可經制劑化，以用于吸入或者吹入(通過口腔或者鼻腔)或者口服、經頰、腸外或者直腸給藥。
對于口服給藥，該藥物組合物可通過傳統方法同藥學可接受的賦形劑制成諸如藥片或者膠囊這樣的形式，該賦形劑的例子如粘合劑(如，預膠凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或者羥丙基甲基纖維素)；填充物(如乳糖、微晶纖維素或者磷酸氫鈣)；潤滑劑(如，硬脂酸鎂、滑石粉或者二氧化硅)；崩解劑(如，馬鈴薯淀粉或者淀粉羥乙酸鈉(sodium starch glycolate))；或者濕潤劑(如月桂基硫酸鈉)。該藥片可通過本領域所已知的方法進行包被。用于口服給藥的液體制劑可以制成諸如溶液、糖漿或者懸浮物這樣的形式，或者它們可以是以水或者其它適當的介質在使用前進行構造的干態產品。這樣的液體制劑可通過傳統方法藥學可接受的添加劑進行制備，該添加劑的例子如懸浮劑(如，山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或者氫化食用脂肪)；乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯樹膠)；無水載體(如杏仁油、油性酯、乙醇或者分餾植物油)；以及防腐劑(如甲基或者丙基-對-羥基苯甲酸鹽或者山梨酸)。這些制劑在適當的情況下還可以含有緩沖鹽、調味劑、著色劑以及甜味劑。
用于口服給藥的制劑可經過適當地制劑化以提供活性化合物的控制釋放。對于經頰給藥，該組合物可以藥片或者錠劑的形式通過傳統方式制劑化。
對于吸入給藥，用于本發明的應用的雙功能分子可以以一種氣溶膠噴霧的形式進行方便地遞送，該氣溶膠噴霧是通過使用適當的推進劑由氣溶膠包或一種噴霧器而產生，該推進劑的例子如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或者其它適當的氣體。對于壓縮氣溶膠，該劑量單位可通過提供一種閥門來測定，以此遞送經測定的藥量。用于吸入器或者吹入器的諸如凝膠這樣的物質的膠囊或者藥筒可經制劑化而含有該化合物同一種適當的粉基的粉狀混合物，該粉基的例子如乳糖或者淀粉。
該雙功能蛋白質可經制劑化以用于通過注射進行的腸外給藥，例如通過丸劑注射或者連續輸注。用于注射的制劑可以為含有添加的防腐劑的單位劑量形式，該制劑處于諸如安瓿瓶或者多劑量容器這樣的容器中。該組合物可以為處于水相或者油相載體中的懸浮液、溶液或者乳劑形式，并且可含有制劑化物(formulatory agent)，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，該活性成分可以為一種用于在使用前以適當的介質進行構建的粉末，適當的介質的例子如無菌的無致熱源水。
這些化合物還可被制劑化于諸如栓劑或者保留灌腸劑這樣的直腸給藥組合物中，例如，含有諸如可可油或者甘油酯這樣的傳統栓劑基的保留灌腸劑。
除上文所描述的制劑外，該雙功能分子還包括還可被制劑化為一種貯存制劑。這樣的長期作用制劑可通過植入(例如皮下植入或者肌內植入)或者通過肌內注射來進行給藥。由此，例如，該化合物可以以適當的聚合物或者疏水材料(例如一種可接受的油中的一種乳劑)或者離子交換樹脂進行制劑化，或者制劑化成為微溶的衍生物，例如微溶的鹽類。
如果需要，該組合物可以處于一種藥囊或者分散器設備中，這些容器可含有一個或者多個含活性成分的單位劑型。該藥囊可含有金屬或者塑料箔，例如一種泡狀藥囊(blister pack)。該藥囊或者分散器設備可附帶有給藥的說明。
