胞苷二磷酸膽堿的純化方法

專利名稱：胞苷二磷酸膽堿的純化方法
技術領域：
本發明涉及可用作藥物原料、營養食品原料的胞苷二磷酸膽堿的
純4b方法。
背景技術：
胞苷二磷酸膽堿(以下簡稱為CDP-膽堿)的制備方法已知有化學 合成方法(專利文獻1、專利文獻2)，使用微生物培養物或酶的方法(專 利文獻3、專利文獻4)。已知通過化學合成方法制備的CDP-膽堿的純 化方法有使用陰離子交換樹脂的方法(專利文獻1)、將強酸性離子 交換樹脂和弱堿性離子交換樹脂組合使用的純化方法(專利文獻2), 后者的方法中使用兩種離子交換樹脂，雖然可以分離CDP-膽堿溶液 中所含的磷酸膽堿、胞苷-5，-一磷酸(以下簡稱為CMP),但是并不是 可有效分離尿嘧啶或尿苷-5，-三磷酸(以下簡稱為UTP)的方法。
專利文獻1:日本特公昭63-6558號
專利文獻2:日本特公平6-31306號
專利文獻3:日本特許第3369236號
專利文獻4:國際公開第99/49073號手冊

發明內容
本發明的目的在于提供可以簡便地分離CDP-膽堿和核酸類似物 的CDP-膽;威的純化方法。 本發明涉及以下(1)-(6)。
(1) CDP-膽堿的純化方法，其特征在于使含有核酸類似物且pH 為0.5或以上、5.0或以下的CDP-膽堿溶液與H型強酸性陽離子交換 樹脂接觸，將吸附在該樹脂上的CDP-膽堿用水或離子濃度為0.1 mol/L或以下的水溶液洗脫，分離純化CDP-月旦石咸。
(2) 上述(l)的CDP-膽堿的純化方法，其中，該CDP-膽堿溶液是 由如下得到的介質制備的溶液使具有由UTP的前體和膽堿或磷酸膽 堿生成CDP-膽堿的活性的生物催化劑與UTP前體、以及膽堿或磷酸膽堿或它們的鹽在水性介質中共存，在該介質中生成并累積CDP-膽減。
(3) 上述(2)的CDP-膽堿的純化方法，其中，生物催化劑含有具有 由UTP的前體生成UTP的能力的微生物培養物或該培養物的處理物、 以及具有由UTP和膽堿或磷酸膽堿生成CDP-膽堿的能力的微生物培 養物或該培養物的處理物。
(4) 上述(2)的CDP-膽堿的純化方法，其中，生物催化劑含有催化 由UTP的前體和膽堿或磷酸膽堿生成CDP-膽堿的反應的酶。
(5) 上述(4)的CDP-膽堿的純化方法，其中，催化生成CDP-膽堿 的反應的酶選自乳清酸磷酸核糖基轉移酶、乳清苷-5，-磷酸脫羧酶、 尿苦磷酸化酶、尿嘧咬磷酸核糖基轉移酶、尿普激酶、尿苷酸/胞苷酸 激酶、核苷二磷酸激酶、胞苷-5，-三磷酸合成酶、磷酸膽堿轉胞苷酰 酶、以及膽堿激酶。
(6) 上述(l)-(5)的CDP-膽堿的純化方法，其中，核酸類似物是選 自尿嘧啶和UTP的物質。
本發明可以提供CDP-膽堿及其鹽。
實施發明的最佳方式
本發明中使用的CDP-膽堿溶液只要是含有核酸類似物且pH為 0.5或以上、5.0或以下的溶液即可，可以是以任何方法制備的溶液， 所制備的CDP-膽堿溶液的pH為0.5-5.0則可以直接使用，如果比5.0 大，則可以添加鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等酸，如果pH比0.5小， 則可以添加氫氧化鈉、氫氧化鉀等^<，將pH調節為0.5或以上、5.0 或以下，優選1.0或以上、3.5或以下4吏用。
H型強酸性陽離子交換樹脂只要是H型強酸性陽離子交換樹脂即 可，可以是凝膠型也可以是多孔型，具體有Dow Chemical Company />司制備的Dowex系歹'J(例如HCR國S、 HCR畫W2、 Marathon C、 MONOSPHERE 650C、 MSC-1、 MONOSPHERE 88、 50Wx2、 50Wx4、 50Wx8等)、三菱化學制備的Diaion SK系歹'J(例如SK1B、SK104、 SK110、 SK112等)、三菱化學制備的Diaion PK系歹寸(例如PK208、 PK212、 PK220， PK228等)、Rohm and Haas制備的AMBERLITE系歹'J (例如IR120B、 IR124等)等。
H型強酸性陽離子交換樹脂的交聯度只要是可以分離CDP-膽石成 和核酸類似物的交聯度即可，沒有特別限定，優選2-10%,進一步優 選4-6%。
H型強酸性陽離子交換樹脂優選以填充到柱子中的形式在本發明 中使用，本發明中使用的柱可以是任何柱。
通過將含有核酸類似物且pH為0.5或以上、5.0或以下的CDP-膽堿溶液通入填充了 H型強酸性陽離子交換樹脂的柱中等，與該樹脂 接觸，使CDP-膽堿吸附于該樹脂上，例如在過填充了交聯度為2-10% 的H型強酸性陽離子交換樹脂的柱時，過柱速度為SV=0.1-5.0,優選 SV=0.2-3.0。
通過上述吸附處理，可以將CDP-膽石威與溶液中所含的核酸類似 物例如乳清苷-5，-一磷酸(以下簡稱OMP)、尿苷-5，-一磷酸(以下簡稱 UMP)、尿苷-5，-二磷酸(以下簡稱UDP)、 UTP、 CMP、胞苷-5，-二磷酸 (以下簡稱CDP)、胞苦-5，-三磷酸(以下簡稱CTP)等嘧啶系核酸物質分 離并除去。即使在pH為0.5或以上、5.0或以下使含有核酸類似物中 的尿嘧啶或UTP的CDP-膽堿溶液與該樹脂接觸，它們也幾乎或者完 全不吸附在該樹脂上，因此特別適合分離除去尿嘧啶或UTP。
吸附于H型強酸性陽離子交換樹脂的CDP-膽堿通過將離子濃度 為0.1mL/L或以下、優選0.03mL/L或以下的水溶液、進一步優選水 過柱等進行洗脫，由此，CDP-膽堿可從樹脂中洗脫，可分離純化CDP-膽堿。
