胞苷三磷酸的基因工程制備方法

專利名稱：胞苷三磷酸的基因工程制備方法
技術領域：
本發明涉及一種胞苷三磷酸的制備方法，具體地說涉及在大腸桿菌中同時高效表達大腸桿菌嘧啶代謝途徑中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脫羧酶(pyrF)、尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(ndk)和CTP連接酶(pyrG)基因，屬于生物技術領域。
背景技術：
胞苷三磷酸(cytidine triphosphate, CTP)，又稱胞嘧啶核苷三磷酸，CTP經尿苷三磷酸(uridine 5' -triphosphate，UTP)由酶催化合成，是一種在胞苷的核糖-5 ‘ -OH 基上結合三分子磷酸的核苷酸。胞苷三磷酸是一種高能磷酸化合物，在體內參與核酸和磷脂類的合成代謝，促進蛋白質的合成，并提供能量，是RNA生物合成的直接前體之一，并參與多糖的合成。CTP具有激活和促進受損神經組織再生和修復的功能，可健全和調節神經組織、改善脂肪代謝等作用，還可以調節和促進神經細胞、神經膠質細胞及血管壁細胞膜性結構的合成與構建，能夠對抗由興奮性氨基酸、自由基引起的神經細胞損傷，從而起到抗血管硬化的作用。國外有實驗研究已證實了 CTP能減輕甚至逆轉多種原因所引起的神經系統損傷。CTP也是合成寡聚糖、胞苷二磷酸膽堿(CDP-膽堿)XMP-NeuAc (CMP-N-乙酰神經氨酸)等多種藥物的中間體。近年來用于臨床的藥用CTP為三磷酸胞苷二鈉(cytidine 5' -triphosphatedisodium)，其化學名稱為胞嘧啶核苷-5'-三磷酸二鈉鹽，其分子式為 C9H14N3Na2O14P3，分子量為527. 14，是一種治療腦血管疾病的核苷酸類藥物。目前已有廠家生產注射液制劑，臨床上主要用于治療多種原因引起的神經系統及心血管類疾病，如腦血管意外及其后遺癥；腦震蕩、外傷性昏迷、顱腦手術后功能障礙；神經官能癥；腦血管硬化、老年性癡呆；外周神經損傷；兒童腦發育不全等。已報道的胞苷三磷酸的合成工藝方法主要包括化學法、生物合成法、光合磷酸法等幾種。國內生產CTP的方法主要是通過分離出酵母體內的自身酶系通過對CMP進行轉化來生產CTP，生產工藝比較成熟。但該工藝不太可能完全分離出糖酵解系統中的所有酶，酶失活率高，轉化率受到影響，且轉化時間較長。近年來，CTP需求量的增加，臨床用量也顯著增加，已無法滿足市場需求。

發明內容
本發明的目的在于，克服現有的生產胞苷三磷酸的方法存在的缺陷，而提供一種新的工藝簡單、生產周期短、低成本的使用酶工程法生產胞苷三磷酸的方法。本發明胞苷三磷酸的基因工程制備方法是采取以下技術方案實現的胞苷三磷酸的制備方法，使用單一的基因工程菌的培養物或者其處理物作為酶源，催化氯化銨、乳清酸等底物進行反應，使得反應液中生成和積聚胞苷三磷酸，并從所述反應液中提取所述胞苷三磷酸。前述的基因工程菌具有可誘導表達編碼乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶、核苷二磷酸激酶和胞苷三磷酸連接酶的基因。前述的可誘導表達胞苷三磷酸連接酶的基因位于所述基因工程菌的質粒上。前述的可誘導表達所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因位于所述基因工程菌的染色體上。前述的可誘導表達所述胞苷三磷酸連接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段來源于大腸桿菌，是根據大腸桿菌全基因組序列(genebank登錄號ECK3632)設計引物擴增得到的。更進一步地，所述基因工程菌的制備方法包括如下步驟a)將來源于大腸桿菌的可誘導表達胞苷三磷酸連接酶的基因核苷酸片段經酶切后與質粒載體(PUC18)連接形成重組質粒；b)將來源于大腸桿菌的可誘導表達所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、 尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段經酶切后插入到宿主細胞的染色體上；c)將所述重組質粒轉入到所述宿主細胞內。胞苷三磷酸的基因工程制備方法與現有技術相比，有如下優點(1)采用單一的微生物工程菌株催化反應，發酵、反應條件更易于控制；(2)所使用的底物為乳清酸，成本較低，可低成本生產胞苷三磷酸；(3)反應迅速、且轉化率較高。以下便結合實施例并附圖，對本發明的具體實施方式