由于這些組合物可用于癌癥治療，它們可以連同傳統的化療劑一起進行制劑化。傳統的化療劑包括烷化劑、抗代謝物、多種天然產品(例如，長春堿類、表鬼臼毒素、抗生素以及氨基酸缺失的酶)、激素以及激素拮抗劑。藥劑的具體類別包括氮芥、烷基磺酸鹽、亞硝脲、三氮烯、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑復合物、腎上腺皮質抑制劑、腎上腺皮質激素、孕酮、雌激素、抗雌激素和雄激素。一些示例性的化合物包括環磷酰胺、苯丁酸氮芥、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、硫鳥嘌呤、長春花堿、長春新堿、阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、順鉑、羥基脲、強的松龍、己酸羥基孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、二乙基己烯雌酚、乙炔基雌二醇、他莫西芬、丙酸睪丸酮以及氟羥甲睪酮。在治療乳腺癌中，例如，他莫西芬特別地優選。發明方法治療方法本發明的治療方法通常使用了上文所確定的雙功能蛋白質。該融合蛋白質的結構域共享了特異地靶向于一種特定組織以及/或者增強一種針對該靶定組織的免疫反應的能力。因此，一種典型的方法涉及到將某種靶定細胞的一種受體結合于該融合蛋白的受體拮抗結構域并且/或者通過該正免疫調節劑結構域刺激一種T細胞依賴性的免疫反應。
治療方法涉及到以一種治療有效量的融合蛋白質對需要治療的對象進行給藥。“治療有效”在此被用于表示融合蛋白質在量上足以抑制或者逆轉癌的生長(例如，誘導細胞凋亡)。一些方法設計了結合已知的癌癥藥物或者諸如化療(在優選的情況下使用上文列出的種類的化合物)和放療這樣的療法而進行的綜合治療。該患者可以為分類或者非人類動物。一名患者在典型的情況下當患有一種癌癥時需要治療，該癌癥的特征在于促進癌癥維持或者增殖的受體水平的提高。
在體內治療期間進行的給藥可通過任意數量的途徑進行，包括腸外或者口服，但優選的為腸外給藥。可以使用囊內、靜脈內、鞘內以及腹膜內給藥途徑，通常靜脈內途徑是優選的。技術人員將會認同給藥途徑應當根據待治療的疾病而變化。
根據本發明，對該雙功能蛋白質的治療有效量的確定大體上應根據特定的患者特征、給藥途徑、以及待處理的疾病的特性。一般性的指導可見于Harmonisation的國際會議的出版物以及REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第27和28章，pp.484-528(MackPublishing Company 1990)。
具體確定一種治療有效量應根據諸如藥物的毒性和效力這樣的因素進行。毒性可使用該領域所熟知的方法進行測定，該測定可見于上文的參考文獻。效力使用同樣的說明，聯合下文實施例所描述的方法進行測定。因此，藥學有效量為一種被臨床醫生認為在毒性上是可耐受的并且還是有效的藥量。例如，可通過對該靶定組織中的T淋巴細胞毒性的誘導或者實質上的誘導或者通過該靶定組織的在量上的減少來測量效力。適宜的劑量可能從約1mg/kg到10mg/kg。用于測定該融合蛋白質的生物活性的篩選分析本發明還提供了基于細胞的分析系統，該分析系統可被用于對該細胞凋亡促進結構域、正免疫調節結構域以及/或者含有這兩種區域的融合蛋白的生物活性進行比較。為此目的，使用一種細胞增殖分析以確保該融合蛋白的各融合區域均保持了類似于各結構域在未被融合時(即，不是融合蛋白的一個部分時)的功能。
在一個實施方案中，該融合蛋白的生物活性將通過將該蛋白體外引入兩種類型的細胞系而進行測定每個細胞系分別測定一個具體結構域的活性。例如，一種為細胞凋亡促進結構域的可靠指示劑的細胞系應當被用以檢測該結構域的作用，而一種能夠顯示出正免疫調節結構域的細胞系應被用于監測另一種結構域的活性。
