由hla分子提呈的分離的九肽及其應用的制作方法

專利名稱：由hla分子提呈的分離的九肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫遺傳學和肽化學。更具體地說，涉及有各種用途如作為免疫原和如HLA-A1的分子的配體的九肽。更具體地說，涉及由HLA-A1的人白細胞抗原提呈的所謂“腫瘤排斥抗原”。這些腫瘤排斥抗原引起(通過HLA分子)與之結合的靶細胞被胞溶性T淋巴細胞(“CTLs”)溶解。
背景技術：
和現有技術對宿主生物體識別或不識別癌細胞的研究在各個方面都取得了進展，對該領域的了解意味著在基本免疫學和腫瘤學上的一些了解。
對小鼠腫瘤的早期研究顯示當移植進同系動物時它們顯示產生導致腫瘤細胞被排斥的分子，這些分子在受體動物中被T-細胞“識別”，并引起導致移植的細胞溶解的胞溶性T細胞應答。在用化學致癌物如甲基膽蒽體外誘導的腫瘤中首先得到這樣的證據。在不同腫瘤中發現腫瘤表達的并激發T-細胞應答的抗原是不同的，參見Prehn等，國家癌癥研究雜志18769-778(1957)；Klein等，癌癥研究201561-1572(1960)；Gross，癌癥研究3326-333(1943)，，Basombrio，癌癥研究302458-2462(1970)的關于用化學致癌物誘導腫瘤和細胞表面抗原差異的一般知識。這類抗原被人們熟知為“腫瘤特異移植抗原”或“TSTAs”。在觀察了化學致癌物誘導時出現這樣的抗原之后，在體外用紫外輻射誘導腫瘤時也得到了同樣的結果，參見Kripke，國家癌癥研究雜志53333-336(1974)。
盡管在上面描述的腫瘤類型中觀察到了T-細胞介導的免疫應答，但自發腫瘤一般被認為是非免疫原性的，所以認為它們不能提呈在腫瘤患者中引起對腫瘤的應答的抗原，參見Hewitt，等，英國癌癥雜志33241-259(1976)。
提呈tum-抗原的細胞系的家族是通過誘變小鼠腫瘤細胞或細胞系得到的免疫原性突變體，如Boon等，實驗醫學雜志1521184-1193(1980)所述，該出版物作為參考文獻。詳細地說，是通過使在同系小鼠中不產生免疫應答并將形成腫瘤的腫瘤細胞(即“tum+”細胞)突變得到tum-抗原，當將這些tum+細胞誘變時，它們被同系小鼠排斥，不能形成腫瘤(所以是“tum-”)，參見Boon等，美國國家科學進展74272(1977)，該出版物作為參考文獻。已經證明許多腫瘤類型具有這一現象，參見例如，Frost等，癌癥研究43125(1983)。
看來由于tum-突變體啟動了一個免疫排斥過程，因此它們不能形成進行性腫瘤。支持這一假說的證據包括在具有被亞致死輻射抑制的免疫系統的小鼠中腫瘤的“tum-”突變體，即那些不能正常形成腫瘤的突變體能形成腫瘤，Van Pel等，美國國家科學進展765282-5285(1979)；并觀察到在淋巴細胞和巨噬細胞流入中，腹膜內注射的肥大細胞瘤P815的tum-細胞在12-15天呈指數增殖，然后在幾天內消失的現象(Uyttenhove等，實驗醫學雜志1521175-1183(1980))。進一步的證據包括觀察到甚至當施用免疫抑制量的輻射，隨后對細胞進行免疫攻擊時，小鼠獲得免疫記憶，所說免疫記憶能使它們抵抗隨后的對同樣的tum-突變體的免疫攻擊(Boon等，美國國家科學進展74272-275(1977)；Van Pel等，如上所述；Uyttenhove等，如上所述)。
后來的研究發現當誘變自發腫瘤時，產生免疫原性突變體，所說突變體產生應答。的確，這些突變體能引發抗原發性腫瘤的免疫保護應答，參見Van Pel等，實驗醫學雜志1571992-2001(1983)。所以，已經證明在腫瘤中激發產生所謂的“腫瘤排斥抗原”是可能的，該腫瘤是同系排斥反應的靶。當把外來基因轉染進入自發腫瘤中時得到同樣的結果。關于這一點參見Fearson等，癌癥研究482975-1980(1988)。
已經識別了一類抗原，它們提呈于腫瘤細胞表面并被胞毒性T細胞識別導致溶解。這類抗原下文中稱為“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs可能引發或可能不引發抗體反應。對這些抗原的研究程度已經達到借助胞溶性T細胞的體外鑒定研究即由特定的胞溶性T細胞(下文中的“CTL”)子集合鑒定抗原的研究。該子集合通過識別提呈的腫瘤排斥抗原而增殖，并且提呈所說抗原的細胞被溶解。鑒定研究已經鑒別了特異性溶解表達所說抗原的細胞的CTL克隆。這項工作的實例可以在Levy等，癌癥研究進展241-59(1977)；Boon等，實驗醫學雜志1521184-1193(1980)；Brunner等，免疫學雜志1241627-1634(1980)；Maryanski等，歐洲免疫學雜志12406-412(1982)；Palladino等，癌癥研究475074-5079(1987)中找到。對于由CTLs識別的其他類型抗原如次要組織相容性抗原，雄性特異H-Y抗原，以及本文中討論的稱為“tum-”抗原的一類抗原需要這類分析。
