一種制備絲素微球的自組裝方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備絲素微球的自組裝方法，將家蠶繭層剪碎，投入到Na2CO3水溶液中進行脫膠處理，用去離子水清洗；將洗凈的絲素樣投入Na2CO3水溶液中再進行脫膠處理后，用去離子水清洗后，將絲素樣攤平置于烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維等，直到得到乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品，本發明在不添加任何有毒化學交聯劑的條件下制備了絲素微球，制備工藝簡單、反應條件溫和，有利于保持絲素蛋白結構特征、提高絲素蛋白的利用率、降低生產成本，提高絲素微球的產量。本發明制備的絲素微球可用于載藥微系統、細胞攝取等領域，為生物醫學的發展提供新思路與方法。
【專利說明】—種制備絲素微球的自組裝方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于一種絲素微球的制備方法，具體的說，是一種絲素微球的自組裝方法。【背景技術】
[0002]絲素蛋白是蠶絲最主要的組成部分，約占2/3，由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種氨基酸所組成，是一種天然蛋白質，因其良好的機械性能、生物相容性、生物降解性、透氣透氧性和吸濕保濕等特點，在生物醫學、化妝品、食品等領域中得到越來越廣泛的研究與應用([J]Progress in Polymer Science, 2007，32:991-1007)。以絲素蛋白為原料制備的絲素微球，具有比表面積大、生物相容性好、可生物降解、較好的流動性和擴散性等優點，因此被廣泛的研究。傳統的制備絲素微球的方法主要有乳化法、噴霧干燥法、層流射流技術、機械粉碎法、鹽析法等。但是采用傳統方法(如乳化法、噴霧干燥法、層流射流法)在制備過程中加入的有機溶劑去除不徹底會引起毒性問題；另外制備出的微球粒徑較大，并且制備條件需要高壓高溫破壞蛋白質的結構。近年來，自組裝已成為一種新型的合成方法，其反應條件溫和，自組裝法成為絲素蛋白微球制備的首選方法。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足，提供一種操作簡便、反應條件溫和、不添加任何化學交聯劑而獲得具有較小粒徑的絲素蛋白微球的方法。
[0004]本發明是通過如下技術方案實現的:
[0005]一種制備絲素 微球的自組裝方法特征在于，包括如下步驟:(I)將家蠶繭層剪碎，以(1:50) - (1:00)的浴比投入到質量百分比為0.3%-0.7%的Na2CO3水溶液中進行脫膠處理25-35min后，用去離子水清洗1_3次；將洗凈的絲素樣投入質量百分比為0.3%_0.7%的Na2CO3水溶液中再進行脫膠處理25-35min后，用去離子水清洗1_3次后，將絲素樣攤平置于40-50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；
[0006](2)將步驟(1)中的家蠶絲素纖維投加到濃度為7-llmol/L的LiBr溶液中置于搖床中5-8h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析3-5d得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液；
[0007](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為3%_7%的溶液；
[0008](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5-10min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為(1:5) - (1:8)，繼續磁力攪拌器10-30min ；
[0009](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C~_80°C冰箱中冷凍24_48h ；
[0010](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0011 ] 作為進一步地改進，本發明所述步驟(1)中Na2CO3水溶液的溫度為85_105°C，沸水浴能夠提高脫膠的徹底性，提高絲素蛋白的純度，使制備的球表面更加光滑。
[0012]作為進一步地改進，本發明所述步驟(1)中，將家蠶蠶繭剪碎，以1:100的浴比投加到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中進行脫膠處理。
[0013]作為進一步地改進，本發明所述步驟(1)中，脫膠處理30min中后，用去離子水清洗2次，再脫膠30min，去離子水清洗3次，再進行溫度為50°C烘干得到家蠶絲素纖維。多次清洗樣品可徹底清除絲膠蛋白的干擾；溫度適宜，不會影響絲素蛋白結構的改變。
[0014]作為進一步地改進，本發明所述的步驟(2)中，將步驟(1)中的家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中6h，加速溶解并降低分子量從而得到絲素溶液。
[0015]作為進一步地改進，本發明所述的步驟(2)中，LiBr溶液的濃度為8-lOmol/L。
[0016]作為進一步地改進，本發明所述的步驟(2)中，LiBr溶液的濃度為9mol/L，使絲素在較短的時間內溶解的更加徹底，LiBr溶液的濃度過高會使透析的時間過長，并且透析不徹底，如果過低，絲素溶液溶解的處理時間過長，會發生凝膠現象。
[0017]作為進一步地改進，本發明所述的步驟(3)中的純絲素溶液調整為濃度為3%的溶液，能夠使制備的絲素微球微粒直徑控制在Ium左右，微球粒徑分布均勻。
[0018]作為進一步地改進，本發明所述的步驟(4)中，將步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 5，繼續磁力攪拌器30min,能夠微球粒徑分布均勻,微球分散性良好。
[0019]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:在不添加任何有毒化學交聯劑的條件下制備了絲素微球，制備工藝簡單、反應條件溫和，有利于保持絲素蛋白結構特征、提高絲素蛋白的利用率 、降低生產成本，提高絲素微球的產量。本發明制備的絲素微球可用于載藥微系統、細胞攝取等領域，為生物醫學的發展提供新思路與方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是本發明實施例1中絲素微球的電鏡圖；
[0021]圖2是本發明實施例3中絲素微球的電鏡圖；
[0022]圖3是本發明實施例5中絲素微球的電鏡圖；
[0023]圖4是本發明實施例6中絲素微球的電鏡圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖并通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發明的解釋而本發明并不局限于以下實施例。
[0025]實施例1
[0026]本實施例中絲素微球的制備方法依次包括如下步驟。
[0027](I)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0028](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中6h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析4天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。本發明可以將步驟(1)中的絲素蛋白置于一定濃度LiBr溶液中溶解處理一定時間，獲得粘稠液體:所用的LiBr溶液濃度通常為7~11M，優選為8-10M，最佳為9M ;所用的處理時間為5_8h，最佳是6h。