通過向一種細胞系引入一種特定結構域的不同濃度的被拮抗、非拮抗以及融合形式，本領域的技術人員能夠測定該融合蛋白的細胞凋亡促進結構域的同未融合的相同結構域相比較的生物活性。測定細胞凋亡有多種途徑。這些方法包括以下技術，但并不限于這些(1)細胞生存力喪失-通過不能排除活體染料或者吸收MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑鎓)或者MTS-PMS來進行檢測；(2)DNA碎片化-通過瓊脂糖凝膠電泳、PFG電泳、原位末端轉移酶標記(TUNEL)進行分析；細胞和核形態學-使用顯微鏡以觀察染色質濃縮、DNA組織以及細胞質完整性；以及半胱氨酸蛋白酶激活分析-凋亡酶(caspase)激活分析，該分析聯合以通過蛋白印跡或者免疫組織化學而進行的比色或者熒光數值分析、多聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)或者層粘連蛋白切割。使用了人類乳腺癌細胞系(T-47D)的實施例4和9提供了可在該程度上被接受的分析系統的非限定的例子。
類似地，一種能夠測量該正免疫調節結構域的細胞系應當被類似地用于監測該融合蛋白的這一結構域的活性。使用了一種鼠細胞系(HT-2)的實施例9是一種用于測定融合蛋白中的正免疫調節結構域的生物活性的可行但非限定性的方法。
用于測定本發明的融合蛋白質活性的另一種優選方法為體內的行為檢測。用于該檢測的一種適當的宿主應為一種含有癌組織的哺乳動物宿主，該癌組織能夠同該細胞凋亡促進結構域相結合。一種適當的對照可以為一些細胞系，這些細胞系的特征在于沒有或者鮮有該被選中的細胞凋亡促進結構域的受體位點。實施例10提供了一種使用小鼠細胞進行體內研究的非限定性的例子。
下文的實施例應當為示例性的而非限定性的實施例實施例1表達質粒pUCIG-MT-Hprla-IL2融合蛋白cDNA的克隆和構建分別對來自于hPRLA cDNA(從限制性酶切位點XbaI剛好到該序列的轉錄終止密碼子之前)和從氨基酸序列+1位點到轉錄終止密碼子的IL-2cDNA(購自ATCC)的PCR片段進行了擴增。接下來，將這些片段連接入哺乳動物表達載體pUCIG-MET以產生一種整合入這些片段的表達載體(即，pUCIG-MET-hPRLA-IL2)。在hPRLA和IL-2 cDNA之間加入一個用于克隆目的的BamH1限制性位點，該位點在該融合蛋白的結合處產生了兩個額外的氨基酸殘基(甘氨酸和絲氨酸)。實施例2將一個表達質粒轉染入一種穩定細胞系我們已經產生了hPRL-IL-2以及容納有hPRL-IL-2的穩定小鼠細胞系以用于我們的初步體外研究。在本發明的融合蛋白的生產中使用了小鼠L細胞。這些細胞一開始用編碼hPRLA-IL-2 cDNA的DNA分子以及肝炎病毒Tk基因和倉鼠APRT基因(Leung et al.，1985)使用lipofectin方法(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)進行共轉染，該hPRLA-IL-2 cDNA由小鼠金屬硫蛋白調控序列操縱。在TK+和APRT+表型的雙選擇后，穩定的hPRL或者hPRL類似物分泌型小鼠L細胞系被建立并且在Dulbecco Modified Eagles培養基(DEME，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)進行維持，該DEME中添加了10％的Nu-血清(Collaborative Research，Bedford，MA)、15μg/ml次黃嘌呤、1μg/ml氨基喋呤、15μg/ml胸苷以及50μg/ml的慶大霉素。將細胞轉入T150燒瓶直至達到90％匯合。每24小時在這一時刻收集無血清條件培養基并合并。經合并的培養基在-20℃下進行冷凍直至完成進一步純化。實施例3純化該融合蛋白為獲得提高產量的融合蛋白，根據本領域所熟知的程序應當首先對這些蛋白進行純化。這些步驟包括通過離心從培養基中取出細胞，隨后進行沉淀，交叉流動超濾并且使用層析方法，例如低壓SEC和制備級RP-HPLC層析。在這些步驟后進行緩沖液交換、脫熱原以及冷凍干燥(lyophilation)。
