專利名稱：發酵生產頭孢菌素的新方法
技術領域：
本發明涉及一種制備頭孢菌素類和頭孢菌素衍生物的方法。更具體地說，本發明涉及從頭孢菌素類和其它β-內酰胺化合物的復雜混合物回收頭孢菌素類及其衍生物。本發明還涉及從β-內酰胺化合物和側鏈(例如可通過酶促側鏈除去而獲得的那些)的混合物回收脫酰頭孢菌素類。
制備頭孢菌素類的半合成途徑大多始于發酵產物(例如青霉素G、青霉素V和頭孢菌素C)，例如按下列文獻中公開的方法將它們轉化成相應的β-內酰胺環K.Matsumoto，生物加工技術(Bioprocess.Techn.)，16，(1993)，67-88，J.G.Shewale＆H.Sivaraman，生物化學進展(Process Biochemistry)，1989年8月，146-154，T.A.Savidge，工業抗生素的生物技術(Biotechnology ofIndustrial Antibiotics)(編輯E.J.Vandamme)Marcel Dekker，NewYork，1984，或J.G.Shewale等，國際生物化學進展(ProcessBiochemistry International)，1990年6月，97-103。接著通過偶合到合適的側鏈上而將獲得的β-內酰胺環轉化成所需的抗生素，正如尤其在EP 0 339 751、JP-A-53005185和CH-A-640 240中描述的那樣。通過將側鏈和β-內酰胺環進行不同的組合，可獲得各種青霉素和頭孢菌素抗生素。
已知，7-氨基去乙酸基頭孢霉烷酸(7-amino desacetoxycephalosporanic acid)(7-ADCA)和7-氨基頭孢噻嗪酸(7-aminocephalosporonic acid)(7-ACA)是生產制藥工業中應用的抗生素的最重要中間體。
7-ADCA是例如通過化學法或酶法分裂(脫酰作用)苯乙酰去乙酸基頭孢霉烷酸(生成7-氨基去乙酸基頭孢霉烷酸和苯乙酸)而獲得的。
苯乙酰去乙酸基頭孢霉烷酸一般是通過化學法處理青霉素G亞砜(它是從青霉素G生成的)而生產的。在該生產方法中，需要大量化學試劑以保障所需反應的進行。這既昂貴又對廢物處理構成沉重負擔。此外，該方法的總產率不是很高。
為了克服化學法的某些缺點，已公開了生產7-ADCA、7-氨基去乙酰基頭孢霉烷酸(7-ADAC)和7-ACA的發酵法，該方法涉及通過能從轉基因表達去乙酸基頭孢霉烷酸合成酶(DAOCS，也被稱為“擴展酶”)的重組產黃青霉(Penicillium chrysogenum)菌株發酵生產N-取代β-內酰胺(例如己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ADAC或己二酰-7-ACA)(EP 0532 341、EP 0 540 210、WO 93/08287、WO 95/04148)。擴展酶負責某些N-酰化青霉烷酸的5元環擴展，于是生成相應的N-酰化去乙酸基頭孢霉烷酸。
為了生產出經濟上最重要的未酰化頭孢菌素類(例如7-ADCA、7-ADAC和7-ACA)，用合適的酰基轉移酶酶促除去酰基。
回收化學法或酶法生產的青霉烷酸和頭孢霉烷酸的已知方法對N-取代β-內酰胺中間體和脫酰氨基-β-內酰胺的回收來說不是有效的。回收發酵法生產的上述頭孢菌素化合物的主要問題是發酵液或培養物濾液的復雜性。發酵液通常包含各種青霉烷酸[例如α-氨基己二酰-6-青霉烷酸、α-羥基己二酰-6-青霉烷酸、6-氨基青霉烷酸(6-APA)]，各種頭孢霉烷酸(包括α-氨基己二酰-和羥基己二酰-7-ADCA)和大量蛋白質類物質。已知的回收方法不能給出純度上可接受品級的頭孢霉烷酸產品。在脫酰作用中，這導致如下問題酶半壽期的縮短、生物轉化率的降低和生物轉化后的回收費用更高和/或不可接受的污染物含量。此外，脫酰后，這類雜質妨礙或至少阻礙所要求技術規格的所需脫酰頭孢菌素化合物的回收。
本發明提供了一種從除通式(Ⅰ)化合物外還含有6-氨基青霉烷酸(6-APA)和任選一種或多種N-取代β-內酰胺化合物的復雜混合物中回收通式(Ⅰ)的頭孢霉烷酸化合物的方法 其中，●R0是氫或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是選自下組的任一個基-氫，-羥基，-鹵素，-飽和的或不飽和的、直鏈的或支化的烷基(1～5個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基、鹵素、芳基、烷氧基(1～3個碳原子)或酰基取代；-烷氧基(1～3個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基或鹵素取代；或者-任選被羥基、鹵素、氨基取代的環烷基(3～8個碳原子)；-芳基；-雜芳基；以及●R2選自己二酰(1，4-二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、己二酰、庚二酰(pimelyl)、辛二酰(suberyl)、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、高級烷基飽和的和高級烷基不飽和的二羧酸，該方法包括如下步驟(a)酸化所述復雜混合物至低于6.5的pH并將低于所述pH的混合物保持在10℃和150℃之間的溫度；和/或(b)將所述復雜混合物與二氧化碳源接觸；以及(c)從步驟(a)和/或(b)之后獲得的混合物回收式(Ⅰ)的頭孢霉烷酸化合物。優選地，在步驟(a)中將溫度保持在約50℃和約130℃之間(優選在70和120℃之間)達10秒～約1周，而pH則被保持在pH4.5或低于pH4.5。按一種優選的方法，已通過有能力的微生物的發酵生產了式(Ⅰ)的化合物，所述復雜混合物是發酵液、培養物濾液或可得自發酵后發酵液的任何培養液。