上面描述的本發明的腫瘤的范例已知的是P8l5，參見DePlaen等，美國國家科學進展852274-2278(1988)；Szikora等，EMBO J91041-1050(1990)和Sibille等，實驗醫學雜志17235-45(1990)，該出版物作為參考文獻。P815腫瘤是在DBA/2小鼠中用甲基膽蒽誘導并作為體外腫瘤和細胞系培養的肥大細胞瘤。誘變之后P815系已經產生了許多tum-突變體，包括稱為P91A(DePlaen，如上所述)，35B(Szikora，，如上所述)，和P198(Sibille.如上所述)的突變體。與腫瘤排斥抗原相反(這是一個關鍵的差別)tum-抗原僅出現在腫瘤細胞被誘導之后。在未經誘變的給定的腫瘤細胞上存在腫瘤排斥抗原。因此，參照文獻，一個細胞系可以是tum+，如稱為“P1”的系，也可以被誘發產生tum-突變體。由于tum-表型不同于親本細胞系，人們預測tum-細胞系與它們的tum+親本系的DNA是不同的，可以開發這一差別以便在tum-細胞中定位所需的基因。結果發現由于該基因編碼區的點突變，如P91A，35B和P198的tum-突變體的基因不同于它們的正常等位基因，參見Szikora和Sibille，如上所述，和Lurquin等，細胞58293-303(1989)。已經證明本發明的TRAs的情況不是這樣的。這些論文也證明由Ld分子提呈來自tum-抗原的肽用于被CTLs識別。P91A被Ld提呈，P35被Dd提呈，P198被Kd提呈。
與本申請有相同受讓人的，于1992年5月22日申請的PCT申請PCT/US92/04354描述了一個人腫瘤排斥抗原前體編碼基因的家族，稱為MAGE家族。在van der Bruggen等，科學2541643(1991)中也討論了這些基因中的幾個。現在已清楚MAGE家族的各種基因在腫瘤細胞中表達，并能作為診斷這些腫瘤的標記以及用于其中討論的其他目的，參見Traversari等，免疫遺傳學35145(1992)；van der Bruggen等，科學2541643(1991)。現在還沒有能很好證明在細胞表面加工和提呈蛋白質的機制的文獻，在Barinaga，“得到一些“實質”MHC怎樣結合肽”，科學257880(1992)中可以找到對該領域發展的一個粗略回顧；也可參見Fremont等，科學257919(1992)；Matsumura等，科學257927(1992)；Latron等，科學257964(1992)。這些文章都指出了要求即與MHC/HLA分子結合的肽需要是九個氨基酸長(一個“九肽”)，和該九肽的第一個和第九個殘基的重要性。
至今對MAGE家族的基因的研究表明，一個特定的九肽確實在腫瘤細胞表面被提呈，并且該九肽的提呈要求提呈的分子是HLA-Al。MAGE-1腫瘤排斥抗原(“TRA”，或九肽)的復合物導致胞溶性T細胞(“CTLs”)溶解提呈該分子的細胞。這一發現如本文所討論具有診斷學和治療學意義。
在例如1992年8月31日申請的U.S.專利申請07/938,334，即現在的美國專利5,405,940,也即本申請的母申請中的研究表明當把各種MAGE基因的同源區和編碼相關的九肽的MAGE-1基因的區域比較時，它們存在很高的同源性。的確，這些發現產生了本發明公開和要求保護的一個方面即一個九肽家族，該族全部具有同樣的N-末端和C-末端氨基酸。據述這些九肽有各種用途包括單獨或與載體肽偶聯用作免疫原。九肽的大小足以構成一個抗原表位，并且據述由其產生的抗體可用于鑒定九肽，不管它是單獨存在還是作為一個更大多肽的部分。
據述九肽可用于鑒定腫瘤細胞如黑素瘤表面的各種HLA亞型。由于這一能力，它們可作為診斷標記和治療藥劑。這些特征將在下面討論。
在本文中也描述了編碼九肽的核酸分子，據述這些核酸序列也可用作探測腫瘤存在的診斷探針。
本申請還顯示怎樣發現一個可以利用的細胞模型，該模型中可以用編碼人HLA分子的核酸序列轉染非人細胞，得到的轉染體可用來測試特定HLA分子的九肽特異性，或者作為用MAGE基因第二次轉染的主體。可以用共轉染體確定是否由特定的HLA分子提呈了基于特定MAGE的TRA。
本發明涉及一個以前沒有認為是有用的結合基序或共有序列，它包括與HLA分子結合的九肽，從而引起特異于九肽和HLA分子的復合物的CTLs導致的溶解，該基序或共有序列描述如下(Xaa)2Asp(Xaa)5Tyr(SEQ ID NO23)其中Xaa是任何氨基酸，條件是該基序不包括SEQ ID NO12。
附圖的簡要說明

圖1描述了鑒定MAGE-1基因的300個堿基對片段編碼相關的腫瘤排斥抗原的程序。
圖2表示了溶解研究，其中用各種MAGE1肽溫育細胞。
圖3比較了在存在MAGE-1九肽時用HLA-A1基因轉染時和用編碼MAGE-1的序列共轉染時小鼠細胞的溶解。
圖4比較來自MAGE基因的各種同源區的九肽和編碼這些九肽的核酸序列。
圖5顯示利用各種細胞系的CTL克隆20/38進行的鉻釋放試驗的結果。
圖6示出了確定CTL克隆20/38的抗原特異性的試驗的結果。
圖7示出了對各種轉染細胞進行TNF釋放試驗得到的結果。
圖8闡明了使用起源于MAGE-3腫瘤排斥抗原前體的肽的溶解試驗結果。