步驟1取出細胞——將80-100％的條件培養基以6000×g在4℃下離心30分鐘。該初始細胞培養基的體積為80-100升。所有的hPRL-G129R在該步均被回收。
步驟2沉淀——該沉淀步驟通過向10升細胞培養基中在恒速攪拌下逐漸加入3.5kg硫酸銨來進行。將該溶液在4℃下放置12小時。通過離心去掉上清。隨即將該沉淀溶解于2升的蒸餾水中。通過離心除去不溶雜質。所有的離心步驟均以6000g在4℃下進行30分鐘。溶液的最終體積約為5升。
步驟3使用交叉流動超濾降低體積——在2000ml攪拌腔中使用一種10K分子截留膜來降低該溶液的體積，從而使該體積達到SEC大小排阻柱的柱床體積的10％。這一膜過濾步驟在55psi下操作。
步驟4低壓SEC——這一低壓SEC步驟的目的在于除去可能污染制備級RP-HPLC柱的較大或者較小的雜質。低壓SEC在44×1000mmAmicon玻璃柱中進行，該柱中填裝有Bio-Rad P60凝膠。該凝膠的柱床體積為1231ml。以0.5ml/min的流速將0.05M的硫酸銨流過該柱。整個設置被置于冰箱中并且維持于4℃。
步驟5制備級RP-HPLC——在本步工作中使用了一種帶有紫外可見監測儀的Waters(Millipore Corp.，Bedford，MA)制備以及HPLC系統。使用一種來自Rainin Instrument，Inc.(Woburn，MA)的制備級(preparative-scale)Dynamax C，RP-BPLC柱(21.4×250mm，5gm，300A孔大小)來獲得高純度的hPRL-G129R產品。使用一種從40％的乙腈(ACN)(v/v)+0.1％三氟乙酸(TFA)到80％的乙腈+0.1％三氟乙酸的線性梯度來進行分離。在60分鐘內建立該線性梯度，流動相的流速為5ml/min。將該UV監測儀設置于220nm。
步驟6緩沖液交換——使用膜透析通過緩沖液交換而除去殘余的有機溶劑。以一種Amicon YMIO膜在一個50ml的攪拌腔中進行緩沖液交換。在加入蛋白質樣品之前根據脫熱原方案對該超濾系統進行準備。該有機溶劑以無熱原蒸餾水進行幾個回合的滲濾。hPRL-G129R被保留于該50ml滯留溶液中。
步驟7脫熱原——由于這些產品將被用于體內，因此無熱原產品是優選的。因此使用100K膜過濾步驟以除去熱原。脫熱原在50ml攪拌腔中以100K膜完成。根據脫熱原方案以0.1N NaOH溶液處理該攪拌腔。以無熱原水洗滌該滯留物3次，并且該hPRL-G129R被收集于透過物。透過物的體積為～100ml。通過放射免疫矩陣(matrix)分析(RIMA)來測定hPRL或者hPRL-G129R的濃度。
步驟8冷凍干燥——冷凍干燥為最終產品的貯藏所需。hPRL-G129R在凍干形式下更為穩定。所有的液體溶劑均在具有離心真空蒸發器的凍干設備中被除去。該凍干的hPRL-G129R樣品隨后在-20℃冷凍設備中儲存于N2中。實施例4通過放射性受體結合分析進行的純化hPRL和hPRL-G129R生物活性檢測除了以PRL代替GH之外，放射性受體結合分析根據在Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 875061(1991)中的描述而進行。簡而言之，T47-D細胞在6孔組織培養板中生長至90％匯合(～105細胞/孔)。將單層細胞在無血清RPMI-1640培養基中受饑2小時。