專利名稱：一種定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法
技術領域：
本發明屬于生物催化技術領域，具體涉及利用調控技術分別定向催化合成胞苷磷
酰化合物的方法。
背景技術：
胞苷二磷酸(CDP)作為胞嘧啶的衍生物，是一種重要的生化試劑。它和二磷酸肌 苷在核苷酸磷酸酶的作用下制備聚肌胞(Poly I:C)。聚肌胞是一種高效的干擾素誘導劑， 具有廣譜抗病毒及免疫抑制作用，廣泛用于多種疾病的治療。 胞苷三磷酸(CTP)是三分子的磷酸結合在胞苷核糖5' -OH基上的核苷酸，是機體 細胞內的一種正常成分，分布廣泛，是RNA合成的直接前體。它在體內參與核酸和磷脂類 (卵磷脂，腦磷脂，絲氨酸磷脂、鞘磷脂等)的生物合成過程，磷脂是神經組織的重要成分， 也是一種天然的脂肪乳化劑，具有健全大腦和神經組織，增強智力和記憶力并有促進體內 膽固醇、脂肪的運輸，改善脂肪代謝，從而防止堆積的作用。CTP作為生化藥物廣泛用于治療 多種神經、血管疾病。 胞二磷膽堿(CDPC)，又稱胞磷膽堿鈉，是腦代謝激活劑，可促進神經細胞膜卵磷脂
的合成，具有修復腦損傷，抗缺氧，改善記憶，增強智力的作用，臨床應用較廣。所以，胞二磷
膽堿的合成技術是人們比較關心的研究課題。 CDP、 CTP和CDPC均屬于胞苷磷酰化合物的范疇。 目前，文獻上所述的CDP制備方法有化學合成法和生物合成法兩種。化學合成法 是以CMP為反應物，用二苯磷酰氯磷酸化，再精制得CDP。該法用到多種易揮發的有毒試 劑，操作環境惡劣，而且存在得率低，成本高的問題(Biochim.Biophys. Acta. ，1964,91(1): 1-13)。生物合成法分為兩步，先將CMP合成CTP，再將CTP降解生成CDP，可得到高純度的 CDP，得率在70X以上(化學與生物工程，2005，22(7) :52-54)。 CTP可以利用微生物(以啤酒酵母為主)細胞酶系合成。該工藝所需酵母的來源 廣，成本低，受季節限制少；并且產率較高，具有挖掘改進潛力。是目前三磷酸胞苷主要的生 產方式之一。據報導，Kilajima等利用酵母，從CMP合成CTP，反應得率為80 % (HakkoKogaku Zasshi. 1970,48(12) :753-762)。 目前常用CDPC合成方法是微生物轉化法，利用微生物的細胞酶系合成。在酵母細 胞中，CMP可以在核苷酸激酶的催化下合成CDP ;CDP可以在核苷二磷酸激酶的作用下生成 CTP，膽堿可以在膽堿激酶的催化下合成磷酸膽堿。然后CTP和磷酸膽堿經磷酸膽堿胞苷 轉移酶催化可以生成CDPC與焦磷酸。但是由于細胞酶系復雜，存在反饋調節作用，轉化率 普遍偏低，發酵周期太長，致使轉化率、產品濃度較低，反應液中存在大量副產物，包括CMP、 CDP和CTP。目前國內還沒有利用同一反應體系通過控制反應溫度和時間定向催化合成胞 苷磷酰化合物的相關報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種微生物細胞定向催化合成上述三種胞苷 磷酰化合物的方法。 為解決上述技術問題，本發明的思路是 鑒于CDPC的制備過程中，需要消耗大量的能量(ATP)，因此在胞苷磷酰化合物的 制備過程中需要兩個酶系即ATP的再生體系和胞苷磷酰化合物合成酶系。ATP的再生體系 以廉價的葡萄糖為底物，通過糖酵解途徑(EMP)來實現，該途徑是能量再生的最經濟的途 徑之一 ；胞苷磷酰化合物合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、膽堿激酶和磷酸膽堿胞 苷轉移酶構成。 在CDPC合成的整個過程中，胞苷磷酰化合物合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸 激酶、膽堿激酶和磷酸膽堿胞苷轉移酶起著關鍵作用。啤酒酵母中的這些酶分別具有不同 的最適溫度。四種酶最適溫度分別為胞苷酸激酶，25t:;核苷二磷酸激酶，37t:;膽堿激酶， 30°C ;磷酸膽堿胞苷轉移酶，3(TC。我們可以通過控制反應溫度及時間來生產CDP、CTP和 CDPC中任意一種產品。
本發明的關鍵在于 1)本發明采用了全細胞催化技術，直接利用了細胞的自有酶系催化CMP合成三種 胞苷磷酰化合物，可以根據需求生產三種物質的任意一種，反應體系簡單，無毒，生產成本 低廉。 2)本發明通過控制反應溫度作為手段，影響胞苷磷酰化合物合成過程中相關酶的 活性。在不同溫度下，會有利于合成一種物質的酶活性得到加強，同時有利于生成其他物質 的酶活性則削弱，這種酶的活性的選擇性決定了反應不同的最終產物。控制手段簡單易行， 極大方便了工業化中的生產控制。