作進一步的詳述。


圖1是實施例中的基因工程菌的部分載體構建的流程圖。
具體實施例方式本發明胞苷三磷酸的制備方法是使用單一基因工程菌的培養物或者其處理物作為酶源，催化包括氯化銨、乳清酸等為底物進行反應，使得反應液中生成和積蓄胞苷三磷酸，從所述反應液中提取所述。實施例1、染色體帶有pyrE、pyrF、pyrH、ndk操縱元的大腸桿菌的構建1. UpyrE, pyrF、pyrH、ndk基因的擴增及載體的構建pyrE基因、pyrF基因、pyrH基因、ndk基因和pyrG基因是根據大腸桿菌全基因組序列(genebank登錄號ECK3632)設計引物的。提取大腸桿菌K12MG1655基因組。然后，以大腸桿菌K12MG1655基因組為模板分別擴增出pyrE、pyrF、pyrH、ndk 基因，測序后，通過EcoRI、SacI酶切位點將pyrE片段連接于質粒pUC18上，得到質粒 PUCpyrE ；再通過McI、SmaI位點將pyrF片段連接到質粒pUCpyrE上，得到質粒pUC-pyrEF ； 接著將PyrH片段經由SmaI和)(baI位點連接到pUC-pyrEF上，得到質粒pUCpyrEHl ；最后通過XbaI和HindIII位點將ndk片段連接到pUCpyrEHl上，獲得在Iac啟動子后可誘導表達pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因的操縱元的質粒pUCpyrEFHk，具體構建流程如圖1所示。1. 2、帶有KRT-Km-FRT元件的pyrE、pyrF、pyrH、ndk操縱元質粒的構建ndk基因引物上設計有BioI位點，將pUCpyrEFHk用BioI和kal酶切，與同樣帶有B10I和kal酶切位點的以質粒pKD13為模板擴增出的帶有FRT位點的Kan基因片段相連，構建成質粒pUCpyrEFHkKmFRT，如圖1所示。1. 3、Red同源重組方法整合pyrE、pyrF、pyrH、ndk操縱元(1)線性雙鏈DNA打靶分子的制備與處理用于基因敲除的外源DNA的PCR擴增引物，它們分別由5，端的pyrE、pyrF、 pyrH、ndk操縱元同源區和3'端20bps的模板質粒pKD13的卡那霉素抗性基因同源區或質粒pUCpyrEFHkKmFRT上20bp同源區組成。使用高保真DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶)，經PCR合成了線性雙鏈DNA打靶分子 (5’同源臂+篩選標記+3’同源臂)。用Dpn I酶處理PCR產物，回收濃縮后用于重組。(2)重組酶基因的誘導表達和感受態細胞的制備將編碼Red重組系統的質粒pKD46用CaCl2法轉化至大腸桿菌中，將宿主菌在含有氨芐青霉素的LB培養基中30°C過夜振蕩培養，接種ImL菌液于50mL的含有Amp的LB液體培養基中，30°C振蕩培養3-4h，在培養終止前Ih加入L-阿拉伯糖，使之終濃度為0. 1 %。 冰上預冷lOmin，離心收集菌體，用10%甘油或超純水洗3_4次，最后將菌體重懸于500 μ L 冷的無菌10%甘油中，取50 μ L用于電擊轉化，其余可存放于-80°C冰箱中備用。以上操作步驟都要在冰上進行。(3)電擊轉化取2μ U20-100ng)純化后的PCR產物與50 μ 1剛制備的感受態混合，采用BioRad 公司Micro-Pulser電穿孔儀進行，0. 2cm電轉化杯，轉化參數為2. 5kV，5. 8ms。迅速加入LB 培養基1ml，置于37°C搖床中培養l_2h，復蘇，用含篩選標記的LB平板篩選發生了同源重組的陽性克隆，獲得菌株重組菌Kl。(4)驗證引物設計及卡那霉素抗性基因的去除對重組菌Kl進行鑒定時，引物設計的一般原則是一條引物設計在打靶區外圍， 另外一條則位于線性打靶序列內部。通過測序確認了重組事件發生的位置，獲得的菌株Kl 即可用于下一步抗性去除。質粒pCP20表達FLP重組酶，作用在重組體染色體上兩個FRT靶位點上，使卡那霉素抗性基因丟失。