隨后將這些細胞在室溫下于無血清RPMI-1640培養基中在存在或者不存在不同濃度的hPRL(來自NIH，作為標準)和hPRL-G129R的情況下溫育，該培養基含有8×104CPM的125I hPRL(比活性＝30μCi/μg；NEN Dupont，Boston，MA)。隨后這些細胞在無血清RPMI-1640中洗滌3次并且在0.5ml的0.1N NaOH/1％SDS中溶解，并且通過伽馬計數器(ICNBiomedical，4/600plus型；Costa Mesa，CA)測定結合的放射性。隨后算出hPRL和hPRL-G129R的EC50值并且以平均值±SD的形式表示。通過斯氏t檢驗來進行比較。實施例5通過STAT5磷酸化/免疫沉淀分析進行的純化hPRL和hPRL-G129R生物活性檢測在含有10％的Charcoal Stripped胎牛血清(CSFBS；生長培養基)的RPMI-1640培養基中生長T-47D細胞。對于每個實驗，細胞在達到90％匯合時分轉入6孔培養板中的培養基中。在實驗當天，細胞在無血清培養基中進行1小時的耗竭(deplete)并且在hPRL、hPRL-G129R以及兩者的組合物中溫育30分鐘。處理之后，以冰冷的PBS洗滌T47-D細胞一次，并且輕柔地刮下收集于1ml冰冷的裂解緩沖液中[20mM Tris-Cl(pH7.4)、100mM NaCl、2mM EDTA、1％的NP-40、1mM苯甲基磺酰氟化物、10μg/ml抑酶肽、10μg/ml亮抑酶肽]。隨即將該裂解混合物以避免氣泡的方式通過一個22號針頭幾次并且以最大速度旋轉20分鐘。隨即將上清轉入一個新的微量離心管中。隨后向100微升(200-500微克總蛋白)的細胞裂解物中加入5μg的STAT5單克隆抗體以及向每一反應中加入400微升ddH2O以及500微升2×IP緩沖液[1％Triton X-100、150mM NaCl、10mM Tris pH7.4、1mM EDTA、1mM EGTA、0.2mM釩酸鈉、0.2mM PMSF、0.5％NP-40]。4℃下溫育過夜并且進行輕柔的旋轉后，將50微升經預洗滌的(1×IP緩沖液)蛋白A瓊脂糖珠將入各IP反應中并且在4℃下再繼續溫育2小時。在溫育結束時，以1×IP緩沖液洗滌該瓊脂糖珠3次，并且隨后通過在50微升1×SDS PAGE上樣緩沖液中重懸浮該蛋白A瓊脂糖珠而將蛋白質洗脫。隨即將樣品用于4-12.5％SDS-PAGE并且使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的抗磷酸酪氨酸抗體PY20和ECL試劑盒(Amersham，IL)來進行免疫印跡分析。隨后將印跡物對X射線膠卷進行曝光并且使用標準程序進行顯影(Kodak，Rochester，NY)。在T-47D人類乳腺癌細胞中使用hPRL和hPRL-G129R所獲得的結果表明hPRL-G129R能夠阻斷由hPRL所誘導的信號轉導，這顯示了其拮抗效果。實施例6通過TUNEL分析進行的純化hPRL和hPRL-G129R生物活性檢測該分析Fluorescein Apoptosis detection system，promega(orp.)通過對片段化的DNA的3-OH末端的缺刻進行標記而發揮作用。通過末端脫氧核糖核苷酸轉移酶在3-OH末端引入了熒光素標記的dUTP。使用了T47-D人類乳腺癌細胞。在分析之前，將該乳腺癌細胞轉入10％Charcoal-Striped胎牛血清(CCS)一星期。隨后，將這些細胞鋪于8隔室玻片系統(8chambered slide system)(LabTekII)，每隔室匯合為60-70％。第二天，這些乳腺癌細胞在條件化培養基中(0.5％CSS)以各種濃度的hPRL-G129R進行處理。約24到48小時后，拆開隔室并且在制造商的指導下進行該分析。使用PlympusIX 70顯微鏡系統在FITC濾光片下檢測這些玻片。