圖9A和9B描述了使用以本發明的基序作為例子的肽進行的溶解試驗的結果。優選實施方案的詳細描述實施例1已知van der Bruggen等，科學2541643(1991)(該出版物作為參考文獻)描述的2.4kb BamIII片段只含有編碼MAGE-1蛋白質的基因的外顯子2和3。該片段把抗原MZ2-E的表達轉移到丟失E-抗原的細胞系突變體MZ2-MEL.2.2，導致E+CTLs溶解轉染體。DePlaen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274(1988)和Chomez等，免疫遺傳學35241(1990)描述的過去的工作已經確定含有抗原肽編碼序列的小基因片段有規律地表達這些抗原，甚至當不以表達載體的形式轉染時。鑒于這些發現，對2.4kb片段的更小片段進行了實驗。用各種限制酶切割2.4kb片段成更小片段。將得到的更小片段克隆進入質粒載體pTZ18R。利用寡核苷酸VDB 145’-CAGGGAGCCAGTCACAAAG-3’(SEQ ID NO10)和CHO 95’-ACTCAGCTCCTCCCAGATTT-3’(SEQ ID NO11)通過聚合酶鏈反應(“PCR”)擴增得到來自外顯子3的一個300堿基對的片段。這些引物擴增了MAGE-1的外顯子1的422和722位置之間的300堿基對片段，將該片段克隆進入表達載體pSVK3。將該新構建體與質粒pSVtkneoβ共轉染進入MZ2.MEL2.2細胞系，這是用磷酸鈣沉淀方法(Traversari等，免疫遺傳學35145(1992)；Wolfel等，免疫遺傳學26178(1987)，用4×106細胞和3ug pSVtneoβ(Nicolas等，CSH Conf.Cell Prolif10469(1983))和30ug pTZ18R或pSVK3構建體完成的。然后在含有新霉素類似物G418的培養基中篩選轉染體，轉染15天后，測試抗性細胞受抗E抗原CTL82/30刺激產生TNF的能力。這是通過在4×104個轉染細胞中加入100ul含有1500個CTL 82/30的樣品完成的。收獲上清液樣品(50ul)并加至3×104WEHI 164克隆13細胞(Espevik等，免疫學方法9599(1986))確定TNF的存在。利用一個如Traversari等，如上所述的MTT比色測定在24小時后估計WEHI細胞的死亡率。
如圖1所示，這些實驗鑒定了一個能夠有效轉移抗原MZ2-E的表達的來自MAGE-1外顯子3的300堿基對片段。實施例2MAGE-1基因屬于幾個高度相關基因組成的一個家族，參見van der Bruggen等，如上所述。先前的實驗已經證實MAGE-2和MAGE-3不指導抗原MZ2-E的表達。而300堿基對片段顯然是可以指導表達，因此將MAGE-2和MAGE-3基因的同源部分與該300堿基對片段相比差異是明顯的，根據Atherton等，J.Chem.Soc.1538(1981)利用F-moc短暫保護N-末端，合成幾個15個氨基酸的肽。用C-18反相HPLC純化這些肽，并通過氨基酸分析鑒定。
一旦這些肽得到鑒定，就利用Boon等，實驗醫學雜志1521184(1980)的鉻釋放方法，在溶解試驗中測試它們。簡要地說，在37℃用各種濃度的肽在96孔微滴板中溫育1000個51Cr標記的E-靶細胞30分鐘。
加入等體積的含有CTL的樣品(細胞系82/30)，CTLs的數目將是它們的靶的五倍，4小時后測定鉻的釋放。利用一個對應于MAGE-1的大開放閱讀框架的密碼子158-172的肽觀察到E-細胞對抗E CTLs引起的溶解敏感。制備了更短的肽并且利用肽Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr(SEQ ID NO12)觀察到有效的溶解。
如圖2所示，結果證明第一個和第九個氨基酸對于結合和實現溶解是關鍵，與過過去的報道陳述，MHC-I分子一般與九肽結合(Rotzschke等，自然學348252(1990))相符合。圖2還顯示在肽濃度為5nM時得到半最大溶解。實施例3進行確定何種分子提呈相關的MAGE-1抗原的實驗。為了完成這一實驗，將Girdlestone，核酸研究186701(1990)描述的一個HLA-A1基因轉染進入小鼠細胞系P1.HTR.，該細胞系是小鼠肥大細胞瘤細胞系P815的一個高度可轉染的突變體。在存在上面討論的九肽時利用同樣的溶解試驗溫育得到的稱為“P1.HTR.A1”的轉染體。同時做對照試驗。
圖3表明細胞系被溶解了，顯示利用非人細胞已經開發了一個篩選溶解肽的模型。
在本文沒有描述的實驗中，用COS細胞得到了同樣的結果。
也進行了其他實驗，其中用MAGE-1 cDNA轉染了細胞系P1.HTR。當利用這一共轉染細胞進行實施例2的溶解試驗時，發現它們也溶解了。實施例4假設MAGE家族內的各種基因有同源性，就可以進行一個比較試驗以鑒定基因的同源區之間的相似性。這些區域如圖4所示。這些肽和編碼它們的核酸序列是不同的，但顯示了很大的同源性，特別是第一和第九個殘基相同。實施例5這一實施例和下面的實施例6-8是對應于1993年3月26日遞交的在審申請08/037,230的實施例37-40。
