專利名稱：：一種siRNA在制備抑制腫瘤遷移藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一個生存素survivin基因為耙標的小分子干擾RNA(siRNA)在制備抑制腫瘤遷移藥物中的用途。
背景技術：
：惡性腫瘤是當前威脅人類生命健康的主要殺手之一，目前還沒有找到真正有效的根治方法，這迫使科研工作者不斷尋找新的技術和方法，試圖從根本上攻克癌癥。RNA干擾技術(RNAi)是近幾年發展起來的被認為是研究功能基因組最有力工具之一。這種新興的生物技術為腫瘤分子水平的基因治療提供了新的技術和方法。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是由雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)dsRNA)介導的轉錄后的基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)現象。通過在多種生物細胞內導入外源或內源的dsRNA可以使內源性mRNA發生特異性降解，從而引起相應基因轉錄的阻抑。RNAi己作為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。Survivin是1997年耶魯大學Aitieric.DC等人在人類基因組庫中首先篩選分離出來的IAP(凋亡抑制蛋白)家族的一個成員。它定位于17q25,該基因幾乎在所有種類的腫瘤組織中特異性地表達，而正常組織幾乎沒有表達；該基因在腫瘤細胞中高表達后，不但促進腫瘤細胞抗凋亡、促進腫瘤細胞有絲分裂、參與血管形成和放化療耐受多種功能，而引起了國內外學者的廣泛關注。有研究者(丄abInvest,1999,79(11):1327-1333;AmJPathol,1998,152(1):43-49)對正常增殖細胞中survivin基因的潛在分布進行研究發現包括皮膚表面的角化細胞、腸道的上皮細胞和正常的骨髓細胞在內，在各種有絲分裂細胞系中均沒有檢測到survivin基因的表達；survivin具有在腫瘤組織中表達特異性強、表達率高，而在正常組織中不表達的特點以及在腫瘤的發生、發展及抗藥性等諸多方面所扮演的重要角色而使它很有可能成為腫瘤基因治療理想的新耙點。腫瘤的難治還在于腫瘤的天然耐藥以及后期治療時產生的耐受。腫瘤本身高表達survivin能保護化療藥和放射線對腫瘤的殺傷:相反，不足量的化療藥或放射線也能誘導survivin的表達，產生對治療的繼發耐受。研究表明，survivin能抑制某些化療藥物、IL-3，TNF-a,X射線誘導的Fas,Caspase,Bax等參與的凋亡信號通路(CancerRes,1998，58(23):5315-5320;JCancerRes，2000，91(11):1204-1209)。但假如其唯一的BIR區發生C84A的突變，survivin也就喪失對抗化療藥物Taxol誘導的凋亡的抵抗作用。血管形成過程取決于血管內皮細胞生存和凋亡的平衡。正常情況下，血管內皮細胞中很難檢測到survivin。在血管內皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的刺激下，靜止的血管內皮表達survivin的能力約可增強4倍，VEGF的許多抗凋亡活性都是通過誘導內皮細胞表達survivin來實現的(AmJPathol,2001,158(5):1757-1765)。血管生成素一l(angiopoietin-l，Ang-l)是胚胎血管形成過程中維持血管穩定性和管腔形成的關鍵因子。它沒有促進內-皮細胞生長一而^:促進^&^_1穩定和分枝血管的形成。研究發現，Ang-1可以促進內皮細胞中survivin表達，通過Akt(或蛋白激酶B)途徑激活survivin的抗凋亡活性，從而阻止內皮細胞凋亡，在體內血管形成過程中穩定血管結構(JBiolChem,2000,275(3):9102-9105)。新血管生成是腫瘤生長和轉移的必要因素，因此抑制survivin的表達可能對防止腫瘤細胞的浸潤、遷移起重要作用。己有多項動物實驗證明，反義survivinRNA或survivin突變體可以有效抑制實體瘤的血管形成和腫瘤的侵襲增殖。因此，survivin基因可以作為腫瘤治療的新耙點。最早的針對survivin的RNAi研究報導于2003年，Carvalho等用小分子干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)轉染HeLa細胞，60h后蛋白印跡結果顯示治療組中己檢測不到survivin的表達，細胞增殖明顯受抑，部分細胞有絲分裂受到阻滯，出現凋亡(JCellSci,2003，116(14):2987-2998)。