[0029](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為3%_7%的溶液，優選3%的濃度。
[0030](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 5，繼續磁力攪拌器30min。
[0031](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷凍24h。
[0032](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0033](7)如圖1，該絲素微球顆粒直徑為0.694±0.210 μ m，微球粒徑分布較均勻，分散性良好，微球表面較光滑，呈規則的球狀這說明控制一定的條件可以制備出粒徑均勻，分散性良好的絲素微球。
[0034]實施例2
[0035](I)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0036](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中5h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析4天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。
[0037](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為3%的溶液。
[0038](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 8，繼續磁力攪拌器30min。
[0039](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷凍24h。
[0040](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0041](7)該絲素微球顆粒直徑為1.192±0.137 μ m。
[0042]實施例3
[0043](I)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0044](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中5h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析4天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。
[0045](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為5%的溶液。
[0046](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積 比為1: 5，繼續磁力攪拌器30min。
[0047](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷凍24h。
[0048](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。[0049](7)如圖2，該絲素微球顆粒直徑為1.519±0.134 μ m。微球粒徑分布較均勻，分散性不佳，多數微球呈現規則的球狀，這說明增加絲素濃度后，微球粒徑增加，隨著溶液粘稠度增加，部分絲素蛋白沒有充分與異丙醇反應，而呈現出形狀不規則，分散性不佳的現象。
[0050]實施例4
[0051](I)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0052](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中5h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析4天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。
[0053](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為5%的溶液。
[0054](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 8，繼續磁力攪拌器30min。
[0055](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷凍24h。
[0056](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0057](7)該絲素微球顆粒直徑為2.356±0.148 μ m。
[0058]實施例5
[0059](I)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0060](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中6h，加速溶解得 到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析5天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。
[0061](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為7%的溶液。
[0062](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 5，繼續磁力攪拌器30min。
[0063](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷凍48h。
[0064](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0065](7)如圖3，該絲素微球顆粒直徑為5.103±0.217 μ m。微球粒徑分布較均勻，但分散性不佳，有堆疊區域，偶有塊狀不規則形狀，這說明絲素溶液濃度越大，微球粒徑越大，并且隨著溶液粘稠度的增高，其分散性變差，絲素微球堆疊現象嚴重。
[0066]實施例6
[0067](I)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0068](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中6h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析4天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。
[0069](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為7%的溶液。
[0070](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 8，繼續磁力攪拌器30min。
[0071](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷凍48h。
[0072](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0073](7)如圖4，該絲素微球顆粒直徑為4.083±0.182 μ m。微球粒徑明顯增大，分散性不佳，有粘連現象及堆疊現象出現，并有不規則形狀，這說明，絲素溶液濃度和體積增大，微球粒徑明顯增加，溶液粘稠度增加使自組裝反應不充分，呈現出不規則形狀，并伴有粘連和堆疊現象。
[0074]實施例7