從黑素瘤病人MZ2的外周血淋巴細胞中得到胞溶性CTL克隆“20/38”。Van denEynde等，國際癌癥雜志44634-640(1989)描述了這一克隆，該出版物引入作為參考文獻。按照Herin等人，國際癌癥雜志39390-396(1987))分離CTL克隆，該出版物引入作為參考文獻。但是，本文在此描述該試驗，在體外使自身黑素瘤細胞生長，然后在補加10％HEPES和30％FCS的DMEM中以107細胞/ml重懸浮，并用200μCi/ml的Na(51Cr)O4在37℃溫育45分鐘，用補加10mM HEPES的DMEM洗滌標記細胞三次，然后將這些細胞重懸于用補加10mM HEPES和10％的FCS的DMEM，在這之后，把100μl含有103細胞的等分試樣分配到96孔微滴板。加入在100μl同樣的培養基中的CTL克隆的樣品，檢測雙份重復進行。以100g離心平板4分鐘，并在5.5％CO2氣氛中37℃溫育4小時。
再一次離心平板，收集100ul上清液等分試樣并且計數。根據下式計算51Cr釋放的百分數％51Cr釋放＝(ER-SR)×100(MR-SR)其中ER是觀察到的實驗51Cr釋放值，SR是通過在200ul培養基中單獨溫育103標記細胞測量得到的自發釋放值，MR是通過在靶細胞中加100ul 0.3％Triton X-100得到的最大釋放值。
通過有限稀釋擴大和克隆那些顯示高CTL活性的單核血樣品，并利用同樣的方法再次篩選。
用同樣的方法測試靶K562細胞。當使用EBV-B細胞時，唯一的變化是用補充了5％FCS的Hank’s培養基代替DMEM培養基。
這些實驗使CTL克隆20/38得以分離。
圖5表示了這些試驗的結果。具體地說，可以看到CTL克隆溶解自身黑素瘤細胞系MZ2-MEL.3.0，但不溶解EBV-B細胞系，成纖維細胞，K562或非自身黑素瘤細胞系SK-MEL-29。實施例6一旦識別出CTL克隆是特異于自身細胞系的，就可以測試它的抗原特異性。為此，在如上所述的同類型鉻釋放試驗中測試了來自病人MZ2的抗原丟失變異體。這些靶細胞系是MZ2-MEL 3.0，它是D+，E+，F+，A+，MZ2-MEL.61，它是D-，MZ2-MEL 2.2，它是E-，和MZ2-MEL.4，它是F-。除了CTL克隆20/38，還測試了已知為抗-A(CTL 28/336)，抗-F(CTL76/6)，和抗-E(CTL22/13)的克隆。
圖6顯示了這些結果，可以看到CTL克隆20/38溶解了除D-細胞系MZ2-MEL.61以外的所有細胞系，導致鉻釋放，從而表明該CTL克隆是抗-D的。在未包括在本文的試驗中證實了該結果，所述試驗僅在存在提呈抗原D的黑素瘤系時觀察到CTL克隆導致的TNF釋放。實施例7一旦鑒定了抗原D為靶分子，就可進行研究以便確定提呈它的HLA類型。實施例A描述的實驗表明MZ2-MEL提呈抗原D，這一細胞系的HLA特異性是已知的(即，A1，A29，B37，B44，Cw6，C.c1.10)。但是，同樣已知的是，失去了HLA分子A29，B44和C.c1.10的MZ2-MEL的一個突變體仍然表達抗原D，所以可以不考慮這些。由于由于沒有發現，所以沒有對表達B37的細胞系進行研究。
總共測試了13個同種系，它們表達HLA-A1(13個中的10個)或Cw6(13個中的3個)。利用Traversari等，免疫遺傳學35145-152(1992)(該出版物引入作為參考文獻)的方法，測試細胞系被CTL克隆20/38刺激釋放TNF的能力。通過測試上清液對WEHI 164-13細胞的毒性，這一試驗測定了TNF釋放值。
試驗中，在存在1500個CTL克隆細胞和25U/ml IL-2時培養來自同種系的細胞樣品(3000，10,000或30,000個細胞)。24小時后，再一次測試培養物上清液對WEHI的毒性。結果如下面表1所示。
發現8個細胞系刺激從CTL克隆20/38釋放TNF。所有這些細胞系均是HLA-A1。沒有一個表達Cw6的細胞系是這樣的。
同時還測試細胞系以確定MAGE表達。刺激TNF釋放的所有8個細胞系中均表達MAGE-3，而兩個陰性的HLA-A1細胞系則不表達。表1Mage-3 HLA-A1黑素瘤TNF pt/ml的表達 的表達細胞數實驗1實驗2-+CIL -+CIL20/38 20/38MZ2-MEL-61.2 50000 1 4 +++ +MZ2-MEL-ET1500000＞120 ＞12+++ +1666 66＞120LY-1-MEL 300001＞1201＞120 +++ +100001＞1201＞1203000 ＜1 114 2＞120MI-10221 30000＜1 ＞120 +++ +10000＜1 713000 ＜1 74LY-2-MEL 30000157+++ +100001863000 191LY-4-MEL 300001＞120 +++ +100001＞1203000 1＞120SK23-MEL 300001112 ++++ +1000011163000 1105MI-665/2-MEL 300001324 -+1000012253000 15.2 15LB34-MEL 300001＞120 +++ +100001＞1203000 1＞120LB45-MEL 30000111 130 -+10000161123000 12＜1 7NA-6-MEL 30000177 598 +++ +100001104 5＞1203000 1110 4＞120MI-13443-MEL 300001＞120 +++ +100001＞1203000 1＞120LB5-MEL 300001849 +-10000＜1 54113000 ＜1 515SK64-MEL 300001425 7-1000012153000 1114LB33-MEL 30000 13.5 +++ -10000 143000 13LB73-MEL 50000 16--把1500個CTL20/38和25u/ml IL2與所示數目的不同的同種黑素瘤細胞混合。