實施例7hPRLA-IL-2融合蛋白質的濃度的檢測進行了SDS-PAGE和免疫印跡以進一步確認該被表達的hPRLA-IL-2融合蛋白質具有適當的分子量。收集來自于瞬時轉染的小鼠L細胞的培養液并將之用于15％SDS-PAGE，該電泳在我們的實驗室內使用Bio-Rad Protean II或者Mini-Protean II系統(Bio-Rad，Hercules，CA)進行常規的實施。在進行蛋白質轉移后，在含2％的明膠的TBS中室溫下輕微振蕩1小時來封閉硝酸纖維素膜，隨后以含0.05％Tween 20的TBS洗滌三次(每次洗滌5分鐘)。將含多克隆兔抗-hPRL(來自BioDesign International，Kennebunk，Maine，1∶200稀釋)的1％的明膠/TBS加至硝酸纖維素膜并且在室溫下輕微振蕩溫育過夜。除掉一級抗體后，以含0.05％Tween20的TBS洗滌該硝酸纖維素膜三次，并且隨后在含有羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP)偶聯物(Boehringer Mannheim Biochemicals)的1％明膠/TBS中室溫溫育過夜。以二抗進行的溫育之后以含0.05％Tween20的TBS洗滌該硝酸纖維素膜三次。
為使該蛋白帶可見，將該硝酸纖維素膜在一種混合物中溫育10分鐘，該混合物為含有0.018％H2O2(v/v)的50ml TBS同含有30mg HRP顯色試劑(Bio Rad)的10ml甲醇的混合物。以水漂洗該硝酸纖維素膜，在空氣中干燥并進行照相。純化的hPRL以及IL-2(AccurateChemical & Scientific Corp.Westbury，NY)被用于通過照相和密度比色計法對表達的hPRLA-IL-2進行定量(Fernadez andKopchick，1990)。實施例8使用放射性受體結合分析以及人類乳腺癌細胞測定hPRLA-IL-2融合蛋白的結合性質本試驗的主要目的在于使用人類乳腺癌細胞來比較hPRL、hPRLA以及該hPRLA-IL-2融合蛋白質的結合親和性，以此確定hPRLA同IL-2的融合并不影響其同乳腺癌細胞hPRLR的結合能力。
放射性受體結合分析的實施如在Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 875061(1991)中的描述那樣進行。簡而言之，T-47細胞在6孔組織培養板中生長直至90％匯合(～105細胞/孔)。將單層細胞在無血清RPMI-1640培養基中受饑2小時。隨后將這些細胞在室溫下于無血清RPMI-1640培養基中在存在或者不存在不同濃度的hPRL(來自NIH，作為標準)和hPRL-G129R的情況下溫育，該培養基含有8×104CPm的125I hPRL(比活性＝30μCi/μg；NEN Dupont，Boston，MA)。隨后這些細胞在無血清RPMI-1640中洗滌3次并且在0.5ml的0.1N NaOH/1％SDS中溶解，并且通過伽馬計數器(ICN Biomedical，4/600plus型；Costa Mesa，CA)測定結合的放射性。隨后算出hPRL和hPRL-G129R的EC50值并且以平均值±SD的形式表示。通過斯氏t-檢驗來進行比較。通過加入1μg/ml的非標記hRPL+1μg IL-2來測定非特異結合。實施例9使用細胞擴增分析進行IL-2、hPRLA以及hPRLA-IL-2融合蛋白的生物活性比較該項研究中使用了兩種類型的細胞增殖分析以確認hPRLA-IL2融合蛋白保持了類似于IL-2的活性以及類似hPRLA的活性。鼠T細胞系(HT-2細胞)為一種IL-2反應型細胞系，該細胞系在典型的情況下被用于檢測重組小鼠和人IL-2的生物活性，在此用于檢測融合蛋白的類IL-2活性(Taniguchi et al.，1983；Rosenberg et al.，1984)。另外，使用人類乳腺癌細胞來檢測該融合蛋白的可能的拮抗活性。