通過上述洗脫步驟，所收集的含有CDP-膽堿的液體可以根據需 要，使用活性碳處理或者是使用非極性多孔質合成吸附劑例如三菱化 學制備的Diaion HP系列(例如HP20、 HP21等)、三菱化學制備的Diaion SP800系列(例如SP825、SP850等)、三菱化學制備的Diamond ionSP200 系列(例如SP207等)、Rohm and Haas制備的AMBERLITEXAD系列(例 如XAD4、 XAD7HP、 XAD16HP、 XAD1180、 XAD2000等)等進行脫 色處理。
上述含有CDP-膽堿的液體或脫色液可用酸或堿調節至pH 2.0-4.0，根據需要濃縮后，將CDP-膽堿的濃度調節至50-800 g/L,優 選100-700 g/L,使用有機溶劑、優選丙酮、乙醇、曱醇、丙醇等親水性的有機溶劑獲得CDP-膽堿晶體。
將上述含有CDP-膽堿的液體或脫色液可用氫氧化鈉調節至pH 5.0-9.5，根據需要濃縮后，將CDP-膽堿濃度調節至50-800 g/L,優選 100-700 g/L，使用有機溶劑、優選丙酮、乙醇、曱醇、丙醇等親水性 的有機溶劑獲得CDP-膽堿鈉鹽晶體。
使用有機溶劑獲得CDP-膽堿晶體的方法例如有向CDP-膽堿溶 液中添加有機溶劑，使晶體析出的方法；或者是向大量的有機溶劑中 滴加CDP-膽石威溶液，^f吏晶體析出的方法。
本發明中，含有核酸類似物的CDP-膽堿溶液只要是含有CDP-膽 堿和核酸類似物的溶液即可，可以是任何溶液，可以是通過化學合成 法，以及使用具有由UTP的前體和膽堿或磷酸膽堿生成CDP-膽堿的 活性(以下簡稱為C D P -膽堿生成活性)的生物催化劑的方法制備的溶
液o
該生物催化劑可以是具有CDP-膽堿生成活性的微生物的培養物、 該培養物的處理物、催化生成CDP-膽堿的反應的酶等。
該微生物只要是具有CDP-膽堿生成活性的微生物即可，可以是 任何微生物，原本具有CDP-膽堿生成活性的微生物可以直接用于 CDP-膽堿的生產，原本不具有CDP-膽堿生成活性的微生物可以通過 導入編碼催化由UTP的前體和膽堿或磷酸膽堿生成CDP-膽堿的反應 的酶的DNA來用于CDP-膽堿的生產。該微生物優選為屬于埃希氏桿 菌屬(五sc/^n'c/ /a)、沙雷氏菌屬0Sem3"a)、芽孢桿菌屬CSa"7/w)、短 桿菌屬(5reW^"en'wm)、 棒狀桿菌屬(Coo^eZ ""en'M附)、孩t桿菌屬 (M/cTo6a"er/謂)、假單胞菌屬(尸膽(/o,薩)、鏈球菌屬 (S/re/^ococc^s)、才艮瘤菌屬(iSz7zor/H'zo6&w)、嗜血4干菌屬(//aemo/7/^7"s)、 節桿菌屬04W/^o^"er)、金桿菌屬04MMO^"en'wm)、纖維單胞菌屬 (Ce〃w/cwoww)、 棍狀桿菌屬(C7av/^c化r)、 短小桿菌屬 (Cwr/o6a"en'MW2)、月旨肪4干菌屬(尸/附eroZ)a"er)、酵母屬(Sacc/ aromyces)、 裂殖糖酵母屬(Sc/^osacc/iaraw^c^)、 克魯維氏酵母屬 (A7^yveromyc^)、 絲孢酵母屬(7Wc/zo印on w)、 許旺氏酵母屬 0Sc^mm"!'omj;c^)、畢赤氏酵母屬(尸z'c/n力)、和假絲酵母屬(Om^^)的 微生物等。
屬于埃希氏桿菌屬的微生物有大腸桿菌MM294 (Escherichia coli
6MM294)、大腸桿菌XL1-Blue (&c/^hc/^ co// XL1-Blue)、大腸桿菌 XL2-Blue (五scAen,c&,a co//XL2-Blue)、大腸牙干菌DH1 (E^c/^n'c力/a co/7 DH1)、大腸桿菌MC1000 (Escherichia coli MC1000)、大腸桿菌KY3276 (^sc/^n'c/^ KY3276)、大腸桿菌W1485 C^c/^Wc/^ W1485)、 大腸桿菌 JM109 (五"/^n'c/n'a JM109)、 大腸桿菌HB101
C^c/^n'c/^Vz co" HBIOI)、大腸桿菌No.49 (Esc/^hc/n力co" No.49)、大 腸桿菌W3110 C^c/^n'c/ 'fl co//W3110)、大腸桿菌NY49 CE^/^n'c/n'a co//NY49)、大腸桿菌GI698 (&c/^n'c/^ co"GI698)、和大腸桿菌TBI (」&c/^hc/ 'a co// TB1 )等屬于埃希氏桿菌屬的微生物。屬于沙雷氏菌屬 的微生物例如有無花果沙雷氏菌CS^ra"a ,can'a)、居泉沙雷氏菌 (iSemz",a/oWco/a)、 解凝沙雷氏菌/—、 以及粘質沙 雷氏菌0S^7yz"am『c^ce""等。屬于芽孢桿菌屬的孩i生物有枯草芽 孑包4干菌(5ac"/ws wZ "7&)、 巨大芽孑包4干菌CSac/〃m meg"/en'mw)、解淀#分 芽孢桿菌(5ac/〃ws amy/o/^^e/flc/e""等。屬于短桿菌屬的孩t生物有 5rev/Z ac"n'ww /mman'o/ A//ww 、 解#唐#豆才干菌 (5rev/Z a"en.ww mcc力(3to/3^c"w)、 黃色短4干菌(5rev7'Z a"en,ww 、乳發酵短菌