通式(Ⅰ)的優選化合物選自己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ADAC和己二酰-7-ACA。
按本發明的另一方面，這樣進行步驟(c)將步驟(a)和/或(b)之后獲得的混合物進行色譜法(優選為吸附色譜法、更優選為疏水相互作用色譜法)處理。
按本發明的又一方面，提供了色譜法在回收式(Ⅰ)的頭孢菌素化合物過程中的應用，優選通過吸附色譜法、更優選為疏水相互作用色譜法，進一步優選應用模擬移動床技術(Simulated Moving Bedtechnology)。
按本發明的又一方面，提供了一種制備式(Ⅱ)的化合物的方法 其中，●R0是氫或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是選自下組的任一個基-氫，-羥基，
-鹵素，-飽和的或不飽和的、直鏈的或支化的烷基(1～5個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基、鹵素、芳基、烷氧基(1～3個碳原子)或酰基取代；-烷氧基(1～3個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基或鹵素取代；或者-任選被羥基、鹵素、氨基取代的環烷基(3～8個碳原子)；-芳基；-雜芳基；該方法包括如下步驟制備式(Ⅰ)的化合物(其中，R0、Y和R1如上述定義，并且R2選自己二酰(1，4-二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、己二酰、庚二酰、辛二酰、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、高級烷基飽和的和高級烷基不飽和的二羧酸)；使式(Ⅰ)的化合物脫酰而獲得包含式(Ⅱ)化合物的轉化液。該轉化液優選還包含分裂的側鏈(表示為R2)。
按一個優選的實施方案，所述方法還包括通過結晶從溶液回收式(Ⅱ)化合物這一步驟，優選在此之前和/或之后(在加溶粗晶體即通過結晶之后)用選定的作用劑(例如活性炭或吸附樹脂)處理溶液。按本發明的另一方面，在結晶和/或重結晶期間或之前添加一種溶劑，例如甲醇、乙醇、(異)丙醇、異丁醇、正丁醇或丙酮或者上述試劑任意的組合物。優選的吸附樹脂選自XAD16(CAS No.102419-63-8)、XAD1600(CAS No.153796-66-8)和HP20(CAS No.55353-13-4)。按本發明優選的是這一方法其中，6-氨基青霉烷酸(6-APA)含量相對于式(Ⅱ)化合物為10ppm或更少。按另一方面，提供了一種方法，其中，在脫酰作用后，處理溶液而至少部分地除去以R2表示的分裂的側鏈。可在式(Ⅱ)化合物的結晶和加溶(即重結晶)之后進行該步驟或重復該步驟。還可對結晶或重結晶之后獲得的母液進行分裂的側鏈的除去。
所以，提供了一種方法，其中，在所述處理而至少部分地除去分裂的側鏈之后，接著加溶粗晶體和重結晶式(Ⅱ)的化合物。
優選地，所述處理而除去分裂的側鏈包括在低于5、優選低于4、更優選接近或低于3的pH下，將所述轉化液或母液或者這二者進行膜式過濾。因此，提供了膜式過濾在從包含二羧酸和β-內酰胺抗生素的混合物除去二羧酸方面的應用。所述混合物優選是結晶式(Ⅱ)的化合物之后獲得的母液或是式(Ⅰ)的化合物脫酰后獲得的混合物。膜式過濾優選在約為5或更小的pH下、優選在pH 4或更小下進行，更優選在pH3或更低時通過超微過濾(nanofiltration)進行。按本發明的另一方面，提供了一種方法，其中，通過結晶和/或重結晶從轉化混合物至少部分地除去了側鏈R2。按本發明的又一方面，提供了一種方法，其中，側鏈R2是這樣從轉化混合物至少部分地被除去的將混合物酸化至低于3的pH，接著將該混合物與有機溶劑(例如乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、環己酮、異丁醇或正丁醇)接觸。
本發明涉及一種從除通式(Ⅰ)化合物外還含有6-氨基青霉烷酸(6-APA)和任選一種或多種N-取代青霉烷酸化合物的復雜混合物中回收通式(Ⅰ)的頭孢霉烷酸化合物的方法 其中，●R0是氫或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是選自下組的任一個基-氫，