隨著RNAi技術的不斷完善，由原來直接導入外源的siRNA，發展到真核表達載體轉錄產生siRNA，以及用于RNAi的病毒載體的出現，大大提高了轉染效率和干擾效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核載體轉染肝細胞癌SMMC7721細胞，發現轉染細胞中幾乎沒有survivin基因的表達，轉染細胞自發的凋亡增加，G2/M期細胞比例減少，細胞增殖減慢(WorldJGastroenterol2005,11(5):756-759)。目前針對survivin的RNAi研究進展迅速，體外實驗顯示了良好的效果，相信不遠的將來會有更為豐富和完善的研究結果出現。應用RNA干擾技術，以小分子RNA作為耙向藥物，有針對性地對survivin基因的轉錄后表達進行干擾，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，抑制腫瘤轉移時的血管形成和降低腫瘤細胞放化療的耐受性，多層次，多途徑對腫瘤進行抑制，這可能成為了一種新的腫瘤治療策略。而且survivin基因選擇性地表達在幾乎所有種類的腫瘤組織中，而正常組織幾乎不表達，則可使這種基因治療對正常組織和細胞的毒副作用降到最低，應用RNAi特異地抑制survivin等腫瘤相關基因的表達有望成為一種新的腫瘤基因治療方式。
發明內容本發明公開了一種高效的針對survivin基因的廣譜的小分子干擾RNA(siRNA)抑制腫瘤遷移藥物，由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成正義鏈5'-AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt-3'，反義鏈3'-ttUUUCGUAAGCAGGCCAACG-5'其中X代表tt、TT或UU。t代表脫氧胸腺嘧啶dT。X優選代表tt。本發明的小分子干擾RNA是主要針對survivin基因丌放閱讀框(ORF)的功能保守區設計的雙鏈siRNA，藥理試驗證明本發明的小分子干擾RNA具有廣譜的抑制腫瘤遷移作用，對MDA-MB-435、胃癌MGC-803、肝癌Bel-7402細胞在體外均有抑制它們遷移作用，該序列的TH義鏈與survivin基因的mRNA結合，干擾survivin基因mRNA的翻譯，從而抑制腫瘤細胞遷移，達到抑制腫瘤擴散的目的。本發明是一種全新作用機制的制腫瘤細胞遷移的新型藥物，可能為腫瘤的治療帶來了新的希望。本發明所述的腫瘤疾病包括乳腺癌、胃癌、肝癌細胞。在臨床使用中，可以將本發明小分子干擾RNA(簡稱CPUsiRNA4)溶于不含RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，建議CPUsiRNA4為10微克/微升。取適量CPUsiRNA4與小分子干擾RNA轉染試劑RNAi-Mate混合，在室溫溫宵30分鐘，以形成CPUsiRNA4-RNAi-Mate復合物。將制備好的CPUsiRNA4-RNAi-Mate復合物按5-500nmol/kg靜脈給藥，一天一次，20天左右一個療程。具體實施例方式實施例1siRNA的設計與合成儀器OligoPilotIIDNA/RNASynthesizer(瑞典Pharmacia公司)，HP-1100型高效液相色譜儀(美國惠普公司)，DU2640紫外分光光度計(關國Backman公司)。材料和試劑合成柱(6.3mL)，分子篩(3ASigma)，30HL載體(批號256723)，RNAPacPA100分析柱(美國Dionex公司)，5種核苷酸單體(A,U，C，G,dT),乙腈，二氯乙酸，四唑，N2甲基咪唑，除注明廠家外，其余為瑞典Pharmacia公司產品。siRNA的設計根據survivin基因丌放閱讀框(ORF)的序列，設計小分子干擾RNACPUsiRNA4和1對負對照siRNA,將他們的序列在人類EST數據庫中比對，確定沒有與他們相同的其它基因序列。CPUsiRNA4IK義鏈IF.義鏈5'-AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt-3'，反義鏈3'-ttUUUCGUAAGCAGGCCAACG-5'。負對照siRNA的正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3，，反義鏈5，-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3，。siRNA的設計后送上海吉馬公司合成。siRNA的化學合成'用乙腈將5種單體(A,U，C,G,dT)配制成0.2mol/L溶液，分別將5種單體、乙腈、二氯乙酸、四唑安裝到合成儀相應位置，其中單體、乙腈、四唑應加入適當分子篩。合成歩驟(1)利用二氯乙酸處理結合于固相載體的核苷酸或寡核苷酸，脫去其5'輕基官能團上的二甲氧基三苯甲基(DMT)保護基團，露出反應性的5，端；(2)偶聯反應由四唑催化完成，形成3'—5'磷酸酯鏈；(3)封閉反應將未反應5'羥基在N2甲基咪唑催化下由乙酸酐來完成。RNA合成儀按照設計好的程序合成出CPUsiRNA4和負對照siRNA的單鏈RNA。應用紫外分光光度計檢測D260nm值，并計算產量。