(5reWZ a"en'w附/a"o/enwewm附)等。屬于才奉一犬斥干菌屬的樣i生凈勿有谷 氛酸棒狀軒菌 ATCC13032 (Co，efta"erZ簡 g/齒m/c簡 ATCC13032)、 谷氨酸4奉狀桿菌 ATCC13869 (Coo^"eZ^"ehwm g/wtom/cwm ATCC13869)等屬于谷氨酸棒狀桿菌的微生物，產氨棒狀 桿菌ATCC6872 (Co，e6a"en'謂認歸m.agewes ATCC6872)、 產氛棒 訝犬4干菌ATCC21170 (Corywe6a"en'wm awzwom.agewes ATCC21170)等屬 于產氨棒狀桿菌的微生物，嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC13870 (Co^7"eZ a"en'wm acWoac^/o/ / 7wm ATCC13870)等屬于卩耆乙酰乙酸才奉 狀桿菌的微生物等。屬于微桿菌屬的微生物有嗜氨微桿菌 ATCC15354 (Af/croZjacfen'w附am附ow/a/ Az./i/m ATCC15354)等屬于p者氛 微桿菌的微生物、乳酸微桿菌(MZcn Zja"en'wm /ac"w附)、和蛾微桿菌 (MZcra^"en'wm fm; en'a/e)等。屬于假單胞菌屬的微生物有惡臭假單 胞菌(尸"wJowo"w; t/^/a)等。屬于鏈球菌屬的微生物有肺炎鏈球菌 0S"印Mcoccw ; wew附om'ae)等。屬于中華根瘤菌屬的微生物有苜蓿 中華根瘤菌(57woW/zoWMm me"/o")等。屬于嗜血桿菌屬的孩i生物有 流感嗜血桿菌(i/aemo/7/n7ws /"/7we"zae)等。屬于節桿菌屬的孩i生物有er g/o^/orm的等。屬于金桿菌屬的微生物有淺黃金桿菌(JwreoZ^c"n'ww y7"vMce似)、天牛金桿菌(^4wreo^ac^n'MW2 sape/^/ae)、石爭紅色金4干菌 (Jwreo6a"ehMm ^^acewm)等。屬于纖維單胞菌屬的微生物有產黃 纖維單胞菌(Cd/w/omowas //cm'gewa)、卡氏纖維單胞菌(Ce〃w/omowas carm)等。屬于棍狀桿菌屬的微生物有密執安棍狀桿菌(C/aW^"er mZc/H-gawew^X)、 4i氏才昆^犬牙干菌(C7av/6a"er ra"ay0等。屬于4豆小^干菌 屬的微生物有(Cwr/oZ^"er/"w a/Z7WM附)、檸檬色短小桿菌 (CwWo6ac化n'ww c"rewm)、 ,口膝黃少豆'J、才干菌(CwWo6ac化n'"m /w化w附)等。 屬于脂肪桿菌屬的微生物有簡單脂肪桿菌(巧wera^"w Wm; /e;c)等。
屬于酵母屬的;f效生物有卩卑酒并唐酵母(5V cc/ an9mj^es cerew'Wae) 等。屬于裂殖糖酵母屬的微生物有粟酒裂殖糖酵母 (5W^oy"cc力araw3^ey/7om6e)等。屬于克魯維氏酵母屬的微生物有乳 克魯維氏酵母(《/w"^w^c^/ac^)等。屬于絲孢酵母屬的微生物有 茁芽絲孢酵母(7Wc/20^ ora";w〃w/fl/w)等。屬于許旺氏酵母屬的微生物 有河岸許旺氏酵母(5^/^朋"/0附>^^"http://"訶1 )等。屬于畢赤氏酵母屬 的微生物有巴斯德畢赤氏酵母(巧c/n'fl;^Wor!X)等。屬于^f艮絲酵母屬 的微生物有產朊假絲酵母(CawAV/" ""7的等。
該微生物更優選屬于埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒 狀桿菌屬和酵母屬的微生物，進一步優選屬于埃希氏桿菌屬、短桿菌 屬、棒狀桿菌屬的微生物。
上述微生物中，即使是原本具有CDP-膽堿生成活性的微生物， 其CDP-膽堿生成活性如果不夠強，也可以按照常規方法向該微生物 中導入具有編碼催化由UTP的前體和膽堿或磷酸膽堿生成CDP-月旦石咸 的反應的酶的DNA的重組DNA、或者將與具有該活性的其它微生物 的細胞融合，制備該活性得到強化的微生物。
該活性得到強化的微生物和具有該活性的微生物優選按照以下 所示方法，將編碼催化該反應的酶的DNA導入^f效生物中，使用所得 到的轉化體。
編碼催化由UTP的前體和膽堿或磷酸膽堿生成CDP-膽堿的反應 的酶(以下簡稱為CDP-膽堿生成酶)的DNA例如有編碼具有由乳清 酸生成OMP的活性的乳清酸磷酸核糖基轉移酶[EC 2.4.2.10]、具有由
8OMP生成UMP的活性的乳清苷-5，-磷酸脫羧酶[EC 4.1.1.23]、具有 由尿嘧啶生成尿苷活性的尿苷磷酸化酶[EC 2.4.2.3]、具有由尿嘧，定生 成UMP的活性的尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶[EC 2.4.2.9]、具有由尿苷 生成UMP的活性的尿苷激酶[EC 2.7.1.48]、具有由UM P生成UDP 的活性的尿普酸/胞苷酸激酶[EC 2.7.1.48]、具有由UDP生成UTP的 活性的核香二磷酸激酶[EC 2.7.4.6]、具有由UTP生成CTP的活性的 胞苷-5，-三磷酸合成酶[EC 6.3.4.2](以下簡稱PyrG)、具有由膽堿生成 磷酸膽^5威的活性的膽〃喊激酶[EC 2.7.1.32](以下簡稱CKI)的DNA,以
胞苷酰酶[EC 2.7.7.15](以下簡稱為CCT)。
編碼CDP-膽堿生成酶的DNA優選編碼PyrG、 CKI和CCT的 DNA。
編碼PyrG的DNA是從大腸桿菌的染色體中克隆的，其全部石成基 序列已經確定[J. Biol. Chem. , 261, 5568(1986)]。具有編碼PyrG的 DNA的重組體可以是將來自大腸桿菌的、含有編碼PyrG的DNA的 2426 bp的Nrul-Pstl片段插入到大腸桿菌的載體pCU8 [Gene, 19, 259(1982)]的多克隆位點Smal-Pstl位點所得的質粒pMW6 [ Biosci. Biotechnol. Biochem.， 61， 956 (1997)]等。