將具有氨芐青霉素抗性的質粒PCP20利用CaCl2方法轉化進入具有Kan 抗性的陽性菌株Kl中，于30°C培養條件下在含有Amp和Kan的平板上獲得陽性轉化子。然后轉接到沒有抗生素的LB培養基中，42°C培養5h，37°C平板劃線培養。對所得到的單菌落進行Amp和Kan敏感檢測，最后的Amp和Kan敏感的表型菌株就是去除掉Kan基因的重組子，如K1-E。同時使用Kan這對引物對抗性消除進行驗證，條件同上。得到去除抗性的重組子Kl-E即為染色體上帶有pyrE、pyrF、pyrH、ndk共表達操縱元的大腸桿菌菌株。實施例2、pyrG基因表達載體構建根據已知大腸桿菌K12MG1655的pyrG基因核酸序列，以大腸桿菌的染色體作為模板，擴增出全長PyrG基因。采用常規細菌DNA提取方法提取了本實驗室保藏的大腸桿菌菌株DH5 α的基因組 DNA。擴增使用的是保真性較好的pfu酶，加A尾后連接于pUC19-T vector，挑取陽性克隆送交測序公司，測序證實序列正確的用于下一步操作。將連接于pUC19-T vector上的pyrG基因從載體上酶切下來，使用的限制性內切酶為Sma I和BamH I，同時載體pUC18使用限制性內切酶Nru I和BamH I進行酶切，將載體酶切產物回收后，與回收的PyrG基因片段進行酶連反應，通過Sma I和BamH I等限制性酶消化，進行分析，確認片段已經連接成功。最終獲得質粒PUCG，pyrG基因此時是由IacZ 啟動子誘導表達的。實施例3、產胞苷三磷酸的基因工程菌的構建將實施例1中獲得的所述重組子Kl-E制備為感受態細胞，再將實施例2中構建完成的所述質粒PUCG轉化入Kl-E中，命名為Kl-E/pUCG，即為具有催化乳清酸和氯化銨等合成胞苷三磷酸能力的基因工程菌，加甘油保藏于-80°C冰箱中。實施例4、發酵及催化反應將固體培養基上的工程菌Kl-E/pUCG菌株接入5-20ml含氨芐青霉素(100 μ g/ml) 的種子培養液中，30-37°C以150480rpm振蕩培養8-16小時。按0.的接種量將該培養液轉接至50-200ml含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的種子LB培養基液的IL三角燒瓶中，在30-37°C以150480rpm振蕩培養2-8小時，然后加入終濃度為0. I-ImM的誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導，繼續培養4-12小時，培養溫度可適當下調。用冷凍離心機將發酵液于4-20°C下以1000-5000rpm的速度離心5_10min，棄上清，用 10-20ml 0. 05M, pH 8. 0 的 Tris-HCl 重懸菌體細胞。將重懸后的重約4g大腸桿菌細胞加入三角瓶中，并向其中添加IOg葡萄糖、0. 6g 乳清酸、0. 8g氯化銨、Ig磷酸氫二鉀、Ig磷酸二氫鉀、Img硫酸亞鐵、0. 8mg硫酸錳、20mg硫酸鎂和0. 4mL 二甲苯，再加入蒸餾水定容至100mL。將此混合液裝入2L容量的三角瓶中，在 280C UOOrpm的條件下進行反應。反應中，在適宜的進程中添加KOH以便保持反應體系pH 值為7. 2。反應M小時后，用HPLC方法測定反應液中胞苷三磷酸的含量為7. 15g/L。實施例5、分離與純化反應終止后，在轉化液中加入硅藻土，攪拌，以去掉蛋白質。再將轉化液離心，收集上清液。在離心上清液中加入陽離子交換樹脂攪拌吸附，調PH為1.2至4.0范圍內皆可， 靜置，過濾，得濾液。在濾液中加入乙醇，至乙醇含量達60%以上，靜置。再過濾，收取濾餅。 將得到濾餅加水溶解稀釋，過濾，得濾液。濾液調PH為2. 0-2. 5左右，上樹脂分離柱，進行吸附。檢測從分離柱下口流出的溶液，吸附飽和時停止進樣，用氯化鈉溶液進行梯度洗脫。為進一步純化，在上述7中洗脫下來的溶液中加入藥用活性炭，攪拌脫色，過濾， 將獲得的濾液中按1 2-1 20的比例加入藥用酒精，收集沉淀，抽濾除去水分，即可得到純度較高的胞苷三磷酸。本發明中，作為載體，只要在宿主微生物中能夠復制即可；作為宿主微生物，只要能夠表達重組DNA，用于胞苷三磷酸生產即可。培養本發明中基因工程菌的培養基，只要含有本發明中基因工程菌可以用于代謝的碳源、氮源、無機鹽類等、可有效地培養本發明微生物，不管是天然培養基，還是合成培養基均可。