合成粗產品的HPLC色譜分析色譜柱DNA2PacPA2100(4mmX250mm);樣品20OD/mL,進樣的量20uL;流動相A:25mmol/LTris，1mmol/LEDTA，10%乙腈，pH8;流動相B:25mmol/LTris,1mmol/LEDTA，3mol/LNH4C1,pH8;洗脫梯度流動相B在40min內從10%到70%;流速1mL/min;檢測波長260nm;柱溫50。C。合成的單鏈RNA的正義鏈和反義鏈后，退火成雙鏈的CPUsiRNA4和負對照siRNA,之后進行HPLC純化的純度大于97%的雙鏈CPUsiRNA4和負對照siRNA。實施例2CPUsiRNA4改變腫瘤細胞與IV型膠原蛋白間黏附能力實驗材料人胃癌細胞MGC-803人乳腺癌細胞株MDA-MB-435人肝癌細胞株Bd-740224孔培養板Thincert侵襲小室(孔徑8pm)主要試劑RPMI1640培養基干粉胰蛋白酶MTT主要儀器水平電泳槽中國藥科大學腫瘤藥理實驗室中國藥科大學腫瘤藥理實驗室中國藥科大學新藥篩選中心Coming公司Greiner公司Gibco公司Amersco公司Sigma公司南京大學儀器恒溫振蕩器上海智誠分析儀器制造公司熒光倒置顯微鏡Leica公司實驗方法腫瘤細胞與IV型膠原蛋白間黏附能力的檢測參照Herren等的方法，采用MTT法測定癌細胞與IV型膠原蛋白間的黏附能力。具體操作如下IV型膠原蛋白包被96孔培養板將IV型膠原蛋白儲液用PBS稀釋成0.1mg/mL，按50nL/孔加入到96孔培養板中，4'C過夜后再于37'C下孵育2h，然后吸去上情。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1.5X104個/孔接種到已包被IV型膠原蛋白的96孔培養板中于37'C，5n/。CO2條件下培養0.5h后，將細胞分為兩組(1)黏附細胞組，用PBS小心洗滌2~3遍除去未黏附的細胞，然后采用MTT法測定黏附細胞的吸光度值；(2)總細胞組，不甩PBS洗滌，直接采用MTT法測定吸光度值(A)。每組設6個平行孔。同時，測定IV型膠原蛋白包被但未接種細胞的孔作為空白對照(control)。按照如下公式計算黏附率(Adhesionrate):Adhess幼ratef/》-1—:X100o/0實驗結果表1小分子千擾RNA改變腫瘤細胞對IV型膠原蛋白間黏附能力ceii/cpus艦4QnM25nM50nM100nM150nM200nMMDA-MB-435100%48.0**±3.7%37.9**±l.8%25.5"±2.4%21.6**±1.6%17.1**±3.5%MGC-803100%78.1*±4.5%64.0**±2.5%59.8**±1.7%54.2**±0.1%38.4**±1.2%Bel-7402i000/o83.2±3.4。/076.2*±0.9%69.8*±2.7°/066.9*±l.3%61.1**±4.0°/o注n=8,mean±SD，重復3次，*為卩<0.05(有顯苦差異)**為卩<0.01(有極顯《差異)實驗結果表明小分子干擾RNA能明顯改變乳腺癌細胞MDA-MB-435、胃癌細胞MGC-803和肝癌細胞Bel-7402對IV型膠原蛋白間黏附能力。實施例3CPUSIRNA4抑制腫瘤細胞二維水平細胞遷移能力實驗材料與主要試劑實施例2二維水平細胞遷移實驗參照Nakayama等的方法，采用劃痕損傷模型分析小分子干擾RNA在二維水平上對腫瘤細胞的遷移能力的影響，操作歩驟如下(1)用0.25°/。胰蛋白酶消化細胞，按6X104個/孔接種到24孔培養板中，于37'C，5°/。C02條件下培養；(2)次閂，待細胞長成均勻單層后，用無菌的1000jiL移液器吸頭延孔的中軸線輕輕劃過。用37'C預熱的PBS輕輕洗滌23遍除去漂起的細胞殘骸后，加入37'C預熱的培養基，放入培養箱中繼續培養；(3)培養0.5lh后(待細胞恢復)，以這一時間作為零時間點，分別在O、12、24h時通過倒置顯微鏡下(50X)觀察細胞遷移情況并利用目鏡刻度尺測量劃痕寬度(S)，每孔測量5處(即兩端、中點、左l/4處和右l/4處)求平均值，直至細胞完全匯合。每組細胞均設三個平行孔。按照如卜'公式計算細胞遷移率(Migrationrate)-S—StimezerotimepoinlMigrationrate(%)=^X100o/o。limezero表lCPUSIRNA4抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞二維水平細胞遷移能力乳腺癌MDA-MB-435胃癌細胞MGC-803肝癌絀胞Bel-7402負對照<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實驗結果表明小分子干擾RNA能明顯改變乳腺癌細胞MDA-MB-435、胃癌細胞MGC-803和肝癌細胞Bel-7402二維水平細胞遷移能力。