本發明的具體技術方案如下 —種定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，以CMP、氯化膽堿和磷酸根離子為底 物，以葡萄糖作為能量供體，利用有透性的微生物細胞為酶源，通過改變反應溫度為手段， 促使反應體系生物催化合成胞苷磷酰化合物。 其中，所述胞苷磷酰化合物為胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)或CDP-膽堿
(CDPC)，其結構式如下<formula>formula see original document page 6</formula>
其中，胞苷一磷酸，即CMP，其結構式如下
10的水溶液中進行如下三
34"C，反應9
34"C，反應9
15小時，主 15小時；再
<formula>formula see original document page 6</formula> 上述定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法為在pH5 種反應之一，定向合成胞苷磷酰化合物
(a)在28 4(TC下，反應3小時，主要產物為CTP ;
(b)在28 4(TC下，反應3小時；再調整溫度至28 要產物為CDPC ; (c)在28 4(TC下，反應3小時；再調整溫度至28 調整溫度至20 27°C，反應6 10小時，主要產物為CDP。 其中，底物CMP的起始反應濃度為10 100mmol/L，優選20 50mmol/L ;氯化膽堿 的起始反應濃度為10 300mmol/L，優選20 150mmol/L ;磷酸根離子的起始反應濃度為 0. 1 2mol/L，優選0. 2 0. 5mol/L ;葡萄糖的起始反應濃度為0. 1 lmol/L，優選0. 2 0. 5mol/L ;微生物細胞的加入量為按濕菌體計100 800g/L，優選200 600g/L。磷酸離 子可選自正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等無機 磷酸鹽。 其中，反應體系還加入Mr^+離子和二硫蘇糖醇的組合物；Mn"起始反應濃度為1 200mmol/L，優選10 100mmol/L ;二硫蘇糖醇起始反應濃度為1 200mmol/L，優選10 100,1/L。 其中，所述的微生物細胞是指能夠利用CMP合成CDPC的微生物，包括氣桿菌屬、埃希氏菌屬、賽氏桿菌屬、微球菌屬的細菌；酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德 巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬的酵母。優選大腸桿菌、 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母或白球擬酵母。 其中，所述的有透性的微生物細胞是指通過化學、物理或生物方法處理過的細胞 膜的通透性改變過的微生物細胞，具體方法包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法、超聲 波處理法、風干法、冷凍干燥法或溶菌酶法。 表面活性劑法中使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑聚環氧乙烷胺或曲 拉通X-100、陽離子型表面活性劑十六烷基三甲胺 溴化物，或者陰離子表面活性劑月桂 酰 肌氨酸鹽，使用量為0. 1 50g/L，優選1 20g/L，即表面活性劑法處理酵母細胞時， 將表面活性劑直接加入反應液，對于總體積為1L的反應液，加入0. 1 50g，優選加入1 20g。 有機溶劑法中使用的有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用量
為0. 1 50mL/L，優選1 20mL/L，即有機溶劑法處理生產菌株時，將有機溶劑直接加入反
應液，對于總體積為1L的反應液，加入0. 1 50mL，優選加入1 20mL。 上述酵母的利用形式可以是酵母細胞的干燥物、經過發酵培養分離離心得到的細
胞、細胞的凍干物、市售酵母粉、風干酵母或廢酵母泥。 本發明的有益效果為 本發明提供了一種定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，以CMP、氯化膽堿和磷 酸根離子為底物，以葡萄糖作為能量供體，利用有透性的微生物細胞為酶源，通過改變反應 溫度為手段，促使反應體系定向生物催化合成胞苷磷酰化合物。本發明可以根據需求生產 三種物質的任意之一種，反應體系簡單，無毒，生產成本低廉，控制手段簡單易行，極大方便 了工業化中的生產控制。以CMP做底物時CDP、 CTP和CDP-膽堿的得率分別可達到80%、 91. 8%、93. 3%。
具體實施例方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。