其中碳源，只要是本實施例中基因工程菌可以用于代謝者即可，如葡萄糖、果糖、蔗糖； 含有上述糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解產物等碳水化合物；醋酸、丙酸等有機酸；乙醇和丙醇等醇類。氮源，可以用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨等含氮化合物；以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸漬液、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各種發酵菌體及其消化產物等。無機鹽，可以用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣等。培養本實施例中基因工程菌的最適溫度為25-37°C，培養中培養基的pH值最好維持在中性范圍，培養時間是6-M小時。本發明能廣泛地應用于胞苷三磷酸的制備中。本發明尚有多種實施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術方案，均落在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.胞苷三磷酸的制備方法，其特征在于使用單一的基因工程菌的培養物或者其處理物作為酶源，催化包括乳清酸、氯化銨等底物進行反應，在反應液中生成、積累胞苷三磷酸， 并從所述反應液中提取胞苷三磷酸。
2.根據權利要求1所述的胞苷三磷酸的制備方法，其特征在于所述基因工程菌具有編碼乳清苷酸焦磷酸化酶、核苷二磷酸激酶、尿甘酸激酶、乳清苷酸脫羧酶和胞苷三磷酸連接酶的基因。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于可誘導表達所述胞苷三磷酸連接酶的基因位于所述基因工程菌的質粒上。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于可誘導表達所述乳清苷酸焦磷酸化酶、核苷二磷酸激酶、尿甘酸激酶和乳清苷酸脫羧酶的基因位于所述基因工程菌的染色體上。
5.根據權利要求3和4所述的方法，其特征在于可誘導表達所述編碼胞苷三磷酸連接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段來源于大腸桿菌。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的胞苷三磷酸的制備方法，其特征在于所述基因工程菌的制備方法包括如下步驟a)將位于可誘導表達啟動子后，來源于大腸桿菌的編碼乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脫羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段整合到宿主細胞的染色體上；b)將來源于大腸桿菌的可誘導表達胞苷三磷酸連接酶的基因片段酶切后與質粒載體連接形成重組質粒；c)將所述重組質粒轉入到所述宿主細胞內。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述質粒載體為質粒PUC18。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述宿主細胞為大腸桿菌細胞。
全文摘要
本發明揭示了一種胞苷三磷酸的制備方法，使用單一基因工程菌的培養物或其處理物作為酶源，催化包括氯化銨、乳清酸等進行反應，使得反應液中生成和積聚胞苷三磷酸，并從所述反應液中提取所述胞苷三磷酸。本發明的有益效果為(1)采用單一的微生物催化反應，更易于控制反應；(2)底物成本較低，可低成本生產胞苷三磷酸；(3)反應迅速、且轉化率較高。本發明能廣泛地應用于胞苷三磷酸的制備中。
文檔編號C12N15/52GK102199644SQ20111009464
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月15日 優先權日2011年4月15日
發明者夏冰, 李曉丹, 江玉梅, 汪仁, 王 忠, 賀佳 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所