-羥基，-鹵素，-飽和的或不飽和的、直鏈的或支化的烷基(1～5個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基、鹵素、芳基、烷氧基(1～3個碳原子)或酰基取代；-烷氧基(1～3個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基或鹵素取代；或者-任選被羥基、鹵素、氨基取代的環烷基(3～8個碳原子)；-芳基；-雜芳基；以及●R2選自己二酰(1，4-二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、己二酰、庚二酰、辛二酰、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、高級烷基飽和的和高級烷基不飽和的二羧酸，該方法包括如下步驟(a)酸化所述復雜混合物至低于6.5的pH并將低于所述pH的混合物保持在10℃和150℃之間的溫度；和/或(b)將所述復雜混合物與二氧化碳源接觸；以及(c)從步驟(a)和/或(b)之后獲得的混合物回收式(Ⅰ)的頭孢霉烷酸化合物。本發明進一步涉及一種制備具有通式(Ⅱ)的頭孢菌素的方法 其中，●R0是氫或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是選自下組的任一個基-氫，-羥基，-鹵素，-飽和的或不飽和的、直鏈的或支化的烷基(1～5個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基、鹵素、芳基、烷氧基(1～3個碳原子)或酰基取代；-烷氧基(1～3個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基或鹵素取代；或者-任選被羥基、鹵素、氨基取代的環烷基(3～8個碳原子)；-芳基；-雜芳基。
式(Ⅰ)的化合物可通過能生成本文定義的復雜混合物的任何系列步驟生產，從該復雜混合物實現式(Ⅰ)化合物的回收。對于說明書和權利要求書來說，“復雜混合物”定義為包含N-取代頭孢菌素化合物和取代的或未取代的β-內酰胺化合物的混合物。
式(Ⅱ)的化合物是通過如下系列步驟獲得的(a)回收、優選純化式(Ⅰ)的化合物；(b)將優選純化的式(Ⅰ)化合物脫酰而獲得包含式(Ⅱ)化合物的溶液(轉化液)；以及(c)回收、優選純化式(Ⅱ)的化合物。
發酵法生產N-取代頭孢霉烷酸的障礙之一是存在不希望有的污染性β-內酰胺組分(例如N-取代6-氨基青霉烷酸)。按本發明的一個實施方案，已發現這些污染物可這樣被顯著減少在酸化條件下(優選伴隨高溫)，將發酵液、發酵液的濾液或通過應用任何生物量分離技術從發酵液獲得的液體保溫。應用至少一種已知的酸(例如硫酸、鹽酸或硝酸或其組合物)將發酵液酸化到低于6.5的pH(優選低于4.5)。操作溫度在20～150℃的范圍內，優選在70～120℃。在這些條件下的保留時間在數秒(150℃下)或數天(20℃下)的范圍內，優選為10秒～60分鐘。優選進行一段時間的pH/溫度處理而提供N-取代6-APA相對于式(Ⅱ)化合物的降低倍數為100、優選為1000、更優選為1，000，000。可在生物量分離之前或之后進行該步驟，而且可分批地或連續地進行。
按本發明的另一實施方案，污染性青霉素組分(例如N-取代6-APA)是通過將發酵液、發酵液的濾液、洗脫液、轉化液或溶解的式(Ⅰ)的污染性頭孢菌素(通常在pH5～7時)與二氧化碳接觸而顯著地減少的。二氧化碳可被以任意合適的形式(例如固體或氣體形式或作為碳酸根離子的溶液)加到溶液中。將溶液與CO2源在10～60℃(優選20～40℃)的溫度下接觸，其中，所述溶液被分子CO2飽和4～10小時。在減少青霉素組分后，可達到如前述那樣的式1頭孢菌素的純化。
本文定義的復雜混合物可具有任意來源，但優選是在導致生產的條件下、通過能生產通式(Ⅰ)化合物的7-N-酰化形式的微生物發酵后獲得的培養液或培養物濾液，其中所述酰基可以是在頭孢菌素生物合成途徑中支持環擴展酶(去乙酸基頭孢菌素合成酶-DAOCS，或雙官能擴展酶/羥化酶(有時被稱為去乙酰基頭孢菌素合成酶DACS))的任意酰基。體內生產式(Ⅰ)的7-N-酰基取代的化合物的生物過程被公開于WO 93/05158(己二酰-7-ADCA)；WO 93/08287(己二酰-7-ADAC和己二酰-7-ACA)，WO 95/04148(2-(羧基乙硫基)乙酰-7-ADCA)，WO95/04149(3-(羧基乙硫基)丙酰-7-ADCA)和高級烷基飽和的或不飽和的二羧酸。這些PCT申請的相關部分被并入本文作參考。優選的酰基一般是二羧酸類，例如己二酰(1，4-二羧基丁烷)、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、粘康酸等。合適的宿主生物包括但不限于產黃青霉和產黃支頂孢(Acremonium chrysogenum)。合適的擴展酶(包括雙官能擴展酶/羥化酶)源包括但不限于帶小棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)和產黃支頂孢。轉化的方法、轉化細胞的選擇和表示絲狀真菌的調節因子(它們可被用于基因修飾宿主細胞)都是β-內酰胺生產(絲狀)真菌的重組DNA技術領域中熟知的。
優選地，在酸化和任選升高溫度之前，首先將發酵液進行生物量分離，例如通過任意合適的方法過濾，例如膜式過濾、真空過濾、超濾或其組合。生物量分離的任何其它方法也是合適的。