使用了一種人類乳腺癌細胞系(T47-D)(來自ATCC)。這些細胞根據ATCC的建議在對應的培養基上生長。分析條件由Ginsburg和Vonderharr(1995)所描述并且可根據各細胞系而進行修正。一般來說，細胞在37℃下維持于含5％CO2的加濕空氣環境中。對于個體生長實驗，這些細胞以約2×104/ml/孔的密度被鋪于12孔培養板中。將細胞貼壁一天并且除去培養基并以含有ITS+(胰島素-轉鐵蛋白-硒-BSA亞油酸培養基添加物；Collaborative Research Bedford，MA)的培養基換成無血清條件。加入了多種濃度的hPRL、hPRLA、hPRLA-IL-2或其中兩種的組合(1∶1、5∶1、10∶1等等比例的hPRLA∶hPRL或者hPRLA-IL-2∶hPRL)。再培養三天后，在胰酶消化后收集細胞并在細胞計數器下計數。實施例10使用同基因小鼠模型進行體內研究以檢測hPRLA-IL-2融合蛋白的抗腫瘤活性hPRLA-IL-2的抗腫瘤效果的最終實驗是體內實驗。為此目的而使用了同基因的具有免疫能力的C3H小鼠以及來自相同株小鼠的乳腺腫瘤細胞以檢測該融合蛋白的可能的抗腫瘤活性。
具體使用了CRL-6326和/或CRL-6378小鼠乳腺癌細胞。為查明PRLR在這些細胞中的狀態，對這些細胞進行了放射性受體結合分析以確認它們含有PRLA。使用兩種細胞系作為陽性以及陰性對照。一種細胞系為C3H衍生的小鼠L細胞，購自ATCC。這些轉化的成纖維細胞如果被用于皮下注射可誘導腫瘤。由于GHR或者PRLR在L細胞中表面不能被檢測到(數據未出示)，因此這些L細胞被用作為非乳腺癌對照。經過hPRLR cDNA的穩定轉染的小鼠L細胞同樣被用于在C3H小鼠中誘導腫瘤。由這些細胞所誘導的腫瘤由于在其表面的hPRLR高水平表達而被視為陽性對照。
通過接種5×106個癌細胞而對皮下腫瘤進行誘導以用作為癌模型。它在10天內誘導腫瘤生長至25μl的體積，上文引及的Reisfeldet al.(1996)的文獻。這時，通過IL-2、PRLA以及hPRLA-IL-2融合蛋白的靜脈內注射而對這些動物進行7天的處理。對各組使用了兩種劑量(每次注射5μg和25μg)。在處理結束時，處死這些動物并且測量未接受處理或者接受了IL-2、hPRLA或者hPRLA-IL-2的動物體內的腫瘤重量，并且進行了統計分析。
同樣進行了免疫組織化學評估以檢測原位細胞浸潤的證據。簡而言之，冷凍切片在冰冷的丙酮中通過以0.03％的H2O2除去內源過氧化物酶并且以含10％血清的1％BSA/PBS封閉產生膠原的元件而進行10分鐘的固定。隨后將CD45特異性抗體以預定的稀釋度(～20μg/ml)覆蓋于系列切片并且在加濕室中將切片溫育30分鐘。以生物素化的二級抗體處理10分鐘，隨后通過連接于鏈親合素的堿性磷酸酶處理10分鐘，各步驟之間均以PBS進行洗滌。再次洗滌之后，加入底物并且在黑暗中將載玻片溫育20分鐘。以PBS洗滌之后，對該載玻片進行負染、固封并且使用Olympus(Bew Hyde Park，NY)BH2顯微鏡進行觀察。
下表所示為使用同基因小鼠以及腫瘤細胞以檢測hPRLA-IL-2融合蛋白的生物活性的實驗設計。
序列表SEQ ID NO1(MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP)LPICPGGAARCQVTLRDLFDRAVVLSHYIHNLSSEMFSEFDKRYTHGRGFITKAINSCHTSSLATPEDKEQAQQMNQKDFLSLIVSILRSWNEPLYHLVTEVRGMQEAPEAILSKAVEIEEQTKRLLE GMELIVSQVHPETKENEIYPVWSGLPSLQMADEESRLSAYYNLLHCLRRDSHKIDNYLKLLKCRIIHNNNC