24小時后通過測試對WEHI-164-13細胞的毒性測定上清液中存在的TNF的量。實施例8鑒于實施例7中列出的結果，進行了實驗以便確定是否抗原D確實是起源于MAGE-3的腫瘤排斥抗原。為此，用100ng克隆進pcDNA I/Amp的HLA-A1基因，和100ng(a)克隆進pcDNA I/Amp的MAGE-1的cDNA，(b)克隆進pcDSRo的MAGE-2的cDNA，(c)克隆進pcDSRα的MAGE-3的cDNA中之一轉染受體COS-7細胞。根據制造商的說明把轉染序列連接到質粒。在用10％胎牛血清補充的Dulbeco改進的Eagles培養基(“DMEM”)中，以15,000細胞/孔的量把COS-7細胞的樣品分布到組織培養平底微孔中。37℃溫育細胞過夜，除去培養基，然后用30ul/孔含有10％Nu血清，400ug/ml DEAE-葡聚糖，100uM氯奎，和如上所述的質粒的DMEM培養基代替。在37℃溫育4小時后，除去培養基，用含有10％DMSO的50ulPBS代替。2分鐘后再除去培養基，用200ul補充了10％FCS的DMEM代替。
在如此變換培養基后，37℃溫育COS細胞24小時。然后潷棄培養基，加入在100μl含有10％庫存血清并補加25u/ml IL-2的Iscove培養基中的1500個CTL克隆細胞。24小時后取上清液，如Traversari等，免疫遺傳學35145-152(1992)(該出版物引入作為參考文獻)所述，對WEHI細胞進行測試以確定TNF含量。結果如圖7所示。可以看到用HLA-A1和MAGE-3轉染的COS7細胞強烈刺激CTL克隆，而用其他mage基因轉染的細胞沒有。得出的結論是抗原D是起源于基因MAGE-3編碼的腫瘤排斥抗原前體的一個腫瘤排斥抗原，該TRA由HLA-A1分子提呈。實施例9進一步利用起源于基因“MAGE-3”的肽Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr(SEQ ID NO17)進行實驗。
用與實施例2的肽相同的方法制備該肽。也利用該實施例所述的Cr釋放檢測方法。用51Cr標記細胞系MZ2-MEL61.2，它是MZ2.MEL43的丟失抗原D的變異體，然后用抗原D特異性胞溶性細胞克隆CTL20/38進行測試，并改變肽的濃度。MZ2-MEL61.2和CTL20/38以1.5∶1的比例合并，并與變化濃度的肽合并。溫育混合物4小時，然后測定鉻釋放值。鉻標記的MZ2-MEL.43被用作對照。
圖8所示的結果顯示由于胞溶性T細胞克隆識別和溶解靶細胞，所以該肽確實是一個腫瘤排斥抗原。實施例10這一實施例證明九聚體的第一個氨基酸對于肽與HLA-A1分子的結合和CTL的識別和溶解都不是關鍵。這一實驗中的關鍵肽是Ala Ala Asp Pro Thr Gly His SerTyr(SEQ ID NO14)，它與SEQ ID NO12的肽區別僅在于位置1(“N末端”氨基酸〕是Ala而不是Glu。
細胞系BM21是已知的，并且是HLA-A1陽性。通過在37℃用51Cr溫育106細胞1小時以鉻標記細胞系樣品。在存在使HLA分子穩定的抗-HLA I類單克隆抗體W6/32時進行溫育，以便有利于隨后的試驗。然后，建立一個競爭結合實驗，其中變化濃度的競爭肽(0.03-100μM)和細胞以1000個細胞/孔混合。15分鐘后，以濃度為0.25μM加入SEQ ID NO17肽(即Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr)。在加入15分鐘后，以淋巴細胞對靶的比例為10∶1加入已知為識別和溶解SEQ ID NO17和HLA-A1分子的復合物的CTL克隆20/38細胞并在37℃溫育。4小時后，利用本文描述的51Cr方法測定溶解。結果如圖9A和9B所示。
在圖9A中，測試了根據MAGE-1的推導氨基酸序列而來的肽，而在圖9B中，使用了來自各種MAGE肽的同源肽。特別是圖9A顯示第一個位置沒有Glu的肽有效地與已知和HLA分子結合的肽競爭。具體地說，所測試的是一系列“Ala”被取代的肽防止起源于MAGE-3的肽MZ-2D與HLA-A1分子結合的能力。這是通過觀察由特異于HLA-A1和MZ-2D的復合物的CTLs引起的溶解的下降測試的。值得注意的是，在圖中存在由溶解下降指示的競爭。
已知特定CTL細胞只識別和溶解肽和HLA的特異的復合物。特異于MZ-2D和HLA-A1的CTLs不溶解競爭肽和HLA-A1的復合物這一事實不意味著這些復合物不激發溶解，而是預期這些復合物足以引起附加的特異于HLA分子和競爭九肽的復合物的CTLs的增殖。
前面的實施例顯示通式為(Xaa)2Asp(Xaa)5Tyr(SEQ ID NO123)的九肽由HLA分子提呈，據此，提呈HLA和九肽復合物的細胞可以被應答這些復合物產生的特異CTL細胞溶解。這一發現表明本發明的九肽可以用于治療和診斷。