實施例4CPUSIRNA4抑制腫瘤細胞三維水平細胞遷移能力實驗材料與主要試劑實施例2采用侵襲小室模型分析小分子干擾RNA在三維水平上對腫瘤細胞的遷移能力的影響，具體操作如下(1)將細胞用無血清DMEM培養基培養12h后，用0.25%胰蛋白酶消化、無血清RPMI-1640培養基制備單細胞懸液，調整濃度為2.5X1()S個/mL;(2)向24孔培養板中加入600nL含10%小牛血清的RPMI-1640培養基，然后將Thincert侵襲小室浸入，再向小室中加入200pL無血清單細胞懸液(即5.0乂104個細胞)；(3)37°C，5%C02培養20h后，取出Thincert小室，用棉簽小心將膜上表面的細胞擦拭去除；(4)用手術刀片小心沿小室邊緣將膜切下，把膜下表面向上放在一個潔凈的24孔培養板的孔中；(5)將膜用甲醇冰醋酸(3:1)固定10min，然后用10%姬姆薩染液染色1530min;將膜用蒸餾水漂洗干凈后在倒置顯微鏡下(200X)隨機選取6個視野(上、下、左、右各一，中央兩個)計數細胞(呈紫紅色)。表lCPUSIRNA4抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞三維水平細胞遷移能力乳腺癌MDA-MB-435胃癌細胞MGC-803肝癌細胞Bel-7402負對照R100nm負對照R100nm負對照R100nmmean134.856.6201.0157.8104-083-8SD34.113.146.736.813-9U'9實驗結果表明小分子干擾RNA能明顯改變乳腺癌細胞MDA-MB-435、胃癌細胞MGC-803和肝癌細胞Bel-7402三維水平細胞遷移能力。一種si脂A在制備抑制腫瘤遷移藥物中的用途序列<110>申請人姓名宜春學院<120〉發明名稱一種siRNA在制備抑制腫瘤遷移藥物中的用途〈160〉序列表中序列的個數6〈210〉序列相對應的序列標識符-1〈211〉序列長度21〈212〉序列的類型RNA〈213〉生物體人工序列〈400〉序列標識符1AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt〈210〉序列相對應的序列標識符2〈211〉序列長度21〈212〉序列的類型RNA〈213〉生物體人工序列〈400〉序列標識符2GCAACCGGACGAAUGCUUUtt〈210〉序列相對應的序列標識符3〈211〉序列長度21〈212〉序列的類型RNA〈213〉生物體人工序列〈400〉序列標識符3AAAGCAUUCGUCCGGUUGCTT〈210〉序列相對應的序列標識符4〈211〉序列長度21〈212〉序列的類型RNA〈213〉生物體人工序列〈400〉序列標識符4GCAACCGGACGAAUGCUUUTT〈210〉序列相對應的序列標識符5〈211〉序列長度21〈212〉序列的類型RNA〈213〉生物體人工序列〈400〉序列標識符5AAAGCAUUCGUCCGGUUGCUU〈210〉序列相對應的序列標識符6〈211〉序列長度21〈212〉序列的類型RNA〈213〉生物體人工序列〈400〉序列標識符6GCAACCGGACGAAUGCUUUUU權利要求1、一種雙鏈小分子干擾RNA，其特征是由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成正義鏈5′AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt-3′，反義鏈3′-ttUUUCGUAAGCAGGCCAACG-5′其中X代表tt、TT或UU。2、權利要求1的雙鏈小分子干擾RNA,其中X代表tt，t為脫氧胸腺嘧啶。3、權利要求1或要求2的雙鏈小分子干擾RNA在制備抑制腫瘤轉移藥物中的用途。其特征在于所述的小分子干擾RNA可以改變乳腺癌、胃癌、肝癌細胞的黏附力，顯著抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞的遷移能力。4、權利要求3所述的特征在于小分子干擾RNA可以改變乳腺癌、胃癌、肝癌細胞對IV型膠原蛋白的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞二維、三維水平上的遷移能力。5、權利要求3或要求4所述的特征在于可以制備抑制腫瘤轉移藥物。全文摘要本發明涉及一種小分子干擾RNA在制備抑制腫瘤轉移藥物中的用途，這種小分子干擾RNA可以沉沒survivin基因表達，可以改變乳腺癌、胃癌、肝癌細胞的黏附力，顯著抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞的遷移能力。可以改變乳腺癌、胃癌、肝癌細胞對IV型膠原蛋白的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞二維、三維水平上的遷移能力。這種小分子干擾RNA可以制備抑制腫瘤轉移的藥物。文檔編號C07H21/02GK101445535SQ200810136598公開日2009年6月3日申請日期2008年12月24日優先權日2008年12月24日發明者陸云華申請人:宜春學院