實施例1 : 酵母培養基葡萄糖40g/L，尿素2. Og/L，磷酸二氫鉀1. 5g/L，七水合硫酸鋅 4. OX 10—3g/L，七水合硫酸亞鐵3. OX 10—3g/L，四水合氯化錳0. 3X 10—3g/L，無水氯化鈣 1. 0 X 10—3g/L，生物素0. 05 X 10—3g/L。酵母接種量10^，于30。C下120rpm搖床培養24小時，離心4000rpm，20分鐘。取
酵母泥，-7t:保藏備用。 實施例2 :利用CMP定向生產CTP。 在容量15L的反應槽中調制由CMP 300mmol、氯化膽堿100mmol、葡萄糖5mol、硫酸 錳500mmol、二硫蘇糖醇300mmol、按實施例1的方法培養的枯草芽孢桿菌2400g，磷酸二氫 鉀3mo1，曲拉通X-1001g和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為7.0，溫度為35t:，反應 3小時后結束反應，用高氯酸沉淀，用HPLC對產物進行定量分析，轉化液中主要產物為CDP，其含量為18. 6mmol/L，得率為62. 1 % ，此時CDP含量為2. 5mmol/L， CDPC含量為5. 8,1/ L。 實施例3 :利用CMP定向生產CTP。 在容量15L的反應槽中調制由CMP 300mmol、氯化膽堿3000mmol、葡萄糖5mol、硝 酸錳500mmol、二硫蘇糖醇300mmol、按實施例1的方法培養的釀酒酵母2500g、磷酸二氫鉀 3mol、甲苯10mL和水組成的反應液IOL，用氫氧化鈉調pH為7. O，溫度為4(TC，反應3小時 后結束反應，用高氯酸沉淀，用HPLC對產物進行定量分析，轉化液中主要產物為CDP，其含 量為27. 5mmol/L，得率為91. 8%，此時CDP含量為0. 7mmol/L， CDPC含量為0. 8mmol/L。
實施例4 :利用CMP定向生產CDPC。 在容量15L的反應槽中調制由CMP 300mmol、氯化膽堿3mol、葡萄糖5mol、硫酸錳 500mmol、二硫蘇糖醇300mmol、按實施例1的方法培養的大腸桿菌2500g，磷酸二氫鉀3mo1， 丙酮10mL和水組成的反應液IOL，用氫氧化鈉調pH為7. O，溫度為35。C，反應3小時后，溫 度調整為28°C ，繼續反應9小時結束反應，用高氯酸沉淀，用HPLC對產物進行定量分析，轉 化液中主要產物為CDPC，其含量為28mmol/L，得率為93. 3%，此時CDP含量為0. 8mmol/L， CTP含量為0. 3mmol/L。 實施例5 :利用CMP定向生產CDPC。 在容量15L的反應槽中調制由CMP 300mmol、氯化膽堿3mol、葡萄糖5mol、硫酸錳 500mmol、二硫蘇糖醇300mmol、按實施例1的方法培養的畢赤酵母2500g，磷酸二氫鉀3mo1、 乙酸乙酯10mL和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為7. O，溫度為40°C，反應3小時后， 溫度調整為34°C ，繼續反應15小時結束反應，用高氯酸沉淀，用HPLC對產物進行定量分析， 轉化液中主要產物為CDPC，其含量為21mmol/L，得率為70. 0%，此時CDP含量為1. 2mmo1/ L， CTP含量為0. 7mmol/L。
實施例6 :利用CMP定向生產CDP。 在容量15L的反應槽中調制由CMP 100mmol、氯化膽堿100mmol、葡萄糖lmol、硫酸 錳20mmol、二硫蘇糖醇10mmol、按實施例1方法培養的大腸桿菌1000g、磷酸二氫鈉2mo1、 曲拉通X-IOO 50g、甲苯50mL和水組成的反應液IOL，用氫氧化鈉調pH為6. 0，溫度為35°C ， 反應3小時后，溫度調整為28t:，繼續反應9小時，溫度再調整為2(TC，繼續反應6小時結 束反應，用高氯酸沉淀，用HPLC對產物進行定量分析，轉化液中主要產物為CDP，其含量為 8mmol/L，得率為80. 0%，此時CTP含量為lmmol/L， CDPC含量為0. 8mmol/L。
實施例7 :利用CMP定向生產CDP。 在容量15L的反應槽中調制由CMP 1000mmol、氯化膽堿3000mmol、葡萄糖lOmol、 氯化錳500mmol、二硫蘇糖醇2mol，按實施例1方法培養的白球擬酵母經反復凍融3次 8000g、磷酸二氫鈉5mo1和水組成的反應液10L，用氫氧化鈉調pH為9.0，溫度為4(TC，反 應3小時后，溫度調整為34t:，繼續反應15小時，溫度再調整為27t:，繼續反應10小時結 束反應，用高氯酸沉淀，用HPLC對產物進行定量分析，轉化液中主要產物為CDP，其含量為 42mmol/L，得率為42. OX，此時CTP含量為0. 5mmol/L， CDPC含量為11mmol/L。
權利要求