權利要求
1.一種治療癌癥的方法，該方法包括給予患者有效量的具有一種受體拮抗結構域以及一種正免疫調節劑結構域的蛋白。
2.權利要求1的方法，其中該受體拮抗結構域為一種促乳素拮抗劑結構域。
3.權利要求1的方法，其中該正免疫調節劑結構域為一種白細胞介素。
4.權利要求3的方法，其中該白細胞介素為白細胞介素2(IL-2)。
5.權利要求3的方法，其中該正免疫調節劑結構域為白細胞介素12(IL-12)。
6.權利要求3的方法，其中該正免疫調節劑結構域為γ干擾素(IFNγ)。
7.權利要求1的方法，其中該蛋白質為一種促乳素拮抗劑-白細胞介素2(hPRLA-IL-2)融合蛋白。
8.權利要求2的方法，其中該促乳素拮抗劑結構域的特征在于對應于促乳素蛋白129位上的甘氨酸被單氨基酸取代為精氨酸。
9.權利要求2的方法，其中該促乳素拮抗劑結構域含有一種具有SEQ ID NO01(hPRLA)的氨基酸序列的蛋白質或其保守變體。
10.權利要求2的方法，其中該促乳素拮抗劑結構域含有一種天然促乳素序列的截短形式或其保守變體。
11.一種蛋白質，該蛋白質含有一種受體拮抗結構域以及一種正免疫調節劑結構域。
12.權利要求11的蛋白質，其中該受體拮抗結構域為一種細胞凋亡促進結構域。
13.權利要求12的蛋白質，其中該細胞凋亡促進結構域為一種促乳素拮抗劑結構域。
14.權利要求12的蛋白質，其中該正免疫調節劑結構域為一種白細胞介素。
15.權利要求14的蛋白質，其中該白細胞介素為白細胞介素2(IL-2)。
16.權利要求14的蛋白質，其中該正免疫調節劑結構域為IL-12。
17.權利要求14的蛋白質，其中該正免疫調節劑結構域為IFNγ。
18.權利要求12的蛋白質，其中該蛋白質為一種促乳素拮抗劑-白細胞介素2(hPRLA-IL-2)融合蛋白。
19.權利要求13的蛋白質，其中該促乳素拮抗劑結構域的特征在于對應于促乳素結構域129位上的甘氨酸被單氨基酸取代為精氨酸。
20.權利要求13的蛋白質，其中該促乳素拮抗劑結構域含有一種具有SEQ ID NO01(hPRLA)的氨基酸序列的蛋白質或其保守變體。
21.權利要求13的蛋白質，其中該促乳素拮抗劑結構域含有一種天然促乳素序列的截短形式或其保守變體。
22.權利要求3的方法，其中該癌癥的特征為表達一種促乳素受體。
23.一種蛋白質，該蛋白質包含具有SEQ ID NO01的氨基酸序列或其保守變體序列的第一種結構域以及一種正免疫調節劑結構域。
24.權利要求1的方法，其中該受體拮抗結構域為一種細胞凋亡促進結構域。
25.權利要求24的方法，其中該細胞凋亡促進結構域通過在靶細胞中抑制STAT3磷酸化而發揮功能。
26.權利要求12的蛋白質，其中該細胞凋亡促進結構域通過在靶細胞中抑制STAT3磷酸化而發揮功能。
27.一種藥物組合物，該組合物含有一種治療有效量的權利要求11的蛋白質以及一種適量的載體介質。
全文摘要
一種新的融合蛋白質，該蛋白質含有一種受體拮抗結構域以及一種正免疫調節結構域，其特征在于，例如在于其阻斷細胞凋亡以及/或者抑制內分泌反應的能力，它可用于癌癥治療。例如，一種人類促乳素拮抗劑－白細胞介素2(hPRLA－IL－2)融合蛋白組合了細胞凋亡誘導以及免疫治療作用，用以在乳腺或者前列腺中抵抗癌癥。
文檔編號C07K19/00GK1432064SQ01809991
公開日2003年7月23日 申請日期2001年3月23日 優先權日2000年3月23日
發明者M·Y·陳, T·E·瓦格納 申請人:格林維爾醫院系統公司