在pH-降低步驟和任選的溫度步驟之后，回收的式(Ⅰ)化合物優選經歷進一步純化從而至少部分地除去不希望有的β-內酰胺組分，尤其是不希望有的N-取代頭孢菌素和青霉素。所述進一步純化可通過應用有機溶劑萃取而進行。就萃取來說，發現了有利的是洗滌萃取液，從有機相將N-取代頭孢菌素反萃取到水相，再反萃取水相。萃取有機溶劑可選自乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、環己酮、異丁醇或正丁醇等。在本方法中，優選的純化步驟是應用色譜法純化N-取代頭孢菌素而不是應用有機溶劑萃取。色譜法的優點是不存在溶劑(溶劑引起廢物問題和污染問題)，以及終產物純度的改善。優選的是離子交換色譜法或吸附色譜法，更優選是疏水相互作用色譜法。應用吸附劑將濾液進行色譜處理。吸附劑包括活性炭，例如Norit CG-1或Cecarbon GAC 40；或者吸附樹脂，例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，諸如得自Mitsubishi Kasei Corporation的Dianion HP 20(CASNo.55353-13-4)、Dianion HP 21(CAS No.92529-04-9)、Dianion SP207(CAS No.98225-81-1)或Dianion SP 825或者得自Rohm和Haas的Amberlite XAD 1180(CAS No.97396-56-0)、Amberlite XAD1600(CAS No.153796-66-8)或Amberlite XAD 16(CAS No.102419-63-8)或者得自TosoHaas的Amberchrom CG 161(CAS No.131688-63-6)；優選為XAD 16或XAD 1600。
在吸附N-取代頭孢菌素之前，通過一種或多種已知的酸(例如硫酸、鹽酸或硝酸或其組合物)將所述復雜混合物調節至1.0～5.0(優選2.5～3.5)的pH。操作溫度在0～50℃(優選在5～25℃)的范圍內。操作壓力在0～1.0MPa超壓的范圍內。
不希望有的β-內酰胺組分，尤其不希望有的N-取代頭孢菌素(例如α-氨基己二酰頭孢霉烷酸)也吸附在吸附劑上，但被需要的N-取代頭孢菌素置換。
吸附后，采取用水洗滌以除去吸附劑之間空隙容積中不希望有的β-內酰胺組分，并從吸附劑解吸弱結合的、不希望有的β-內酰胺組分。可通過一種或多種已知的酸(例如硫酸、鹽酸或硝酸或其組合)酸化所述水至1.0的pH。要增大滲透壓，可以往水中添加鹽。操作溫度在0～50℃(優選在20～40℃)的范圍內。操作壓力在0～1.0MPa超壓的范圍內。
可用合適的緩沖劑(例如乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽或己二酸鹽)進行洗脫，但還可應用稀有機溶劑(例如丙酮、異丙醇)或稀堿(例如銨、苛性堿)。操作溫度在0～80℃(優選在10～40℃)的范圍內。操作壓力在0～1.0MPa超壓的范圍內。
可通過任何常用方法進行吸附劑的再生，例如應用稀堿、稀酸，或者應用水混溶性溶劑(例如丙酮、甲醇、乙醇或異丙醇)或其組合。可以實施任選加熱到100℃。
再生液體可通過用水洗滌除去。可通過一種或多種已知的酸(例如硫酸、鹽酸或硝酸或其組合)酸化所述水至1.0的pH。可在數種裝置中進行色譜處理步驟，例如以單一的柱，但還可應用模擬移動床技術。就該模擬移動床技術來說，有數種裝置是可獲得的，例如U.S.Filter的ADSEP系統、Advanced Separation Technology的ISEP/CSEP系統、例如Applexion的‘merry-go-around’系統或Universal Oil Products Company(UOP)的SORBEX系統。
還可通過超微過濾除去洗脫液中的緩沖劑。該膜式過濾中膜的特征表現為對需要的N-取代頭孢菌素的高保留和對緩沖劑的低保留。任選通過任何合適的濃縮方法應用一個濃縮步驟，例如真空蒸發、反滲透、超微過濾或者色譜處理或萃取后的narofiltration。
接著應用本領域已知的任意合適方法將回收的N-酰化化合物脫酰。一個優選的方法是應用合適的二羧化酰基轉移酶進行酶促脫酰作用。有很多合適的酰基轉移酶(野生型或突變型)是本領域已知的，它們包括但不限于得自下列微生物的那些芽孢桿菌屬(Bacillus)(EP 0525 861；EP 0 405 846)，假單胞菌屬(Pseudomonas)(EP 0 482 844；EP 0 525 861；EP 0 475 652；EP 0 663 445)，無色桿菌屬(Achromobacter)(EP 0 525 861)，糞產堿菌(Alcaligenesfaecalis)(EP 0 638 649)，不動桿菌屬(Acinetobacter)(EP 0 469919)，節桿菌屬(Arthrobacter)(EP 0 283 218)，大腸埃希氏菌(Escherichia coli)(US 3，945，888)，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌(Kluyvera citrophila)，雷氏普羅威登斯菌(Proteus rettgeri)(US3，915，798)等。二羧化酰基轉移酶優選得自假單胞菌屬SE83或SY-77。該酰基轉移酶任選可以是突變形式(如WO 91/16435、WO 97/20053、WO 97/40175中公開的那些)從而增大或改變對底物的親和性。使本發明的N-酰化頭孢菌素化合物脫酰的另一方法是通過將底物與能生產酰基轉移酶的微生物接觸(如美國專利No.5，677，141中公開的那樣)。