一種定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征在于以CMP、氯化膽堿和磷酸根離子為底物，以葡萄糖作為能量供體，利用有透性的微生物細胞為酶源，通過改變反應溫度為手段，促使反應體系生物催化合成胞苷磷酰化合物。
2. 根據權利要求1所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征在于所述胞苷 磷酰化合物為胞苷二磷酸、胞苷三磷酸或CDP-膽堿，其結構式如下
3. 根據權利要求2所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征在于在 <formula>formula see original document page 2</formula>pH5 10的水溶液中進行如下三種反應之一，定向合成胞苷磷酰化合物(a) 在28 4(TC下，反應3小時，主要產物為CTP ;(b) 在28 4(TC下，反應3小時；再調整溫度至28 34"，反應9 15小時，主要產 物為CDPC ;(c) 在28 4(TC下，反應3小時；再調整溫度至28 34"，反應9 15小時；再調整 溫度至20 27t:，反應6 10小時，主要產物為CDP。
4. 根據權利要求1 3中任意一項所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其 特征在于底物CMP的起始反應濃度為10 100mmol/L，氯化膽堿的起始反應濃度為10 300mmol/L，磷酸根離子的起始反應濃度為0. 1 2mol/L，葡萄糖的起始反應濃度為0. 1 lmol/L，微生物細胞的加入量為按濕菌體計100 800g/L。
5. 根據權利要求1 3中任意一項所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特 征在于所述的反應體系還加入Mr^+離子和二硫蘇糖醇的組合物；Mn"起始反應濃度為1 200mmol/L，二硫蘇糖醇起始反應濃度為1 200mmol/L。
6. 根據權利要求1 3中任意一項所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特 征在于所述的微生物細胞是指能夠利用CMP合成CDPC的微生物，包括氣桿菌屬、埃希氏菌 屬、賽氏桿菌屬、微球菌屬的細菌；酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵 母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬的酵母。
7. 根據權利要求1 3中任意一項所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特 征在于所述的有透性的微生物細胞是指通過化學、物理或生物方法處理過的細胞膜的通透 性改變過的微生物細胞，具體方法包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法、超聲波處理法、風干法、冷凍干燥法或溶菌酶法。
8. 根據權利要求7所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征是表面活性劑 法中使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑或者陰離子表面活性 劑，使用量為0. 1 50g/L。
9. 根據權利要求7所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征是有機溶劑法 中使用的有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用量為0. 1 50mL/L。
全文摘要
本發明公開了一種定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，以CMP、氯化膽堿和磷酸根離子為底物，以葡萄糖作為能量供體，利用有透性的微生物細胞為酶源，通過改變反應溫度為手段，促使反應體系定向生物催化合成胞苷磷酰化合物。本發明可以根據需求生產三種物質的任意之一種，反應體系簡單，無毒，生產成本低廉，控制手段簡單易行，極大方便了工業化中的生產控制。以CMP做底物時CDP、CTP和CDP-膽堿的得率分別可達到80％、91.8％、93.3％。
文檔編號C12P19/30GK101792786SQ20101011820
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月4日 優先權日2010年3月4日
發明者應漢杰, 柏建新, 湯佳鵬, 熊健, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業大學