編碼CCT的DNA其全部》威基序列已得到確定[Eur. J. Biochem.， 169,477(1987)]。具有編碼CCT的DNA的重組體DNA有向來自 大腸桿菌的載體pUC18 [Gene, 19, 259(1982)]的多克隆位點Smal 位點插入來自酵母的含有編碼CCT的DNA的1296 bp的Dral片段所 得的質粒pCC41 [生化學，60, 701(1988)]等。
編碼CKI的DNA也同樣是由酵母染色體克隆，其全部堿基序列 已確定[J. Biol. Chem" 264， 2053(1989)]。具有編碼CKI的DNA的 重組體DNA有向酵母和大腸桿菌的穿梭載體YEpM4 [ Mol. Cell. Biol.， 7, 29(1987)]中插入來自酵母的、含有編碼CKI的DNA的2692 bp的PstI-HindIII片段所得的質粒pCKID [J. Biol. Chem., 264， 2053(1989)]等。
上述質粒可按照公知的方法[Nuc. Acids Res., 7, 1513(1979)],從保
有這些質粒的大腸桿菌中分離純化。
例如可按照Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition,Sambrook等人編著、Cold Spring Harbor Laboratory (2001),從上述所 得的質粒中獲得編碼CDP-膽堿生成酶的DNA,將該DNA摻入到表 達載體中，制備重組體DNA,將上述微生物作為宿主細胞進行轉化， 由此可以獲得具有CDP-膽堿生成活性的生物催化劑。
首先，由上述質粒pMW6、質粒pCC41或質粒pCKlD獲得編碼 PyrG、 CCT或CKI的DNA,以所得DNA為基礎，根據需要制備含 有編碼該多肽的部分的適當長度的DNA片段。
還可根據需要將編碼CDP-膽堿生成酶的部分的堿基序列進行石威 基置換，制成DNA,形成最適合宿主細胞表達的密碼子。該DNA可 在CDP-膽堿生成酶的高效制備中有用。
通過將該DNA片段或全長DNA插入到適當的表達載體的啟動子 下游，可以制備重組載體。此時，可以將編碼CDP-膽堿生成酶的DNA 分別插入到表達載體中，還可以將多個DNA插入到同 一表達載體中。
將該重組載體導入到適合該表達載體的宿主細胞中。
宿主細胞可以是上述微生物。
表達載體可以在該宿主細胞中自主復制、以及可摻入到染色體 中，并在可轉錄編碼CDP-膽堿生成酶的DNA的位置上含有啟動子使 用。
宿主細胞使用細菌等原核生物時，優選含有編碼CDP-膽堿生成 酶的DNA的重組載體在原核生物中可自主復制，同時是由啟動子、 核糖體結合序列、該DNA、轉錄終止序列構成的載體。還可以包括控 制啟動子的基因。
表達載體例如有BTrp2、pBTacl 、pBTac2 (BERINGAMANHAIMU 公司銷售)、pKK233-2 [Pharmacia制備]、pSE280 [Invitrogen制備]、 pGEMEX-1 [Promega制備]、pQE-8 [QIAGEN制備]、pKYP10 (日本特 開昭58-110600號)、pKYP200 [Agric. Biol. Chem.， 48， 669 (1984)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescript II SK(-) [Stratagene制備]、 pTrs30 [由大腸桿菌JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]、pTrs32 [由 大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制備]、pGHA2 [由大腸桿菌 IGHA2(FERM BP-400)制備、日本特開昭60-221091號]、pGKA2 [由 大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)制備、日本特開昭60-221091號]、pTerm2 (美國專利4686191號、美國專利4939094號、美國專利5160735 號)、pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)]、 pGEX [Pharmacia制備]、pET系統[Novagen制備]等。
啟動子只要可在宿主細胞中發揮功能即可，可以是任何啟動子。 例如可以是trp啟動子(Ptrp)、 lac啟動子、Pt啟動子、PR啟動子、T7
啟動子等來自大腸桿菌或噬菌體等的啟動子。還可以使用如將2個Ptrp
串聯連接的啟動子(PtrpX2)、 tac啟動子、lacT7啟動子、letl啟動子那 樣人為設計改變的啟動子等。
優選使用將核糖體結合序列——Shine-Dalgarno序列與起始密碼 子之間調節成適當的距離的(例如6-18個堿基)的質粒。
本發明的重組載體中，編碼CDP-膽堿生成酶的DNA的表達不一 定要有轉錄終止序列，不過優選在結構基因的緊下方配置轉錄終止序 列。
重組載體的導入方法只要是可以向上述宿主細胞導入DNA的方 法即可使用，例如有使用鈣離子的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、原生質體法(日本特開昭63-248394號)、或Gene, 17, 107 (1982)或Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)的方法等。
使用酵母作為宿主細胞時，表達載體例如有YEpl3 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等。