可應用本領域熟知的技術將酰基轉移酶固定(US 3，930，949)在膜(EP 0 243 404)或自由流動的載體(例如基于戊二醛的載體)或氮雜內酯聚合物(EP 0 730 035)上。非固定化酰基轉移酶也是預期的，應用膜分離反應混合物(滯留物)與產物(滲透液)，例如美國專利No.5，521，068中公開的那樣。該方法可以是分批的或(半)連續的，這是完全熟知的并且對本發明來說不是關鍵的。酶促脫酰反應通常在攪拌釜式反應器(具有或沒有優選為惰性的篩板，從而容易分離固定化酶與反應產物)中進行。在反應過程中通常調節pH以補償由于(二羧基)側鏈被任意類別的堿(例如銨、苛性堿、碳酸鹽、碳酸氫鹽)除去引起的pH變化。可在反應器中和/或在反應器上方的循環回路(circulating loop)中調節pH。還可調節其它參數(例如溫度、脫酰產物或側鏈濃度等)，考慮到這些參數對反應速率和/或平衡的影響。
可在脫酰之前和/或脫酰過程中添加另外的穩定劑，例如亞硫酸根(S2O52-、HSO3-、SO32-)、EDTA、二硫蘇糖醇(dithiotreitol)(DTT)。
通常，接著應用任意合適的步驟組合回收通式(Ⅰ)的脫酰頭孢菌素化合物。任選可采取濃縮步驟，通過例如真空蒸發、反滲透、超微過濾或者結晶前的narofiltration。任選可添加水混溶性溶劑。任選地，在結晶前可通過用活性炭或吸附樹脂處理而純化溶液。任選地，在結晶前可除去側鏈，其特征在于，酸化水相，將側鏈萃取到萃取有機溶劑并分離這兩相。萃取有機溶劑可選自乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、環己酮、異丁醇、正丁醇等。
可用數種方法從形成的水相結晶產品。最優選的操作方法是中和水溶液，接著應用一種或多種已知的酸(例如H2SO4、HCl、HNO3或其組合)分1～6步降低pH至pH3～5。這優選應用1～6個互連的一組連續操作的結晶器(按順序)以連續方式進行。也可采取分批結晶、半連續結晶或協調結晶。可以按與上述相同的方法直接進行結晶而不需首先中和。按本發明的一個實施方案，發現了可添加水混溶性溶劑(例如甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮等)而改善式(Ⅱ)的頭孢菌素的質量。任選地，在結晶前可通過用活性炭或用吸附樹脂處理而改善式(Ⅱ)化合物的質量。
已發現了，任選在用吸附樹脂、活性炭和/或乙醇和/或乙酸酯處理后，可通過重結晶進一步改善式(Ⅱ)的頭孢菌素的質量。該處理的特征在于，在0.5～10.0范圍內(優選在7.5～8.5之間)的pH下溶解式(Ⅱ)的頭孢菌素，再使產物結晶。可以按數種方式使產物結晶。最優選的操作方法是應用一種或多種已知的酸(例如H2SO4、HCl、HNO3或其組合)分1～6步降低pH至pH3～5。這可應用1～6個互連的一組連續操作的結晶器(按順序)以連續方式進行。也可采取分批結晶、半連續結晶或協調結晶。按本發明的一個實施方案，發現了可添加水混溶性溶劑(例如甲醇、乙醇、(異)丙醇、丙酮、異丁醇和正丁醇)而改善式(Ⅱ)的頭孢菌素的質量。
還發現了，可通過用吸附劑處理轉化液和/或溶解的式(Ⅱ)頭孢菌素的溶液而改善式(Ⅱ)的頭孢菌素的質量。吸附劑包括活性炭，例如Norit Ultra SX；或者吸附樹脂，例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，諸如得自Mitsubishi Kasei Corporation的Dianion HP 20(CASNo.55353-13-4)、Dianion HP 21(CAS No.92529-04-9)或Dianion SP207(CAS No.98225-81-1)或者得自Rohm and Haas的Amberlite XAD1180(CAS No.97396-56-0)、Amberlite XAD 1600(CAS No.153796-66-8)或Amberlite XAD 16(CAS No.102419-63-8)或者得自TosoHaas的Amberchrom CG 161(CAS No.131688-63-6)；優選為XAD 16，XAD 1600或HP20。
晶體是通過過濾或離心分離的，再在常規連續式干燥機或分批干燥機中干燥。可通過任意類別的磨(例如球磨、射流磨等)研磨晶體。
任選可在結晶過程中添加水混溶性溶劑。溶解后，可用活性炭或吸附樹脂處理溶液。
該操作將比前述目前已知的方法給出更好的總產率和產品質量。
按本發明的另一方面，提供了一種從轉化液或母液(結晶式(Ⅱ)的化合物后獲得的液體)除去和回收己二酸的方法。發現了，應用膜式過濾在低pH(例如低于pH5、優選低于pH4、更優選低于pH3，處于pH3或接近pH3)時可以有利地分離己二酸。按本發明優選的是這一實施方案其中，通過反滲透進行過濾。