在后一應用中，九肽本身可以例如用來鑒定表達特定HLA分子的腫瘤或癌細胞。將含有癌細胞的樣品或腫瘤細胞與與之結合的九肽接觸并與特異于該復合物的CTL樣品合并。如果確定發生溶解，可以鑒定腫瘤/癌細胞為特定的HLA提呈者。更詳細的分析可以表明癌細胞是例如HLA-A1提呈者，或如其他HLA-A型的其他HLA型提呈者。
治療學上有兩個主要的使用九肽的途徑，在體內治療途徑中，可以將九肽導向所治療的腫瘤的方式應用，這可以通過直接注射，時間釋放給藥，與腫瘤特異抗體偶聯，等等來完成。與HLA-A分子結合后發生CTL應答，導致腫瘤溶解。當然，在這一治療途徑中九肽是以足以導致腫瘤溶解的量給藥的。該量根據不同的病人，腫瘤的類型和大小等等而不同。
本發明的另一個方面是利用單獨的或組合物形式的這些肽引發或刺激一個由靜止的或者說不活化的CTL引起的應答。在組合物形式中，這些肽與任何已知的用于刺激免疫應答的佐劑結合。給藥后，靜止的或者不活化的CTLs增殖并且靶擊在其表面提呈肽和HLA分子的復合物的腫瘤細胞。
還涉及體外形式的治療。如上面指出，當HLA-A分子與該九肽結合時，假如與特異于肽/HLA復合物的CTLs接觸，則出現CTL增殖應答。由于CTLs是體內溶解腫瘤的因子，得到的擴增群可以給病人給藥。通過利用病人自身的血液或任何其他來源的CTLs或通過與先確定的肽特異性CTLs的樣品接觸可以擴增CTLs。在這點上，值得注意的是，上面討論的CTL20/38及其開發方法已可得到。
本文描述的治療類型對黑素瘤特別有用。例如，對樣品的分析表明約26％的白種人普遍存在HLA-A1等位基因，所以，至少可以認為26％的白種黑素瘤人群是用該肽治療的潛在主體。也可以用表面提呈HLA-A1和九肽的復合物的增殖性細胞治療這些病人。
正如所指，核酸序列可以用于各種用途。MAGE基因在腫瘤中表達，所以可以用作鑒定腫瘤細胞的探針。這可以通過標記雜交探針，PCR或本領域技術人員已知的基于各種核酸探針的任何檢測方法完成。
本文描述的非人細胞系的開發給出一個實現本文描述的本發明的一些特征的唯一方法。實施例表明，例如，CTLs識別HLA和九肽復合物，但似乎不顯示在提呈該復合物的細胞類型之間分化。所以，本發明的分離的非人細胞系可以用于產生CTLs并鑒定它們在人樣品中的存在。
正如所指，本發明還包括用HLA-A1基因和編碼九肽的序列轉染的分離的非人細胞系。這不限于利用一個HLA編碼基因和一個MAGE肽(編碼區)的轉染，確實，本發明涉及多重轉染細胞，它們可含有一個以上的HLA基因，一個以上的MAGE抗原編碼序列。假設具有公開的基序的九肽都由共同的HLA分子提呈的發現支持這一論點。由于在細胞表面存在適當的HLA和肽將導致所選擇的特異CTLs的鑒定或在治療過程中產生CTL增殖，所以可以認為這些細胞是通用的效應細胞。這些共轉染或多重轉染的細胞，當與合適的佐劑(如那些技術人員已知的)結合時可以用作疫苗。利用這些轉染體可以進行各種癌癥癥狀如黑素瘤和乳癌的治療。
已經用到的術語和表達方式被用作描述的術語并不是限制性的，無意用所述術語和表達方式排除所表達和描述的特征的等同體或其各部分，應該認識到的是各種修飾是在本發明的可能范圍之內的。
序列表(1)一般信息(i)申請人蒂爾瑞·博恩-法勒爾；皮埃爾·范德布魯根；艾蒂案·德普萊恩；克里斯托夫·呂爾坎；卡蒂亞·特拉韋爾薩里；貝亞特麗斯·戈格萊；貝努瓦·范登艾恩德；佩德羅·羅梅羅(ii)發明名稱由HLA分子提呈的分離的九肽及其應用(iii)序列的數目29(iv)通訊地址(A)通訊人Felfe&Lynch(B)街道第三大道805號(C)城市紐約市(D)州紐約州(E)國家USA(F)郵編10022(v)計算機可讀形式(A)媒體類型磁盤，5.25英寸，360kb內存(B)計算機IBM PS/2(C)操作系統PC-DOS(D)軟件Wordperfect(vi)目前申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類號(vi)在先申請資料(A)申請號08/073,103(B)申請日1993年6月7日(vi)在先申請資料(A)申請號07/938,334(B)申請日1992年8月31日(vi)在先申請資料(A)申請號08/037,230(B)申請日1993年3月26日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登記號30,946(C)參考/檔案號LUD 5293.3(ix)電信信息(A)電話(212)688-9200(B)電傳(212)838-3884(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞MAGE-1九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ ID NO1GAAGCAGACC CCACCGGCCA CTCCTAT 27(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞MAGE-2九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ ID NO2GAAGTGGTCC CCATCAGCCA CTTGTAC 27(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞MAGE-21九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ IDNO3GAAGTGGTCC GCATCGGCCA CTTGTAG 27(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞MAGE-3九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ ID NO4GAAGTGGACC CCATCGGCCA CTTGTAC 27(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞MAGE-4九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ ID NO5GAAGTGGACC CCGCCAGCAA CACCTAC 27(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞MAGE-41九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ ID NO6GAAGTGGACC CCACCAGCAA CACCTAC27(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞MAGE-5九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ ID NO7GAAGCGGACC CCACCAGCAA CAACTAC27(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞MAGE-51九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ ID NO8GAAGCGGACC CCACCAGCAA CACCTAC 27(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞MAGE-6九肽編碼序列(xi)序列描述SEQ ID NO9GAAGTGGACC CCATCGGCCA CGTGTAC 27(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10CAGGGAGCCA GTCACAAAG 19(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征
(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11ACTCAGCTCC TCCCAGATTT 20(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO12Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr5(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO13Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser5(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO14Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr5(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO15Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr5(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO16Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr5(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO17Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr5(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO18Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr5(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO19Glu Val Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr5(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ IDNO20Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr5(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO21Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr5(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征
(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO22Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr5(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO23Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr5(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ IDNO24Ala Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr5(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO25Glu Ala Asp Ala Thr Gly His Ser Tyr
5(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO26Glu Ala Asp Pro Ala Gly His Ser Tyr5(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO27Glu Ala Asp Pro Thr Ala His Ser Tyr5(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO28Glu Ala Asp Pro Thr Gly Ala Ser Tyr5(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO29Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ala Tyr權利要求
1.具有下列通式的分離的九肽(Xaa)2Asp(Xaa)5Tyr(SEQ ID NO23)其中所說的九肽與細胞上的HLA分子結合并引起由特異于所說的HLA分子和所說的九肽的復合物的胞毒性T細胞導致的溶解，條件是所說的九肽不是SEQ ID NO12。
2.根據權利要求1所說的分離的九肽，其中第一個氨基酸是Glu或Ala。
3.根據權利要求1所說的分離的九肽，其中第二個氨基酸是Ala或Val。
4.根據權利要求1所說的分離的九肽，其中第四個氨基酸是Pro，Ala或Arg。
5.根據權利要求1所說的分離的九肽，其中第五個氨基酸是Thr，Ile或Ala。
6.根據權利要求1所說的分離的九肽，其中第六個氨基酸是Gly，Ala或Ser。
7.根據權利要求1所說的分離的九肽，其中第七個氨基酸是His，Ala或Asn。
8.根據權利要求1所說的分離的九肽，其中第八個氨基酸是Ser，Leu，Thr，Ala或Val。
9.根據權利要求1所說的分離的九肽，選自Ala Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr(SEQ ID NO24)，Glu Ala Asp Ala Thr Gly His Ser Tyr(SEQ ID NO25)，Glu Ala Asp Pro Ala Gly His Ser Tyr(SEQ ID NO26)，Glu Ala Asp Pro Thr Ala His Ser Tyr(SEQ ID NO27)，Glu Ala Asp Pro Thr Gly Ala Ser Tyr(SEQ ID NO28)，和Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ala Tyr(SEQ ID NO29)組成的組。
10.根據權利要求1所說的分離的九肽，由下列氨基酸序列組成Ala Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr(SEQ ID NO24)。
全文摘要
本發明涉及由如HLA－Al的HLA分子提呈的九肽,胞溶性T細胞可識別得到的復合物,這樣的識別可用于診斷或治療中。
文檔編號A61P37/00GK1175954SQ96192076
公開日1998年3月11日 申請日期1996年2月1日 優先權日1995年2月23日
發明者蒂爾瑞·博恩-法勒爾, 皮埃爾·范德布魯根, 艾蒂安·德普萊恩, 克里斯托夫·呂爾坎, 貝亞特麗新·戈格萊, 貝努瓦·范登艾恩德, 卡蒂亞·特拉韋爾薩里, 佩德羅·羅梅羅 申請人:路德維格癌癥研究所