啟動子只要是可在酵母菌抹中表達的啟動子均可使用，例如有己 糖激酶等糖酵解系統的基因的啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、 GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal IO啟動子、熱休克多 肽啟動子、MFal啟動子、CUP1啟動子等。
重組載體的導入方法只要是可以向酵母中導入DNA的方法均可 使用，例如有電穿孔法[MethodsEnzymol.,iM， 182 (1990)]、原生質球 法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, H， 1929 (1978)]、醋酸鋰法[J. Bacteriology, ill, 163 (1983)]、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 21, 1929 (1978)中記載的方法等。
微生物只具有CDP-膽堿生成活性的一部分時，為了獲得CDP-膽 堿生成活性，可以適當將2種或以上微生物組合，作為具有CDP-月旦 堿生成活性的生物催化劑使用。微生物具有CDP-膽堿生成活性時也可以將兩種或以上纟效生物組合使用。
2種或以上微生物的組合可以選自上述微生物的任意一種，例如 有選自屬于埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒 狀桿菌屬、微桿菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、中華根瘤菌屬、嗜血 桿菌屬、節桿菌屬、金桿菌屬、纖維單胞菌屬、棍狀桿菌、短小桿菌 屬、脂肪桿菌屬、酵母屬、裂殖糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、絲孢酵 母屬、許旺氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、和假絲酵母屬的微生物等的屬 于同 一 個屬的微生物或者不同屬的微生物的組合。
例如可以是屬于棒狀桿菌屬的微生物與屬于埃希氏桿菌屬的微 生物組合等，具體有產氨棒狀桿菌ATCC21170和大腸桿菌 MM294/pCKG55林(FERM BP-3717)的組合(日本專利第3369236號、 美國專利第6387667號)等。
具有CDP-膽堿生成活性的生物催化劑之一的、具有CDP-膽堿生
的微生物的培養物。
該微生物為細菌等原核生物或酵母等真核生物時，培養該微生物 的培養基只要是含有該微生物可同化的碳源、氮源、無機鹽類等，可 有效地進行該微生物的培養的培養基即可，可以是天然培養基、合成 培養基的任意一種。
碳源只要是該微生物可同化的碳源即可，可以使用葡萄糖、果糖、 蔗糖、含有它們的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，乙酸、丙 酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類等。
氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等無機酸或 有機酸的銨鹽，其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、 玉米漿、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各種發酵菌體及其 消化產物等。
無機鹽可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化 鈉、磷酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸釣等。
培養是在振蕩培養或通氣攪拌培養等好氧條件下進行。培養溫度 可以是15-5(TC,培養時間通常為16小時-7天。培養中的pH優選保 持3-9。 pH的調節可使用無機或有機酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、 氨等進行。該微生物為轉化體、且用于轉化該微生物的重組體DNA保有抗 生素抗性基因時，可以在培養該微生物的培養基中添加與該重組體 DNA所保有的抗生素抗性基因對應的抗生素。
使用兩種或以上微生物培養物或該培養物的處理物作為生物催
化劑時，可使用可按照上述方法將各微生物在分別的或同一培養基中 培養所得的生物催化劑。
將兩種或以上微生物在同一培養基中培養時，可以將這些微生物 同時培養，也可以在培養一種微生物的過程中、或培養結束后將其余 的微生物在該培養基中培養。
微生物的培養物的處理物有用表面活性劑、有機溶劑或溶菌酶 等細胞溶解酶對上述方法得到的微生物的培養物進行處理得到的表 面活性劑、有機溶劑或細胞溶解酶處理培養物。可分別單獨使用表面 活性劑、有機溶劑或細胞溶解酶對該微生物的培養物進行處理，也可 以將它們組合處理該微生物的培養物。還有通過濃縮機或干燥機等 對由上述方法得到的微生物的培養物進行濃縮或干燥處理，將得到的 該微生物的培養物的濃縮物或干燥物；以及通過過濾或離心等將該微 生物的培養物進行固液分離得到的菌體；將該菌體用干燥機等進行干 燥處理得到的該菌體的干燥物。還有將該菌體用表面活性劑、有機 溶劑或溶菌酶等細胞溶解酶、或者它們組合進行處理得到的該菌體的 表面活性劑處理物或有機溶劑處理物、細胞溶解酶處理物等。