除了節省原料外，這樣做的優點還在于這樣處理的溶液結晶時的純度和/或產率。
通過如下非限制性的實施例闡述了本發明。實驗如1993年3月18日公開的國際專利申請WO 93/05158中描述的那樣，通過對用得自帶小棒鏈霉菌的擴展酶(去乙酸基頭孢菌素C合成酶)轉化的產黃青霉菌株發酵而獲得了一種作為復雜混合物的發酵液，它包含己二酰-7-ADCA，尤其包含作為不希望有的污染物的6-APA、己二酰-6-APA和α-氨基-己二酰-7-頭孢霉烷酸。
按WO 93/05158(并入本文作參考)的實施例1中描述的那樣培養所述轉化的青霉屬菌株。
發酵5～7天后，將發酵液用于回收實驗。
還可通過配制下列化合物的水混合物而模擬該復雜混合物6-氨基青霉烷酸、己二酰-6-氨基青霉烷酸、α-氨基己二酰-6-氨基青霉烷酸、己二酰-7-氨基去乙酸基頭孢霉烷酸和α-氨基己二酰-7-頭孢霉烷酸。
實施例1pH/熱-處理該實施例顯示了pH處理(優選將pH處理與升溫處理結合)對于從復雜混合物除去不希望有的β-內酰胺組分的優點。
將得自產黃青霉發酵的發酵液(見實驗部分)過濾，所述發酵液包含己二酰-7-ADCA和青霉烷酸和頭孢霉烷酸這些污染物的復雜混合物。應用生產用水洗滌該濃縮液直至合并的濾液總體積約為初始發酵液體積的2倍。進行了下列實驗A．將部分濾液酸化到pH=3.5；加熱到70℃，30分鐘后冷卻到40℃；B．將部分滲透液酸化到pH=2.7；加熱到110℃，4分鐘后冷卻到25℃；或者C．將部分滲透液酸化到pH=3.0并且未進一步處理。
將該預處理后的溶液進行如下處理而獲得式(Ⅱ)的化合物；7-ADCA。吸附色譜法在Seitz K100濾器上過濾三份溶液(A～C)，然后將pH為3.0的溶液泵送到填充了1.6升XAD-1600樹脂的柱上；接著用4.8升水洗滌樹脂，用0.2M碳酸氫鹽溶液洗脫。取出第一次洗出液級分(1.1升)而棄去。收集第二次級分(3.2升)并分析。通過用苛性鈉和丙酮洗滌而純化樹脂，再次用酸化的水調節。濃縮在20～30℃真空(5～10mm Hg)下濃縮洗出液直至獲得每升40克己二酰-7-ADCA的濃度。酶促脫酰接著，用酰基轉移酶按下述方法處理該己二酰-7-ADCA。往1升洗出液中添加1克焦亞硫酸鈉、20mM EDTA和100g固定化酰基轉移酶(包括假單胞菌屬SE83二羧化酰基轉移酶)。在30℃下將溶液攪拌兩小時。用4N氫氧化鈉將pH保持在8.5。應用玻璃燒結的濾器分離所述固定化酰基轉移酶和液體。7-ADCA的結晶在攪拌下、在30℃的溫度下降低pH至3.6而使7-氨基去乙酸基頭孢霉烷酸(7-ADCA)沉淀；在45分鐘內，用6N硫酸使溶液的pH降低至3.6。冷卻到20℃后，在玻璃燒結的濾器上分離晶體，用水洗滌，在35℃下干燥。溶解7-ADCA晶體借助于氨溶解7-ADCA。為此，將15克7-ADCA懸浮于255ml水中。借助于4N氫氧化銨在7.5～8.5的pH下溶解7-ADCA。在玻璃燒結的濾器上過濾后，添加水而得300ml溶液。用吸附樹脂處理用吸附樹脂處理了該溶液。在45分鐘內，將該溶液泵送到15ml的XAD1600上。接著，將75ml水泵送到該樹脂上而獲得375ml溶液。重結晶在攪拌下、在30℃的溫度下降低pH至3.6而使7-ADCA沉淀；在45分鐘內，用6N硫酸使pH降低至3.6。冷卻到20℃后，在玻璃燒結的濾器上分離晶體，用水洗滌，在35℃下干燥。
從6-APA減少來看，這樣生產的7-ADCA表現出良好的結果。(6-APA比值是相對于7-ADCA求算的)。
表1a.實驗1A、1B和1C的結果
顯然，所述pH/溫度處理減小了污染己二酰-7-ADCA制劑的6-氨基青霉烷酸的含量。
就恒定減少10-6的6-氨基青霉烷酸而測定了處理的pH、溫度和時間之間的相互關系(表1b)。表1b
實施例2吸附色譜法該實施例顯示了(a)當應用吸附色譜法時，柱的載荷度(2A～2D)、(b)在洗脫前用不同量的水洗滌柱(2E～2G)、(c)物料的pH對己二酰-7-ADCA的純化的效果(2H～2J)。以模擬移動床方式進行吸附色譜處理的該實施方案作為“實驗2K”給出。
按實施例1A中描述的那樣預處理發酵液。接著，通過吸附色譜法純化己二酰-7-氨基-去乙酸基頭孢霉烷酸將溶液泵送到裝填了1.6升XAD-1600樹脂的柱上，用不同量的水洗滌(2A～2D和2H～2K4.8升；2E～2F見表2b)，用0.2M碳酸氫鹽溶液洗脫。取出第一次洗出液級分(1.1升)后棄去。收集第二次級分(3.2升)并分析。通過用苛性鈉和丙酮洗滌而純化樹脂，再次用酸化的水調節。應用了數個處理條件的變量(見表2)。減少量按這樣計算(化合物-i物料/化合物-1物料)/(化合物-i洗出液/化合物-1洗出液)。
這些結果清楚地表明將柱過載對洗出液中化合物2和3的減少的正性效果。
實施例2b表明了在用碳酸氫鈉洗脫前持續洗滌對減少不希望有的頭孢菌素化合物的正性效果。表2c
如上實施例表明了在進行結晶時pH對減少不希望有的7-N酰化頭孢菌素化合物的效果。H2SO4被用作酸。
該實施例闡釋了按所謂的模擬移動床技術在千克規模上進行的吸附色譜法的應用。該技術可以輕易地進一步放大。