[0075](1)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0076](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中7h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析3天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。
[0077](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為3%的溶液。
[0078](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 5，繼續磁力攪拌器30min。
[0079](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷凍24h。
[0080](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0081](7)該絲素微球顆粒直徑為0.717±0.255 μ m。
[0082]實施例8
[0083](I)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0084](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中5h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析4天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。
[0085](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為3%的溶液。
[0086](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 5，繼續磁力攪拌器30min。
[0087](5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷凍48h。
[0088](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0089](7)該絲素微球顆粒直徑為0.679±0.199 μ m。
[0090]實施例9
[0091](I)將家蠶蠶繭剪碎，稱取20g以1:00的浴比投入到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中進行脫膠處理，脫膠處理30min后，用去離子水清洗2次；再重復以上步驟，用去離子水清洗3次后，將絲素樣攤平置于50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維；所述Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
[0092](2)稱取步驟(1)中的IOg家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中5h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析3天得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液。
[0093](3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為濃度為5%的溶液。
[0094](4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 5，繼續磁力攪拌器30min。
[0095](5)將步驟(4)中的溶液置于_80°C冰箱中冷凍48h。
[0096](6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
[0097](7)該絲素微球顆粒直徑為1.4529±0.162 μ m。
[0098]以上列舉的僅是本發明的部分具體實施例，顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形，本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將家蠶繭層剪碎，以(1:50)-(1:00)的浴比投入到質量百分比為0.3%-0.7%的Na2CO3水溶液中進行脫膠處理25-35min后，用去離子水清洗1_3次；將洗凈的絲素樣投入質量百分比為0.3%-0.7%的Na2CO3水溶液中再進行脫膠處理25_35min后，用去離子水清洗1-3次后，將絲素樣攤平置于40-50°C的烘箱中烘干得到家蠶絲素纖維； (2)將步驟(1)中的家蠶絲素纖維投加到濃度為7-llmol/L的LiBr溶液中置于搖床中5_8h，加速溶解得到絲素溶液；將絲素溶液放在透析膜中用去離子水透析3-5d得到較純絲素溶液，經自然風干、過濾后得到純絲素溶液； (3)將步驟(2)中的純絲素溶液調整為 濃度為3%-7%的溶液； (4)取步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5-10min，然后依次逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為(1:5) - (1:8)，繼續磁力攪拌器10-30min ； (5)將步驟(4)中的溶液置于_20°C~_80°C冰箱中冷凍24-48h； (6)將步驟(5)中的冷凍樣在室溫下解凍后，觀察呈現乳白色液體，然后冷凍干燥成粉末，從而制得成品。
2.根據權利要求1所述的制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于， 所述步驟(1)中Na2CO3水溶液的溫度為85-105°C。
3.根據權利要求1所述的制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于， 所述步驟(1)中，將家蠶蠶繭剪碎，以1:100的浴比投加到質量百分比為0.5%的Na2CO3水溶液中進行脫膠處理。
4.根據權利要求1所述的制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于， 所述步驟(1)中，脫膠處理30min中后，用去離子水清洗2次，再脫膠30min，去離子水清洗3次，再進行溫度為50°C烘干得到家蠶絲素纖維。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于， 所述的步驟(2)中，將步驟(1)中的家蠶絲素纖維投加到濃度為9mol/L的LiBr溶液中置于搖床中6h，加速溶解并降低分子量從而得到絲素溶液。
6.根據權利要求5所述的制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于， 所述的步驟(2)中，LiBr溶液的濃度為8-lOmol/L。
7.根據權利要求6所述的制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于， 所述的步驟(2)中，LiBr溶液的濃度為9mol/L。
8.根據權利要求1所述的制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于， 所述的步驟(3)中的純絲素溶液調整為濃度為3%的溶液。
9.根據權利要求1或2或3或4或6或7或8所述的制備絲素微球的自組裝方法，其特征在于， 所述的步驟(4)中，將步驟(3)中絲素溶液置于燒杯中磁力攪拌5min，然后逐滴加入異丙醇溶液，使異丙醇與絲素溶液的體積比為1: 5，繼續磁力攪拌器30min。
【文檔編號】C07K1/14GK103965310SQ201410160739
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】朱良均, 潘岳林, 張海萍, 楊明英, 鄧連霞 申請人:浙江大學