使用兩種或以上微生物時，可以將兩種或以上培養物的處理物分 別用作具有CDP-膽堿生成活性的生物催化劑，也可以將這些培養物 的處理物混合，將所得混合物用作具有CDP-膽堿生成活性的生物催 化劑。
CDP-膽堿可如下制備將上述生物催化劑與UTP的前體、以及 膽堿或磷酸膽堿或者它們的鹽在介質中接觸，生成CDP-膽堿并使其 在該介質中積累，從該介質中獲取CDP-膽堿。
UTP的前體有乳清酸、OMP、尿嘧啶、尿苷、UMP和UDP等， 優選乳清酸和尿嘧啶。
具體的生成CDP-膽堿并積累的方法是將上述生物催化劑和UTP 的前體以及膽堿或者磷酸膽堿或它們的鹽在介質中混合，根據需要向 所得混合物中添加其它成分，使pH保持5-11 ，更優選6-10,在20-50°C
13下寸呆持2-48小時。
生物催化劑的使用量根據該生物催化劑的比活性等而不同。例如
用將該培養物丄該培^物:處理物離心所得的濕菌體，相對于i' mg
氯化膽減Z使用5-500 mg,優選10-300 mg。
膽堿、磷酸膽堿和它們的鹽例如有膽堿、氯化膽堿、溴化膽石咸、 碘化膽堿等面化膽堿，碳酸氬膽堿、硫酸甲基膽堿、檸檬酸二氫膽堿、 酒石酸氬膽堿、磷酸膽堿、氯化磷酸膽石威等磷酸膽石威的卣化物等，優 選使用膽堿或磷酸膽堿的卣化物，進一步優選使用氯化膽堿、氯化磷 酸膽堿。
UTP的前體、膽堿、磷酸膽堿以及它們的鹽可以是化學合成獲得， 也可以通過發酵法等由生物獲得。純化至高純度的產品也可使用。另 外，各種底物均有市售，可容易地獲得。
UTP的前體、膽堿、磷酸膽堿以及它們的鹽的濃度優選1 mmol/L-l mol/L，進一步優選10-100 mmol/L。
必須的其它成分有生成CDP-膽堿所必需的能量供給體、磷酸 離子、鎂離子、銨離子、表面活性劑和有機溶劑等。在可由生物催化 劑等帶來所需量時，則無需添加這些成分。
能量供給體可使用葡萄糖、果糖、蔗糖等糖，糖蜜、淀粉水解物 等，甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。它們均優選以0.02-2.0 mol/L的濃度 使用。
磷酸離子可以使用正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸等聚磷 酸，聚偏磷酸、磷酸一鉀、磷酸二鉀、磷酸一鈉、磷酸二鈉等無機磷 酸鹽等。這些磷酸離子優選以10-500 mmol/L的濃度使用。
鎂離子可使用硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等無機鎂鹽，檸檬酸鎂等 有機鎂鹽。鎂離子優選以5-200 mmol/L的濃度使用。
銨離子可以使用氨水、氨氣、各種無機和有機銨鹽、酵母提取物、 玉米漿等。還可以使用谷氨酰胺或含有谷氨酰胺的肽或酪蛋白氨基酸 等有機營養源代替銨離子。這些銨離子濃度優選以10mmol/L-2mol/L
的濃度使用。
表面活性劑是二辛基^Tu代琥珀酸鈉(例如Rapisol B-80，日本油脂 制備)、月桂酰肌氨酸鹽等陰離子性表面活性劑、聚氧乙烯/鯨蠟基醚(例如Nonion P-208,日本油脂制備)等非離子性表面活性劑、烷基二 曱胺(例如叔胺FB，日本油脂制備)等叔胺類等，只要是可催化CDP-膽堿的生成的表面活性劑均可使用。它們通常以0.1-100 g/L、優選1-50 g/L的范圍使用。
有機溶劑有二曱苯、曱苯、脂族醇(曱醇、乙醇、丁醇等)、丙 酮、乙酸乙酯、二曱基亞砜等。它們通常以0.1-100 mL/L、優選1-50 mL/L的濃度使用。
作為使生物催化劑與UTP前體和膽堿或磷酸膽堿或它們的鹽接
基、該微生;的培養物、i^養物的上清等，也可以使用'水性介質。 水性介質有水、磷酸緩沖液、HEPES(N-2-羥乙基哌溱-N-乙磺酸)
緩沖液、三[三(羥基曱基)氨基甲烷]鹽酸緩沖液等緩沖液。
只要不阻礙反應，即可以向該介質中添加有機溶劑。有機溶劑有
丙酮、乙酸乙酯、二曱基亞砜、二曱苯、曱醇、乙醇、丁醇等。
上述CDP-膽堿的制備方法可以是使用以產氨棒狀桿菌
ATCC6872和大腸桿菌MM294/pCKG55林(FERM BP-3717)作為生物
催化劑，生產CDP-膽堿的方法(日本專利第3369236號、美國專利第
6387667號)。
CDP-膽堿生成酶有選自選自乳清酸磷酸核糖基轉移酶、乳清苷 -5，-磷酸脫羧酶、尿苷磷酸化酶、尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶、尿苷激 酶、尿苷酸/胞苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、PyrG、 CCT、和CKI的1 種或多種酶。
將上述具有酶活性的微生物用勻漿器等破碎，然后進一步實施鹽 析處理、等電位沉淀處理、有機溶劑沉淀處理、透析處理、各種色譜 處理等通常的酶的純化方法，可以將得到的粗制酶或純化酶用作CDP-膽堿生成酶。還可以將該微生物的破碎物直接作為上述酶使用。
上述微生物破碎物、粗制酶或純化酶固定在水不溶性的載體或凝 膠等上，將其作為上述酶使用。
CDP-膽堿可如下制備使上述酶與UTP的前體、以及膽堿或磷 酸膽堿或它們的鹽在介質中接觸，生成CDP-膽堿并使其在介質中積 累，從該介質中收集CDP-膽堿。
具體的生成CDP-膽石威并積累的方法可以是將上述酶和UTP的
15前體以及膽堿或磷酸膽堿或它們的鹽在介質中混合，根據需要向所得
混合物中添加其它成分，保持pH為5-11,更優選6-10，在20-50°C 下寸呆持2-48小時。
CDP-膽堿生成酶的用量根據該酶的比活性等而不同。例如使用粗 制酶作為該酶時，相對于1 mg氯化膽堿可使用1 fxg-500 mg,優選10 jig-300 mg。