如實施例1中描述的那樣，用酰基轉移酶處理這樣處理過的級分2A～2K而生產7-ADCA。獲得了優異的轉化結果，如實施例3中所述。
實施例3酶促轉化該實施例闡述了酶促轉化己二酰-7-ADCA至7-ADCA的結果。己二酰-7-ADCA是按實施例2K中公開的那樣回收的(按實施例1A進行pH-處理，通過過載和洗滌將吸附色譜處理最佳化)。按實施例1中描述的那樣、在表3中所示pH下進行轉化。實施例A～E代表不同批次。
當應用pH/溫度步驟預處理己二酰-7-ADCA時，與未處理相比，轉化率和產率都更優。應用色譜法進一步純化導致純度的進一步改善(表中未示出)。
實施例4粗結晶將發酵液進行pH/熱-處理(實施例1)，再通過如實施例2中描述的吸附色譜法富集己二酰-7-ADCA。接著，如實施例1中描述的那樣進行轉化。
用反滲透法濃縮轉化液(脫酰后獲得的溶液)而增大濃度。
取出一部分溶液，通過降低pH至pH 3.6、4或5使7-ADCA結晶(見表4a)。表4a.粗結晶
在全部測試的pH下的結晶都令人滿意。在如下實驗中，pH為3.6。闡釋了濃縮溶液的效果。
顯然，轉化液中7-ADCA的濃度對結晶后的純度和產率都有影響。
如下實施例闡釋了不同吸附劑對產品質量(溶液中的顏色和透明度)的影響。
實施例5溶解的7-氨基去乙酸基頭孢霉烷酸的處理該實施例顯示了在結晶前用不同的吸附樹脂處理7-ADCA溶液后對7-ADCA的透明度和顏色的影響。按實施例2K中公開的方法制備了含7-ADCA的溶液(應用的吸附色譜柱是XAD-1600樹脂)。
實施例6用正丁醇萃取回收己二酰-7-ADCA按實施例1中描述的那樣處理包含己二酰-7-ADCA的發酵液。
酸化后，通過吸附色譜法純化一部分己二酰-ADCA。將該溶液泵送到填充了XAD-16樹脂的柱上，用水洗滌，用0.2M乙酸鹽溶液洗脫。取出含低含量的己二酰去乙酸基頭孢霉烷酸的第一次洗出液級分后棄去。收集第二次級分。通過用苛性鈉和丙酮洗滌而純化樹脂，再次用酸化的水調節。
這樣純化一部分己二酰-7-ADCA萃取，接著洗滌萃取液，從有機相將N-取代頭孢菌素反萃取到水相，再反萃取水相；萃取有機溶劑是正丁醇。
用固定化酰基轉移酶處理己二酰-7-ADCA而生產7-氨基去乙酸基頭孢霉烷酸(7-ADCA)。通過降低pH而分離一部分7-ADCA。借助于苛性鈉溶解己二酰去乙酸基頭孢霉烷酸。通過降低pH而分離7-氨基去乙酸基頭孢霉烷酸。
酸化一部分7-氨基去乙酸基頭孢霉烷酸水溶液，將所述側鏈萃取到萃取有機溶劑中，再進行相分離；萃取有機溶劑是正丁醇。
最后，過濾晶體塊，洗滌后干燥。
表中未給出采用單獨萃取的結果，但純度比采用色譜處理時(即使未重結晶)差得多。將色譜處理與重結晶組合或者將色譜處理與萃取組合產生最好的結果。
實施例7從7-ADCA結晶母液回收己二酸
7-ADCA結晶母液是按實施例4中描述的那樣獲得的。應用HPLC測定己二酸Aminex HPX-87H柱，300mm×7.8mm，填充了9um陽離子凝膠(Biorad)，在65℃下用0.2M H2SO4水溶液洗脫，應用RI Waters 410折光計測定。在下文給出的實施例中，最優化旨在純度，而不是產率。
實施例7A采用酸化回收己二酸在20℃下，用12M H2SO4水溶液將7-ADCA結晶母液(250ml，13.6g/l己二酸)的pH降到0.7。在0℃下16h后，未能檢測出結晶。應用6M KOH水溶液使pH升高到3.4。通過過濾回收形成的晶體而給出7.7g物質(它是鹽和己二酸的混合物，未對它進一步分析)。
實施例7B采取酸化和濃縮回收己二酸在20℃下，用12M H2SO4水溶液將7-ADCA結晶母液(500ml，9.4g/l己二酸)的pH降到1.5，接著在40℃減壓下濃縮而給出一種粘性混合物，通過過濾分離該混合物，干燥后給出6.9g己二酸，純度為53％(產率為78％)。
實施例7C應用Nanomax 50膜的反滲透作用回收己二酸在20℃下，用6M KOH水溶液或12M H2SO4水溶液將7-ADCA結晶母液(500ml，9.4～18.2g/l己二酸，見袁)的pH調節到表中提到的值。應用得自Millipore的Nanomax 50膜將形成的溶液進行反滲透。借助于氮氣，施加30巴的壓力而得到濾液和滯留物，其中，采用HPLC測定己二酸的量。在大多數情況下，應用一種處理程序，它包括在減壓下濃縮直至結晶，接著過濾產物并干燥。
實施例7D應用DK U19F膜的反滲透作用在pH 2.0下回收己二酸用2.91的12M H2SO4水溶液將7-ADCA結晶母液(100 l，含25.0g/l己二酸)的pH降到2.0。用57 l水、應用DK U19F膜在2.5m2得自Hydro Air Research的膜式過濾裝置P2-B200中將形成的溶液進行反滲透。在30巴的壓力下，達到8.8 l/m2/h的平均流量，給出表中歸納的結果。
權利要求