使用CDP-膽堿生成酶生成CDP-膽堿并積累時所添加的UTP的前 體、膽堿、磷酸膽堿、它們的鹽以及根據需要添加的其它成分與使用 上述微生物的培養物等生成CDP-膽堿并積累時的情況同樣，還可根 據需要添加腺苷-5，-三磷酸等作為能量供給體，還可進一步添加5-磷 酸核糖二磷酸。
作為使CDP-膽;成生成酶與UTP的前體和膽石威或磷酸膽石威或者它 們的鹽接觸的介質，可以使用培養用作生物催化劑的微生物的培養 基、該微生物的培養液、培養上清等，也可以使用水性介質。
水性介質有水、磷酸緩沖液、HEPES (N-厶羥乙基哌嗪-N-乙磺酸) 緩沖液、三[三(羥基曱基)氨基曱烷]鹽酸緩沖液等緩沖液。
如上所述，從生成并積累有CDP-膽堿的介質中制備CDP-膽堿溶 液時，可使用膜分離、過濾、離心等方法從該介質中分離除去固形物 質。
由上述方法制備的CDP-膽堿溶液中所含的核酸類似物有尿嘧啶、 UTP等。
CDP-膽堿或核酸類似物可通過采用高效液相色譜(UV檢測)的常 規方法進行分析。
通過以下的實施例進一 步具體說明本發明，但本發明并不受這些 實施例的限定。
實施例1
使用強酸性陽離子交換樹脂純化CDP-膽堿
將50 g CDP-膽堿(和光純藥工業制備)、2 g尿嘧啶(Nacalai Tesque 制備)、1 g UTP (Nacalai Tesque制備)溶解于水中，制備5 L CDP-膽堿 溶液。將該溶液用硫酸調節至pH3.0，過填充了 10L交聯度為4%的 強酸性陽離子交換樹脂Diamond ionPK208 (H型)的柱。接著通入水，通過高效液相色譜分析獲得尿嘧啶、UTP的各濃度相對于CDP-膽堿 低于0.1% (w/w)的組分。將CDP-膽堿組分濃縮至100 mL，緩慢添加 350mL乙醇。濾取析出的晶體，用100%乙醇溶液洗滌，然后在20°C 下減壓干燥三天。結果獲得了 40 g相對于CDP-膽堿尿嘧啶、UTP各 濃度低于0.1% (w/w)的CDP-膽堿晶體。
實施例2
從具有生成CDP-膽堿的能力的微生物培養物中純化CDP-膽堿
將具有PyrG、 CCT、 CKI的酶活性的大腸桿菌MM294/pCKG55 抹(FERM BP-3717)接種于加入了 10 mL含50嗎/mL氨卡青霉素的L 培養基[含有10 g/L胰蛋白胨(Difco制備)、5 g/L酵母提取物(Difco制 備)、5g/LNaCl， pH調節為7.2的液體培養基]的試管中，在25。C下 以300 rpm振蕩培養24小時。將20 mL該培養液接種于加入了盛有 400 mL含有50 pg/mL氨卡青霉素的L培養基的2L帶擋板三角燒瓶 中，在25。C下以190rpm旋轉振蕩培養16小時。將125mL該培養液 接種于加入了 2.5 L含有5 g/L葡萄糖(另行滅菌)、5g/L蛋白胨(極東 制藥工業制備)、6 g/L Na2HP04、 3 g/L KH2P04、 5 g/L NaCl、 1 g/L NH4C1、 250 mg/L MgS04.7H20 (另行滅菌)和4 pg/L維生素Bl(另行滅 菌)組成的液體培養基(未調節pH)的5L容量的培養槽中，在600rpm、 通氣量2.5 L/分鐘的培養條件下，在25。C下攪拌11小時、然后在32°C 下攪拌13小時，用14。/o氨水調節至pH7.0,進行培養。培養過程中， 從培養開始第11小時至第24小時期間，通過蠕動泵以30mL/小時的 速度流入含有167g/L葡萄糖、167g/L蛋白胨的組成的培養液。
另一方面，將具有由乳清酸生成UTP的活性的產氨棒狀桿菌 ATCC21170抹接種于加入了 10 mL含有50 g/L葡萄糖、10 g/L聚胨(大 五榮養化學制備)、10 g/L酵母提取物(大五榮養化學制備)、5 g/L尿素、 5 g/L (NH4)2S04、 lg/LKH2P04、 3 g/L K2HP04、 1 g/L MgS04.7H20、 0.1 g/L CaCl2-2H20、 10 mg/L FeS04'7H20、 10 mg/L ZnS04.7H20、 20 mg/LMnS04' 4-6H20、 20 mg/L L-半胱氨酸、10 mg/L D-扁桃酸鈣、5 mg/L維生素Bl 、 5 mg/L煙酸和30 pg/L生物素(用氫氧化鈉調節pH7.2) 的組成的液體培養基的試管中，在28。C下以300 rpm往復振蕩培養24 小時。將20 mL該培養液4矣種于加入了 230 mL與上述相同組成的液體培養基的2L帶擋板三角燒瓶中，在28。C下以190rpm旋轉振蕩培 養24小時。將250 mL該培養液接種于5L容量的加入了 2.5 L含有 100 g/L葡萄糖、10 g/L肉膏、10 g/L聚胨、1 g/L KH2P04、 1 g/L K2HP04、 1 g/L MgS04'7H20、 0.1 g/L CaCl2'2H20、 20 mg/L FeS04'7H20、 10 mg/L ZnS04'7H20、 20 mg/L MnS04- 4-6H20、 15 mg/L p-丙氨酸、20 mg/L L墨 半胱氨酸、100(ig/L生物素、2 g/L尿素(另行滅菌)和5 mg/L維生素 Bl (另行滅菌)(用氫氧化鈉調節pH7.2)的組成的液體培養基的培養槽 中，在32。C下以600 rpm攪拌、2.5 L/分鐘通氣量的培養條件下用濃 氨水調節至pH6.8，進行種培養。在上述種培養上清中的葡萄糖被消 耗掉時，無菌采集350 mL培養液，接種于5加入了 2.5 L含有180 g/L 葡萄糖、10g/LKH2PO4、 10g/LK2HPO4、 10 g/L MgS04'7H20、 0.1 g/L CaCl2-2H20、 20 mg/L FeS04'7H20、 10 mg/L ZnS04.7H20、 20 mg/L MnS04= 4-6H20 (另行滅菌)、15 mg/L卩-丙氨酸、20 mg/L L-半胱氨酸、 2g/L谷氨酸鈉、100fxg/L生物素、2 g/L尿素(另行滅菌)和5 mg/L維 生素Bl (另行滅菌)(用氫氧化鈉調節pH7.2)的組成的液體培養基的5 L培養槽中，在32。C下600 rpm攪拌、2.5L/分鐘通氣量的培養條件下， 用濃氨水調節至pH6.8，進行正式培養。待培養上清中葡萄糖消耗掉 時結束培養。
將360 mL上述得到的大腸桿菌MM294/pCKG55 ^M々培養液和 360 mL產氨棒狀桿菌ATCC21170林的培養液加入到2L容量的培養 槽中，向其中添加100 g/L葡萄糖、10g/L乳清酸、8.4g/L氯化膽堿、 5 g/LMgS04.7H20、 20mL/L二曱苯，加入蒸餾水，使總量為800 mL。 在32。C下800 rpm攪拌、通氣量0.8 L/分鐘的條件下，將該混合液用 10當量氫氧化鈉將pH調節至7.2進行反應。反應中途適當添加 KH2P04,使反應上清中磷酸濃度以KH2P04的形式保持為l-5g/L。進 行23小時的反應，生成11.0g/LCDP-膽堿。
用硫酸將上述4次的反應液調節至pH 1.0 ，通過離心(7000 rpm, IO分鐘)分離菌體，向所得上清液中添加水，制成6 L (6.0 g/L CDP-膽石咸、0.5g/L尿嘧p定、1.0g/LUTP)。將該胞苷二磷酸膽石威溶液過填 充了 10 L交聯度為4%的強酸性陽離子交換樹脂Diamond ionSK104 (H型)的柱。持續通入水，通過高效液相色譜分析獲得相對于CDP-膽堿尿嘧咬、UTP各濃度低于0.1% (w/w)的組分。使用活性碳對CDP-
18膽堿組分進行脫色，然后濃縮至100mL。向該濃縮液中緩慢添加350 mL乙醇，濾取析出的晶體。將所得晶體用100%乙醇溶液洗滌，然后 在20。C下減壓干燥3天。結果得到18gCDP-膽堿晶體，該CDP-膽堿 晶體中，相對于CDP-膽堿尿嘧啶、UTP各濃度低于0.1% (w/w)。
實施例3
由具有生成CDP-膽堿的能力的微生物的培養物純化CDP-膽堿鈉
jnt 。
用硫酸將與實施例2同樣得到的四次的反應液調節至pH 1.0,通 過離心(7000 rpm, IO分鐘)分離菌體，向所得上清液中添加水，制成 6 L (6.0 g/L CDP-膽堿、0.5g/L尿嘧啶、1.0 g/L UTP)。將該胞苷二磷 酸膽堿溶液過填充了 10 L交聯度為4%的強酸性陽離子交換樹脂 Diamond ionSK104 (H型)的柱。持續通入水，通過高效液相色譜分析 獲得相對于CDP-膽堿尿嘧啶、UTP各濃度低于O.P/c) (w/w)的組分。 用氫氧化鈉將CDP-膽堿組分調節至pH 7.5,使用活性碳進行脫色， 然后濃縮至100mL。向該濃縮液中緩慢添加400mL乙醇，濾取析出 的晶體。將所得晶體用100%乙醇溶液洗滌，然后在20。C下減壓干燥 3天。結果得到20 g CDP-膽堿晶體，該CDP-膽堿晶體中，相對于CDP-膽石威尿嘧啶、UTP各濃度低于0.1% (w/w)。
以上結果表明，將含有核酸類似物的CDP-膽堿溶液用強酸性陽 離子交換樹脂僅處理一次，即可以簡便地獲得不含有雜質的CDP-膽 堿或其鹽。
產業實用性
本發明可低成本提供CDP-膽堿及其鹽。
19
權利要求
1. CDP-膽堿的純化方法，其特征在于使含有核酸類似物且pH為0.5或以上、5.0或以下的胞苷二磷酸膽堿(以下簡稱為CDP-膽堿)溶液與H型強酸性陽離子交換樹脂接觸，將吸附在該樹脂上的CDP-膽堿用水或離子濃度為0.1mol/L或以下的水溶液洗脫，分離純化CDP-膽堿。
2. 權利要求1的CDP-膽堿的純化方法，其中，該CDP-膽堿溶 液是由如下得到的介質制備的溶液使具有由尿苷-5，-三磷酸(以下 簡稱為UTP)的前體和膽石威或磷酸膽石威生成CDP-膽;威的活性的生物 催化劑與UTP前體、以及膽石威或磷酸膽石威或它們的鹽在水性介質中共 存，在該介質中生成并累積CDP-膽堿。
3. 權利要求2的CDP-膽堿的純化方法，其中，生物催化劑含有 具有由UTP的前體生成UTP的能力的微生物培養物或該培養物的處 理物、以及具有由UTP和膽堿或磷酸膽堿生成CDP-膽堿的能力的微 生物培養物或該培養物的處理物。
4. 權利要求2的CDP-膽堿的純化方法，其中，生物催化劑含有 催化由UTP的前體和膽堿或磷酸膽堿生成CDP-膽堿的反應的酶。
5. 權利要求4的CDP-膽堿的純化方法，其中，催化生成CDP-膽44的反應的酶選自乳清酸磷酸核糖基轉移酶、乳清苷-5，-磷酸脫羧 酶、尿苷磷酸化酶、尿嘧咬磷酸核糖基轉移酶、尿苷激酶、尿苦酸/ 胞苷酸激酶、核普二磷酸激酶、胞苷-5，-三磷酸合成酶、磷酸膽堿轉 胞苷酰酶、以及膽堿激酶。
6. 權利要求1-5中任一項的CDP-膽堿的純化方法，其中，核酸 類似物是選自尿嘧"定和UTP的物質。
全文摘要
本發明提供胞苷二磷酸膽堿的純化方法，其特征在于使含有核酸類似物且pH為0.5或以上、5.0或以下的胞苷二磷酸膽堿溶液與H型強酸性陽離子交換樹脂接觸，將吸附在該樹脂上的胞苷二磷酸膽堿用水或離子濃度為0.1mol/L或以下的水溶液洗脫，分離純化胞苷二磷酸膽堿。
文檔編號C07H19/10GK101448846SQ20068003768
公開日2009年6月3日 申請日期2006年8月10日 優先權日2005年8月10日
發明者村田英城, 鹽見道夫, 目代強 申請人:協和發酵工業株式會社