1．一種從除通式(Ⅰ)化合物外還含有6-氨基青霉烷酸(6-APA)和任選一種或多種N-取代β-內酰胺化合物的復雜混合物中回收通式(Ⅰ)的N-取代頭孢霉烷酸化合物的方法 其中，●R0是氫或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是選自下組的任一個基-氫，-羥基，-鹵素，-飽和的或不飽和的、直鏈的或支化的烷基(1～5個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基、鹵素、芳基、烷氧基(1～3個碳原子)或酰基取代；-烷氧基(1～3個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基或鹵素取代；或者-任選被羥基、鹵素、氨基取代的環烷基(3～8個碳原子)；-芳基；-雜芳基；以及●R2選自己二酰(1，4-二羧基丁烷)、丁二酰、戊二酰、己二酰、庚二酰、辛二酰、2-(羧基乙硫基)乙酰、3-(羧基乙硫基)丙酰、高級烷基飽和的和高級烷基不飽和的二羧酸，該方法包括如下步驟(a)酸化所述復雜混合物至低于6.5的pH并將低于所述pH的混合物保持在10℃和150℃之間的溫度；和/或(b)將所述復雜混合物與二氧化碳源接觸；以及(c)從步驟(a)和/或(b)之后獲得的混合物回收式(Ⅰ)的頭孢霉烷酸化合物。
2．權利要求1的方法，其中，在步驟(a)中將溫度保持在約50℃和約130℃之間、優選在70和120℃之間達10秒～約1天，而pH則被保持在pH4.5或低于pH4.5。
3．權利要求1或2的方法，其中，所述化合物已通過能生產該化合物的微生物的發酵生產了，并且其中，所述復雜混合物是發酵液、培養物濾液或可得自發酵后的發酵液的任何培養液。
4．權利要求1～3任一項的方法，其中，所述通式化合物選自己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ADAC和己二酰-7-ACA。
5．前述權利要求任一項的方法，其中，這樣進行步驟(c)將步驟(a)和/或(b)之后獲得的混合物進行色譜法處理。
6．權利要求5的方法，其中，所述色譜法是吸附色譜法，更優選是疏水相互作用色譜法。
7．色譜法在回收權利要求1中式(Ⅰ)的N-取代頭孢菌素化合物的過程中的應用。
8．權利要求7的應用，其中，所述色譜法是吸附色譜法，優選是疏水相互作用色譜法。
9．權利要求8的應用，其中，所述色譜法是應用模擬移動床技術進行的。
10．一種制備式(Ⅱ)化合物的方法 其中，●R0是氫或C1-3烷氧基；●Y是CH2、氧、硫或硫的氧化形式；●R1是選自下組的任一個基-氫，-羥基，-鹵素，-飽和的或不飽和的、直鏈的或支化的烷基(1～5個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基、鹵素、芳基、烷氧基(1～3個碳原子)或酰基取代；-烷氧基(1～3個碳原子；任選被一個或多個雜原子替代)，任選被羥基或鹵素取代；或者-任選被羥基、鹵素、氨基取代的環烷基(3～8個碳原子)；-芳基；-雜芳基，該方法包括如下步驟應用權利要求1～6任一項的方法制備式(Ⅰ)的化合物；使式(Ⅰ)的化合物脫酰而獲得包含式(Ⅱ)化合物的轉化液。
11．權利要求10的方法，其中，所述轉化液進一步包含以R2表示的分裂側鏈。
12．權利要求10的方法，其中，所述脫酰是應用二羧基酰基轉移酶酶促進行的。
13．權利要求10～12任一項的方法，它包括該進一步的步驟通過結晶從所述溶液回收式(Ⅱ)的化合物。
14．權利要求13的方法，其中，在所述結晶以前用選自下列的作用劑處理溶液吸附樹脂、活性炭、甲醇、乙醇、(異)丙醇、異丁醇、正丁醇、丙酮或者任意上述作用劑的組合物。
15．權利要求14的方法，其中，應用了至少一種選自下列的吸附樹脂XAD16、XAD1600和HP20。
16．權利要求10或11的方法，其中，6-氨基青霉烷酸(6-APA)含量相對于式(Ⅱ)化合物為10 ppm或更少。
17．權利要求11或12的方法，其中，在脫酰之后處理溶液而至少部分地除去由R2表示的分裂側鏈。
18．權利要求17的方法，其中，至少部分地除去分裂側鏈的處理是對結晶后獲得的母液進行的。
19．權利要求18的方法，其中，所述至少部分地除去分裂側鏈的處理之后接著進行粗晶體的加溶和式(Ⅱ)化合物的重結晶。
20．權利要求18的方法，其中，在結晶之前用選自下列的作用劑處理溶液吸附樹脂、活性炭、甲醇、乙醇、(異)丙醇、異丁醇、正丁醇和丙酮或者上述這些作用劑任意的組合。
21．權利要求17～20任一項的方法，其中，所述處理包括將轉化液或母液在低于5的pH、優選低于4的pH、更優選接近或低于3的pH下進行膜式過濾。
22．膜式過濾在從包含二羧酸和β-內酰胺抗生素的混合物中除去二羧酸方面的應用。
23．權利要求22的應用，其中，所述混合物是結晶式(Ⅱ)的化合物后獲得的母液。
24．權利要求22或23的應用，其中，所述過濾是在大約5或更低的pH、優選在pH 4或更低pH下進行的。
25．權利要求22～24的應用，其中，所述過濾是在pH3或低于pH3時通過narofiltration進行的。
全文摘要
一種從除通式(Ⅰ)的化合物外還含有6－氨基青霉烷酸(6－APA)和任選一種或多種N－取代青霉烷酸化合物的復雜混合物回收通式(Ⅰ)的N－取代頭孢霉烷酸化合物的方法,其中,R
文檔編號C07D463/20GK1295575SQ99804550
公開日2001年5月16日 申請日期1999年3月26日 優先權日1998年3月27日
發明者I·A·L·A·伯閣斯, E·J·A·X·范德桑迪特, D·斯切皮爾 申請人:Dsm公司